Luận án tiến sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi oreochromis spp

Luận án tiến sĩ nