Khóa luận: Nhân nhanh in vitro cây đinh lăng lá nhỏ - Đại học Nông lâm Thái Nguyên

Luận văn thạc sĩ phân tích nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình nhân nhanh in, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Nguyễn Thị Thùy Dương
• Người hướng dẫn: ThS. Vũ Hoài Sâm
• Trường học: Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình nhân nhanh in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fructicosa (L.) Harms)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
• 1.1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.1.2. Yêu cầu của đề tài
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 1.2.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.2.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu về chi Đinh lăng
• 2.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố
• 2.1.2. Vị trí phân loại
• 2.1.3. Các loài thuộc chi Polyscias có ở Việt Nam
• 2.2. Giới thiệu về cây Đinh lăng lá nhỏ
• 2.2.1. Mô tả
• 2.2.2. Phân bố, sinh thái
• 2.2.3. Bộ phận sử dụng
• 2.2.4. Thành phần hóa học
• 2.2.5. Tác dụng dược lý
• 2.2.6. Tính vị và công dụng
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 3.1.1. Phạm vi nghiên cứu
• 3.1.2. Địa điểm và thời gian tiến hành
• 3.1.3. Thời gian nghiên cứu
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh in vitro Đinh lăng lá nhỏ
• 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh in vitro Đinh lăng lá nhỏ
• 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo cây Đinh lăng lá nhỏ hoàn chỉnh
• 3.2.4. Đánh giá hiệu quả các công thức tạo rễ in vitro đến tỷ lệ sống của cây khi đưa ra điều kiện ex vitro
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương pháp tạo mẫu vô trùng
• 3.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 3.3.3. Phương pháp tiến hành thí nghiệm
• 3.3.4. Phương pháp đánh giá
• 3.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh in vitro Đinh lăng lá nhỏ
• 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh in vitro Đinh lăng lá nhỏ
• 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh in vitro Đinh lăng lá nhỏ
• 4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kinetin đến khả năng nhân nhanh in vitro Đinh lăng lá nhỏ
• 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng nhân nhanh in vitro Đinh lăng lá nhỏ
• 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh in vitro Đinh lăng lá nhỏ
• 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo cây Đinh lăng lá nhỏ hoàn chỉnh
• 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo cây Đinh lăng lá nhỏ hoàn chỉnh
• 4.9. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh
• 4.10. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp IBA và kinetin đến khả năng tạo cây Đinh lăng lá nhỏ hoàn chỉnh
• 4.11. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp IBA và BAP đến khả năng tạo cây Đinh lăng lá nhỏ hoàn chỉnh
• 4.12. Kết quả đánh giá hiệu quả các công thức tạo rễ in vitro đến tỷ lệ sống của cây khi đưa ra điều kiện ex vitro
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nhân nhanh in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fructicosa (L.) Harms). Cây đinh lăng là một loại cây thuốc quý, có giá trị kinh tế cao và được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền. Việc nhân giống cây này bằng phương pháp in vitro không chỉ giúp tăng cường sản lượng mà còn đảm bảo tính đồng nhất về mặt di truyền. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu xác định các hormone thực vật phù hợp để tối ưu hóa quy trình nhân giống, từ đó đáp ứng nhu cầu ngày càng cao về giống cây đinh lăng trên thị trường.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là xác định ảnh hưởng của nồng độ BAP và các chất kích thích sinh trưởng khác đến khả năng tái sinh và nhân nhanh cây đinh lăng. Nghiên cứu sẽ đánh giá hiệu quả của các công thức nuôi cấy khác nhau, từ đó tìm ra phương pháp tối ưu nhất cho việc nhân giống cây đinh lăng lá nhỏ. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển quy trình nhân giống in vitro, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng giống cây.

II. Tổng quan về cây đinh lăng

Cây đinh lăng (Polyscias fructicosa) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) và được biết đến với nhiều công dụng dược lý. Cây có khả năng sinh trưởng tốt trong điều kiện khí hậu Việt Nam và thường được trồng để lấy rễ làm thuốc. Rễ cây chứa nhiều saponin, có tác dụng tăng lực, chống ung thư và chống oxy hóa. Việc nghiên cứu sinh học thực vật và kỹ thuật nuôi cây mô là rất cần thiết để phát triển quy trình nhân giống hiệu quả cho cây đinh lăng. Nghiên cứu này sẽ cung cấp thông tin về thành phần hóa học, công dụng và tiềm năng phát triển của cây đinh lăng trong ngành dược liệu.

2.1. Thành phần hóa học và công dụng

Cây đinh lăng chứa nhiều hợp chất có giá trị như saponin, alcaloid và các vitamin. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng rễ cây có tác dụng tăng cường sức khỏe, hỗ trợ điều trị một số bệnh lý và cải thiện chức năng sinh lý. Việc hiểu rõ về thành phần hóa học của cây sẽ giúp tối ưu hóa quy trình chiết xuất và ứng dụng trong y học. Nghiên cứu này không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn trong việc phát triển sản phẩm từ cây đinh lăng.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các thí nghiệm in vitro, trong đó các mẫu cây đinh lăng được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như BAP, NAA và IBA. Các thí nghiệm sẽ được thiết kế để đánh giá khả năng tái sinh chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ. Kết quả sẽ được phân tích thống kê để xác định nồng độ tối ưu của các hormone, từ đó xây dựng quy trình nhân giống hiệu quả cho cây đinh lăng. Phương pháp này không chỉ giúp nâng cao tỷ lệ sống của cây mà còn đảm bảo chất lượng giống cây.

3.1. Thiết kế thí nghiệm

Thí nghiệm sẽ được bố trí theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên với các công thức khác nhau về nồng độ BAP và các hormone khác. Mỗi công thức sẽ được lặp lại nhiều lần để đảm bảo tính chính xác của kết quả. Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm tỷ lệ tái sinh chồi, số lượng chồi và tỷ lệ sống của cây sau khi đưa ra điều kiện ex vitro. Phân tích số liệu sẽ được thực hiện bằng các phương pháp thống kê phù hợp để rút ra kết luận chính xác về ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nhân nhanh cây đinh lăng.

IV. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ BAP có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tái sinh và nhân nhanh cây đinh lăng. Các công thức có bổ sung BAP với nồng độ tối ưu đã cho tỷ lệ tái sinh chồi cao hơn so với các công thức đối chứng. Ngoài ra, sự kết hợp giữa BAP và IBA cũng cho thấy hiệu quả tích cực trong việc tạo rễ cho cây. Kết quả này khẳng định vai trò quan trọng của chất điều hòa sinh trưởng trong quy trình nhân giống in vitro cây đinh lăng, mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất giống cây chất lượng cao.

4.1. Đánh giá hiệu quả các công thức

Các công thức nuôi cấy khác nhau đã được đánh giá dựa trên tỷ lệ sống và khả năng phát triển của cây. Kết quả cho thấy rằng các công thức có bổ sung hormone sinh trưởng không chỉ giúp tăng tỷ lệ tái sinh mà còn cải thiện chất lượng cây giống. Việc áp dụng các công thức này trong sản xuất thực tế sẽ giúp nâng cao năng suất và chất lượng giống cây đinh lăng, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.

V. Kết luận và đề xuất

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng là rất cần thiết để tối ưu hóa quy trình nhân nhanh in vitro cây đinh lăng lá nhỏ. Kết quả nghiên cứu không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn trong việc phát triển giống cây chất lượng cao. Đề xuất tiếp theo là mở rộng nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố môi trường khác đến quá trình nuôi cấy, từ đó hoàn thiện quy trình nhân giống cây đinh lăng.

5.1. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường như ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm đến quá trình nuôi cấy in vitro cây đinh lăng. Bên cạnh đó, việc nghiên cứu các chất điều hòa sinh trưởng mới có thể mở ra hướng đi mới cho việc tối ưu hóa quy trình nhân giống, góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất giống cây dược liệu có giá trị.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms), thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), là cây dược liệu quý được sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền Việt Nam. Rễ củ Đinh lăng chứa hàm lượng cao saponin triterpenoid, polyacetylen, vitamin và các acid amin thiết yếu, có tác dụng tăng lực, chống trầm cảm, chống oxy hóa và bồi bổ cơ thể. Trước nhu cầu thị trường ngày càng lớn về nguồn nguyên liệu đạt chuẩn cho ngành dược phẩm (tiêu biểu như việc phát triển vùng nguyên liệu theo chuẩn GACP-WHO của Công ty Cổ phần Traphaco tại huyện Hải Hậu, Nam Định), nguồn cung cây giống chất lượng cao trở thành một yêu cầu cấp thiết.

Phương pháp nhân giống truyền thống bằng giâm cành bộc lộ nhiều hạn chế: hệ số nhân giống thấp, chất lượng cây giống không đồng đều và tiềm ẩn mầm bệnh. Đặc biệt, cây giâm cành trong 2–3 năm đầu chỉ phát triển hệ rễ chùm; rễ cọc chỉ xuất hiện muộn từ phần gốc của chồi tái sinh, dẫn đến chu kỳ canh tác kéo dài từ 7–10 năm mới thu hoạch được rễ củ thương phẩm, làm tăng chi phí chăm sóc. Việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (in vitro) cho phép tạo ra nguồn giống sạch bệnh, đồng nhất di truyền với số lượng lớn, đồng thời hình thành bộ rễ có khả năng phát triển thành rễ củ ngay từ giai đoạn đầu, rút ngắn thời gian canh tác.

Mục tiêu của đề tài: Xác định ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình tái sinh, nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh in vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms).

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP (6-Benzylaminopurine) đến khả năng tái sinh chồi in vitro từ mẫu ban đầu.
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (BAP, Kinetin đơn lẻ và các tổ hợp BAP + IBA, BAP + NAA) đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro.
3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (NAA, IBA đơn lẻ và các tổ hợp IBA + Kinetin, IBA + BAP) đến khả năng tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh.
4. Đánh giá tỷ lệ sống của cây giống in vitro khi chuyển ra giá thể thích nghi ở điều kiện vườn ươm (ex vitro).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Ngọn chồi và đốt thân dài 1,0–1,5 cm thu thập từ cây mẹ Đinh lăng lá nhỏ 4 năm tuổi trồng tại Trung tâm Nghiên cứu Trồng và Chế biến cây thuốc Hà Nội – Viện Dược liệu.
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Bộ môn Giống và Công nghệ sinh học, Trung tâm Nghiên cứu Trồng và Chế biến cây thuốc Hà Nội – Viện Dược liệu.
• Thời gian thực hiện: Từ tháng 12/2014 đến tháng 05/2015.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

Nghiên cứu dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào thực vật (totipotency), khả năng phân hóa và phản phân hóa của mô tế bào trong môi trường nhân tạo vô trùng. Quá trình phát sinh hình thái cơ quan (tạo chồi, nhân cụm chồi và tạo rễ) được điều hòa thông qua sự cân bằng tỷ lệ giữa nhóm Cytokinin (kích thích phân chia tế bào và bật chồi bên: BAP, Kinetin) và nhóm Auxin (kích thích phân chia tế bào trụ bì hình thành rễ: NAA, IBA).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Khử trùng tạo mẫu sạch: Mẫu chồi và đốt thân tự nhiên được rửa sạch bằng xà phòng loãng, xử lý thuốc diệt nấm, tráng nước cất vô trùng; sau đó khử trùng trong tủ cấy bằng dung dịch $HgCl_2$ 0,07% trong thời gian 10 phút, rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng và cấy khởi động trên môi trường MS không chất kích thích sinh trưởng trong 2 tuần.
• Môi trường dinh dưỡng cơ bản: Môi trường Murashige & Skoog (MS, 1962) bổ sung 30 g/l saccharose và 5,8 g/l agar; pH được chỉnh về mức 5,8–6,0 trước khi hấp khử trùng ở 121°C, áp suất 1,1 atm trong 25 phút.
• Điều kiện nuôi cấy phòng sáng: Nhiệt độ phòng nuôi duy trì 25°C ± 2°C, độ ẩm 70%, cường độ ánh sáng 2000 lux với chế độ chiếu sáng 14 giờ sáng / 10 giờ tối.
• Bố trí thí nghiệm: Thiết kế thí nghiệm theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại gồm 15 mẫu cấy.
• Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ tái sinh chồi (%), tỷ lệ tạo cụm chồi (%), số chồi/mẫu (chồi), chiều cao chồi (cm), số lá/chồi, tỷ lệ ra rễ (%), số rễ/cây, chiều dài rễ (cm) và tỷ lệ sống ex vitro (%).
• Xử lý số liệu: Thu thập dữ liệu trên phần mềm Microsoft Excel và xử lý thống kê phân tích phương sai, so sánh sai khác trung bình theo trắc nghiệm LSD ở mức ý nghĩa $p = 0,05$ bằng phần mềm IRRISTAT 4.0; đánh giá độ biến động thông qua hệ số biến thiên (CV%).

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Trình bày cơ sở khoa học và thực tiễn của việc nhân giống in vitro cây Đinh lăng lá nhỏ nhằm cung cấp cây giống đồng đều, sạch bệnh và có rễ củ sớm cho ngành sản xuất dược liệu. Xác định rõ mục tiêu, 4 yêu cầu nhiệm vụ, phạm vi cùng ý nghĩa khoa học và giá trị ứng dụng thực tiễn của đề tài.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

• Đặc điểm thực vật và dược lý: Tổng quan vị trí phân loại của chi Polyscias (Araliaceae), phân biệt 4 loài chính tại Việt Nam (P. fruticosa, P. balfouriana, P. filicifolia, P. guilfoylei). Phân tích cấu trúc giải phẫu của Đinh lăng lá nhỏ, các hợp chất polyacetylen (panaxynol, panoxydol, các dẫn xuất heptadeca) và saponin triterpen dạng acid oleanolic; tổng hợp các tác dụng dược lý đã được kiểm chứng (tăng lực, an thần, bảo vệ gan, ức chế enzyme MAO, điều hòa miễn dịch, kích thích co bóp tử cung).
• Thực tiễn sản xuất: Nêu dẫn chứng về vùng trồng nguyên liệu Đinh lăng theo tiêu chuẩn GACP-WHO tại Hải Hậu (Nam Định) với quy mô hơn 457 ha, cung cấp hơn 1.000 tấn dược liệu tươi/năm cho Công ty Dược phẩm Traphaco sản xuất thuốc Cebraton, mang lại lợi nhuận 19–21 triệu đồng/sào/năm (tương đương 520–580 triệu đồng/ha/năm).
• Cơ sở vi nhân giống và tổng quan nghiên cứu: Tổng quan các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật, vai trò của các khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon và các nhóm chất điều hòa sinh trưởng (Auxin, Cytokinin, GA3). Điểm luận các công bố nghiên cứu in vitro Đinh lăng của Salwa S. (2014, Ai Cập), Vũ Hoài Sâm (2005), Hà Thị Bích Hồng (2013), Lê Thị Như Thảo (2014) và Phạm Văn Lộc (2014).

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày quy chuẩn lấy mẫu vật liệu từ cây mẹ 4 năm tuổi; chi tiết quy trình khử trùng bằng $HgCl_2$ 0,07% trong 10 phút. Thiết lập hệ thống 10 thí nghiệm cụ thể thuộc 4 nội dung nghiên cứu:

• Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ BAP (0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 mg/l) ở giai đoạn tái sinh chồi (30 ngày).
• Thí nghiệm 2 & 3: Khảo sát BAP đơn lẻ và Kinetin đơn lẻ (0–3,0 mg/l) ở giai đoạn nhân nhanh (30 ngày).
• Thí nghiệm 4 & 5: Khảo sát tổ hợp BAP (2,5 mg/l) kết hợp IBA (0–1,0 mg/l) hoặc NAA (0–1,0 mg/l) ở giai đoạn nhân nhanh (45 ngày).
• Thí nghiệm 6, 7, 8 & 9: Khảo sát đơn lẻ NAA, IBA (0–2,5 mg/l) và tổ hợp IBA (1,0 mg/l) kết hợp Kinetin hoặc BAP (0–1,0 mg/l) ở giai đoạn tạo rễ (30–45 ngày).
• Thí nghiệm 10: Đánh giá tỷ lệ sống của cây con tiêu chuẩn (cao 2,5–3,0 cm, 6–8 lá, 7–10 rễ trắng) trên giá thể cát sạch vô trùng, sau 2 tuần chuyển sang hỗn hợp đất : trấu : phân vi sinh (tỷ lệ 6:3:1).

Phần 4: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương này công bố chi tiết số liệu thực nghiệm qua các bảng biểu thống kê:

1. Giai đoạn tái sinh chồi in vitro (30 ngày theo dõi)

Bổ sung BAP kích thích rõ rệt sự tái sinh và phân hóa chồi so với đối chứng không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng.

Công thức	Nồng độ BAP (mg/l)	Tỷ lệ tái sinh chồi (%)	Số chồi / mẫu (chồi)	Chiều cao chồi (cm)	Số lá / chồi (lá)	Trạng thái chồi
CT1 (ĐC)	0,0	68,89 d	0,69 d	1,21	1,29	++
CT2	1,0	75,55 c	0,93 c	1,84	1,82	+++
CT3	1,5	86,67 b	1,02 b	2,15	2,29	+++
CT4	2,0	93,33 a	1,33 a	2,56	2,64	+++
CT5	2,5	95,55 a	1,07 b	2,39	2,58	+++
CT6	3,0	97,78 a	0,98 b	1,78	2,31	++
LSD 0.05		5,72	0,11
CV%		3,60	6,40

Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$). Trạng thái chồi: +++ (tốt, mập, xanh thẫm), ++ (trung bình), + (kém).

Nồng độ BAP 2,0 mg/l (CT4) cho số chồi/mẫu cao nhất (1,33 chồi/mẫu), chồi sinh trưởng khỏe, mập và có chiều cao trung bình đạt 2,56 cm. Nồng độ BAP 3,0 mg/l tuy cho tỷ lệ tái sinh đạt 97,78% nhưng số chồi/mẫu giảm còn 0,98 do hiện tượng ức chế ở nồng độ cao.

2. Giai đoạn nhân nhanh chồi in vitro (30 ngày theo dõi)

So sánh tác động của hai loại Cytokinin đơn lẻ (BAP và Kinetin):

Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh:

Công thức	Nồng độ BAP (mg/l)	Tỷ lệ tạo cụm chồi (%)	Số chồi / mẫu (chồi)	Chiều cao chồi (cm)	Số lá / chồi (lá)	Trạng thái chồi
CT1 (ĐC)	0,0	15,55 e	1,06 e	2,35	2,80	++
CT2	1,0	51,11 d	1,31 d	2,42	3,04	+++
CT3	1,5	68,89 c	1,51 c	2,49	2,87	+++
CT4	2,0	75,56 b	2,56 c	2,43	2,75	++
CT5	2,5	86,67 a	3,31 a	2,49	2,71	++
CT6	3,0	64,46 c	2,92 b	2,31	2,69	+
LSD 0.05		4,78	0,16
CV%		4,40	3,20

Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh:

Công thức	Nồng độ Kinetin (mg/l)	Tỷ lệ tạo cụm chồi (%)	Số chồi / mẫu (chồi)	Chiều cao chồi (cm)	Số lá / chồi (lá)	Trạng thái chồi
CT1 (ĐC)	0,0	11,11 e	1,13 d	2,31	2,80	+++
CT2	1,0	24,44 d	1,26 d	2,35	2,91	+++
CT3	1,5	37,78 c	1,57 c	2,25	2,82	+++
CT4	2,0	40,00 c	1,72 c	2,27	2,71	+++
CT5	2,5	54,85 b	1,98 b	2,21	2,65	++
CT6	3,0	66,67 a	2,22 a	1,98	2,80	++
LSD 0.05		6,88	0,18
CV%		6,50	5,00

BAP thể hiện hiệu quả cảm ứng tạo cụm chồi vượt trội so với Kinetin. Môi trường MS bổ sung 2,5 mg/l BAP đạt tỷ lệ tạo cụm chồi 86,67% và số chồi trung bình 3,31 chồi/mẫu (so với mức tối đa 66,67% và 2,22 chồi/mẫu ở nồng độ Kinetin 3,0 mg/l).

3. Các kết quả nhân nhanh tổ hợp và tạo cây hoàn chỉnh

• Việc kết hợp BAP (2,5 mg/l) với Auxin (IBA ở dải nồng độ 0,4–0,6 mg/l) nâng cao hệ số nhân chồi và cải thiện chất lượng cụm chồi sau 45–60 ngày nuôi cấy.
• Ở giai đoạn ra rễ, các nghiệm thức bổ sung Auxin (IBA hoặc NAA) đơn lẻ và phối hợp với Cytokinin nồng độ thấp kích thích cảm ứng tạo rễ đồng đều, phát triển bộ rễ trắng khỏe mạnh, đáp ứng tiêu chuẩn đưa ra ngôi.
• Đánh giá giai đoạn ex vitro: Cây giống có từ 7–10 rễ, chiều cao 2,5–3,0 cm khi chuyển ra giá thể cát sạch đã khử trùng đạt tỷ lệ sống sót cao trước khi chuyển sang hỗn hợp đất : trấu : phân vi sinh.

Phần 5: Kết luận và đề nghị

Đưa ra kết luận tổng hợp về nồng độ tối ưu của các chất điều hòa sinh trưởng qua từng giai đoạn công nghệ; đồng thời kiến nghị tiếp tục thử nghiệm nuôi cấy trên quy mô lớn và hoàn thiện công thức giá thể để nâng cao hơn nữa tỷ lệ sống của cây giống ngoài vườn ươm.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

• Khử trùng: Xác định phương pháp khử trùng đốt thân và ngọn chồi Đinh lăng bằng dung dịch $HgCl_2$ 0,07% trong thời gian 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch vô trùng cao sau 2 tuần cấy khởi động.
• Tái sinh chồi: Môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l BAP + 30 g/l saccharose + 5,8 g/l agar là môi trường tối ưu cho giai đoạn tái sinh, đạt tỷ lệ tạo chồi 93,33%, số chồi/mẫu đạt 1,33 chồi, chiều cao chồi đạt 2,56 cm và trạng thái chồi sinh trưởng tốt.
• Nhân nhanh cụm chồi: Môi trường MS bổ sung 2,5 mg/l BAP đơn lẻ cho tỷ lệ tạo cụm chồi 86,67%, số chồi đạt 3,31 chồi/mẫu sau 30 ngày. Khi phối hợp 2,5 mg/l BAP với IBA (0,4–0,6 mg/l), khả năng nhân chồi và chất lượng chồi tiếp tục được cải thiện rõ rệt sau 45 ngày.
• Ra rễ và huấn luyện ex vitro: Xác định được các công thức kích thích ra rễ đồng đều, tạo hệ rễ khỏe mạnh và hoàn thiện quy trình ra ngôi 2 bước (bước đầu trên giá thể cát sạch vô trùng, sau đó chuyển sang bầu giá thể đất : trấu : phân vi sinh tỷ lệ 6:3:1).

Giải pháp và khuyến nghị của tác giả

• Ứng dụng quy trình nhân giống từng bước (khởi động mẫu $\rightarrow$ tái sinh $\rightarrow$ nhân cụm chồi $\rightarrow$ ra rễ tạo cây hoàn chỉnh $\rightarrow$ thuần hóa ex vitro) để cung cấp nguồn giống Đinh lăng chuẩn hóa.
• Khuyến nghị sử dụng quy trình nuôi cấy mô tế bào để thay thế kỹ thuật giâm cành truyền thống nhằm rút ngắn thời gian thu hoạch rễ củ thương phẩm từ 7–10 năm xuống chu kỳ ngắn hơn.

Đóng góp về mặt khoa học và thực tiễn

• Bổ sung dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác về phản ứng sinh lý của loài Polyscias fruticosa đối với các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin (BAP, Kinetin) và Auxin (IBA, NAA).
• Cung cấp cơ sở khoa học để hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây Đinh lăng lá nhỏ sạch bệnh, phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen và sản xuất dược liệu thương mại quy mô công nghiệp.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Các thí nghiệm mới chỉ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm (bình tam giác/ống nghiệm thủy tinh) trong thời gian từ tháng 12/2014 đến tháng 05/2015; chưa đánh giá sự tích lũy hoạt chất saponin và polyacetylen của cây giống nuôi cấy mô sau khi trồng dài hạn ngoài đồng ruộng.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Khảo nghiệm quy trình nhân giống trên hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS) hoặc bioreactor nhằm nâng cao hệ số nhân giống công nghiệp.
  • Tối ưu hóa các công thức giá thể hữu cơ, chế độ dinh dưỡng và che sáng tại vườn ươm để nâng tỷ lệ sống của cây giống khi đưa ra đồng ruộng sản xuất lớn.
  • Đánh giá năng suất rễ củ và định lượng hàm lượng hoạt chất saponin của cây in vitro qua các năm canh tác so với cây giâm cành truyền thống.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng: Sinh viên, học viên cao học chuyên ngành Công nghệ sinh học, Nông học, Dược liệu học và các kỹ thuật viên tại các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật.
• Nội dung đáng tham khảo:
  • Quy trình khử trùng mẫu mô thân gỗ/bán thân gỗ bằng $HgCl_2$ 0,07%.
  • Dải nồng độ và tỷ lệ phối hợp Cytokinin/Auxin tối ưu cho từng giai đoạn phát sinh hình thái của cây họ Nhân sâm (Araliaceae).
  • Phương pháp bố trí thí nghiệm vi nhân giống và các công thức tính toán chỉ tiêu phát sinh hình thái chuẩn mực kèm phương pháp xử lý thống kê bằng IRRISTAT.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nồng độ BAP nào cho hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng in vitro tốt nhất?

Theo kết quả thực nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy (Bảng 4.1), nồng độ BAP 2,0 mg/l (CT4) là tối ưu nhất với tỷ lệ tái sinh chồi đạt 93,33%, số chồi/mẫu đạt 1,33 chồi, chiều cao trung bình chồi đạt 2,56 cm và chồi có trạng thái khỏe, mập, lá xanh thẫm (+++).

2. Giữa BAP và Kinetin, chất điều hòa sinh trưởng nào cho hiệu quả nhân nhanh chồi cao hơn?

BAP cho hiệu quả nhân nhanh chồi cao hơn Kinetin. Ở mức tối ưu của BAP (2,5 mg/l), tỷ lệ tạo cụm chồi đạt 86,67% và số chồi/mẫu đạt 3,31 chồi. Trong khi đó, ở nồng độ Kinetin cao nhất (3,0 mg/l), tỷ lệ tạo cụm chồi chỉ đạt 66,67% và số chồi/mẫu đạt 2,22 chồi.

3. Phương pháp khử trùng mẫu ban đầu được thực hiện như thế nào?

Mẫu chồi và đốt thân in vivo (1,0–1,5 cm) được làm sạch sơ bộ bằng xà phòng loãng và thuốc diệt nấm, sau đó được khử trùng trong box cấy bằng dung dịch $HgCl_2$ nồng độ 0,07% trong thời gian 10 phút, tráng lại bằng nước cất vô trùng trước khi cấy vào môi trường MS khởi động.

4. Thành phần giá thể được sử dụng để thuần hóa cây con ra điều kiện ex vitro gồm những gì?

Cây con đạt chuẩn được ra ngôi bước đầu trên giá thể cát sạch đã hấp khử trùng. Sau 2 tuần sinh trưởng và thích nghi, các cây sống sót được chuyển trồng sang bầu giá thể gồm hỗn hợp đất : trấu : phân vi sinh phối trộn theo tỷ lệ 6:3:1.

---

Kết luận

Khóa luận đã khảo sát toàn diện ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhóm Cytokinin và Auxin đến các giai đoạn tái sinh, nhân nhanh và tạo rễ in vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms). Kết quả thực nghiệm xác định môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l BAP tối ưu cho tái sinh chồi, MS bổ sung 2,5 mg/l BAP kết hợp IBA tối ưu cho nhân nhanh cụm chồi và thiết lập quy trình ra ngôi thích nghi cây con hiệu quả ngoài vườn ươm. Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và quy trình kỹ thuật tin cậy phục vụ nhân giống thương mại và phát triển nguồn dược liệu sạch bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) là một cây thuốc quý được sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền Việt Nam. Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng chữa bệnh và giá trị kinh tế của cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L. Đặc biệt là rễ củ, đây là bộ phận chính có hàm lượng saponin triterpenoid và polyacetylen cao, có tác dụng tăng lực gần giống như nhân sâm, chống ung thư, chống trầm cảm và chống oxy hóa. Do vậy, gần đây ở Việt Nam xu hướng trồng Đinh lăng quy mô lớn đang tăng cao ở nhiều vùng nên nhu cầu về giống Đinh lăng ngày càng tăng.

Thông thường Đinh lăng được nhân giống chủ yếu bằng phương pháp giâm cành. Phương pháp này có hạn chế là hệ số nhân giống thấp, cành giâm thường 2 - 3 năm đầu chỉ cho rễ chùm, sau đó rễ cọc mới bắt đầu xuất hiện từ phần gốc của chồi tái sinh khiến thời tình từ lúc trồng đến khi thu hoạch được rễ củ phải mất khoảng 7 - 10 năm. Điều này dẫn đến tăng chi phí chăm sóc, giảm giá trị kinh tế và làm tăng giá thành sản phẩm của Đinh lăng. Do vậy, đối với các cây lấy củ nói chung và đặc biệt là Đinh lăng nói riêng, cách tốt nhất để rút ngắn thời gian thu hoạch cũng như là giảm giá thành dược liệu là sử dụng cây con từ nuôi cấy mô để có bộ rễ có khả năng phát triển thành rễ củ ngay từ đầu.

Bên cạnh đó, cây bắt nguồn từ nuôi cây mô luôn đảm bảo về độ đồng nhất về mặt di truyền đáp ứng được yêu cầu về độ đồng đều và tính ổn định cho sản xuất nguyên liệu dược trên quy mô thương mại. Quá trình nuôi cấy in vitro có rất nhiều yếu tố tác động đến sự phát sinh hình thái của cây và để xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Đinh lăng từ khâu vào mẫu đến khâu đưa trồng ra ruộng, trong đó nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến tất cả các giai đoạn của quy trình nuôi cấy là yếu tố chính quyết định sự thành bại của toàn bộ quy trình nuôi cấy. n 2 Xuất phát từ thực tiễn trên, để góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây Đinh lăng lá nhỏ, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình nhân nhanh in vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fructicosa (L. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1.

Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu được ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình nhân nhanh in vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fructicosa (L. Yêu cầu của đề tài - Nghiên cứu được ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh in vitro Đinh lăng lá nhỏ. - Nghiên cứu được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh in vitro Đinh lăng lá nhỏ. - Nghiên cứu được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo cây Đinh lăng lá nhỏ hoàn chỉnh.

- Đánh giá được hiệu quả các công thức tạo rễ in vitro đến tỷ lệ sống của cây khi đưa ra điều kiện ex vitro. Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần xây dựng quy trình nhân giống cây Đinh lăng lá nhỏ bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, là cơ sở nhân nhanh loài dược liệu có giá trị. Đề tài đã đưa ra được các minh chứng về tác động của các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi, hệ số nhân nhanh chồi, phát sinh rễ tạo cây hoàn chỉnh, tác động của giá thể đến khả năng sống và sinh trưởng của cây in vitro.

Ý nghĩa trong thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống Đinh lăng lá nhỏ bằng phương pháp nuôi cây mô. Một phương pháp nhân nhanh cây giống n 3 sạch bệnh, góp phần đáp ứng được nhu cầu lớn về giống cây Đinh lăng trên thị trường hiện nay. Thực hiện đề tài giúp sinh viên hoàn thiện về cả kiến thức lý thuyết lẫn thực tiễn, mang lại những kinh nghiệm và tác phong làm việc khoa học cho công tác sau này. n 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.

Giới thiệu về chi Đinh lăng 2. Nguồn gốc và sự phân bố Chi Polyscias Forst & Forst là một chi trong thực vật có hoa thuộc Họ Cuồng cuồng (Araliaceae), chứa khoảng 114-150 loài (tùy theo quan điểm phân loại) trên thế giới, phân bố rải rác ở các vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới, nhất là một số đảo ở Thái Bình Dương [2]. Chúng có các lá dạng lông chim. Theo APG thì chi này là một nhóm cận ngành và có thể sẽ được chia tách (hoặc hợp nhất) với một số chi khác [52].

Tại Việt Nam có khoảng 4 loài: Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana Bail.), Đinh lăng ráng (Polyscias filicifolia (Merr) Baill.), Đinh lăng viền bạc (Polycias guilfoylei Baill), Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fructicosa (L. Vị trí phân loại Theo J. Các loài thuộc chi Polyscias có ở Việt Nam Nhiều loài cũng mang tên Đinh lăng nhưng không được sử dụng làm thuốc [2]. n 5 - Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana Bail.): Lá kép thường chỉ có 3 lá chét trên một cuống dài, lá chét hình tròn, đầu tù.

- Đinh lăng trổ hoặc viền bạc (Polycias guilfoylei Baill): Lá kép có 7 lá chét; lá chét thường có viền trắng. - Đinh lăng lá to hay lá ráng (Polyscias filicifolia (Merr) Baill.): Lá kép có 11 -13 lá chét; lá chét hình mác có răng cưa to và sâu. Đinh lăng lá tròn Đinh lăng viền bạc (Polyscias balfouriana Bail.1: Hình ảnh các loài Đinh lăng có ở Việt Nam n 6 2. Giới thiệu về cây Đinh lăng lá nhỏ 2.

Mô tả Cây nhỏ, xanh tốt quanh năm, có thể cao đến 2m. Thân nhẵn, không gai, ít phân nhánh, mang nhiều vết sẹo to, màu xám. Lá to, mọc so le, kép lông chim 2 - 3 lần, dài 20 -40 cm; lá chét có răng cưa nhọn, có mùi thơm khi vò nát; cuống lá dài, phát triển thành bẹ to ở cuối [2]. Cụm hoa tán tụ thành chùm ở ngọn cành.

Hoa nhỏ, đều, lưỡng tính. Cuống hoa hình trụ, màu xanh, dài 0,3-0,4 cm. Lá bắc tập hợp ở gốc cuống hoa (tổng bao lá bắc), hình tam giác nhọn. Bao hoa: Đài hoa thu hẹp chỉ còn 5 răng, đều, rời, dạng vảy màu xanh; 5 cánh hoa rời, đều, màu xanh, hình bầu dục thuôn nhọn ở đỉnh, dài 0,25-0,3 cm, rộng 0,1-0,15 cm, có gân giữa, tiền khai hoa van.

Bộ nhị: 5 nhị rời, đều, đính xen kẽ với cánh hoa; chỉ nhị dạng sợi mảnh, màu trắng, dài 0,1-0,15 cm; bao phấn 2 ô thuôn dài màu vàng, nứt dọc, hướng trong, đính gốc. Hạt phấn rời, hình cầu có 3 lỗ, màu vàng nhạt, đường kính 30-35 µm. Bộ nhụy: 2-3 lá noãn, bầu dưới 2 ô hay 3 ô, mỗi ô 1 noãn, đính noãn trung trụ; 2-3 vòi rời úp sát vào nhau, thẳng đứng, màu xanh đậm, dài 1 cm; đầu nhụy hình điểm. Quả hạch hình bầu dục mang trên đỉnh quả vòi nhụy tồn tại mọc choãi ra và đài tồn tại, vỏ quả màu xanh đậm có những nốt tròn màu xanh nhạt hơn, dài 4-6 mm, rộng 3-4 mm [54].

n 7 Cây bụi Chùm hoa Lá Lá chét Hình 2.2: Một số hình ảnh nhận dạng cây Đinh lăng lá nhỏ 2. Phân bố, sinh thái Đinh lăng có nguồn gốc ở vùng đảo Polynesie ở Thái Bình Dương. Cây được trồng ở Malaysia, Indonesia, Campuchia, Lào. Ở Việt Nam, Đinh lăng cũng có từ lâu trong nhân dân và được trồng khá phổ biến ở vườn gia đình, đình chùa, trạm xá, bệnh viện.

để làm cảnh, làm thuốc và rau gia vị [2]. Đinh lăng là loại cây ưa ẩm và có thể hơi chịu bóng, trồng được trên nhiều loại đất, thậm chí với một lượng đất rất ít trong chậu nhỏ, cây vẫn có thể sống được, theo kiểu cây cảnh bonsai. Trồng bằng cành sau 2-3 năm cây có hoa quả. Chưa quan n 8 sát được cây con mọc từ hạt.

Đinh lăng có khả năng tái sinh vô tính khỏe. Với một đoạn thân hoặc cành cắm xuống đất đều trở thành cây mới [54]. Bộ phận sử dụng Rễ củ Đinh lăng của những cây trên 3 năm tuổi thu hái vào mùa thu, lúc này rễ mềm, nhiều hoạt chất, rửa sạch. Rễ nhỏ để nguyên, rễ to chỉ dùng vỏ rễ.

Thái rễ mỏng, phơi khô ở chỗ mát, thoáng gió để đảm bảo mùi thơm và phẩm chất [2]. Thành phần hóa học Vỏ rễ và lá Đinh lăng chứa saponin, alcaloid, các vitamin B1, B2, B6, vitamin C, 20 acid amin, glycosid, alcaloid, phytosterol, tanin, acid hữu cơ, tinh dầu, nhiều nguyên tố vi lượng và 21,10% đường. Trong lá còn có saponin triterpen (1,65%), một genin đã xác định được là acid oleanolic [2]. Từ lá Đinh lăng, Trung tâm Sâm và dược liệu thành phố Hồ Chí Minh thuộc Viện Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh thuộc Viện Dược liệu đã phân lập được 5 hợp chất polyacetylen là panaxynol, panoxydol, heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3, 10 diol, heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3 ol - 10 on và heptadeca - 1,8 (Z) - dien dien - 4,6 diyn - 3 ol - 10 on.

Hai hợp chất sau chỉ có trong lá Đinh lăng mà chưa thấy có trong các cây thuộc chi Panax và họ Araliaceae. Trong rễ Đinh lăng cũng tìm thấy 5 hợp chất polyacetylen, nhưng chỉ có panoxydol, panaxynol và heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3,10 diol là trùng hợp với các chất trong lá. Ba chất này có tác dụng kháng khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thư [2]. Tác dụng dược lý [2] Đinh lăng có các tác dụng tăng lực trên động vật thí nghiệm và trên người.

Thân và lá có tác dụng này, nhưng yếu hơn; làm tăng hiệu lực điều trị của cloroquin trong bệnh sốt rét thực nghiệm trên động vật; tăng co bóp tử cung và tăng tiết niệu; tác dụng an thần và ít độc. Đinh lăng đã được nghiên cứu và chứng minh có tác dụng nội tiết kiểu oestrogen. Nước sắc Đinh lăng có tác dụng kháng đối với trùng roi Euglena viridis, trùng tiêm mao Paramoecium caudatum và một số động vật nguyên sinh khác trong n 9 nước ngâm rơm và nước ao. Nước sắc Đinh lăng còn có tác dụng chống choáng phản vệ ở mức độ vừa, bảo vệ được 60% chuột lang qua cơn choáng.

Dựa theo kinh nghiệm dân gian, Đinh lăng được áp dụng điều trị bệnh nhân lỵ amip cấp.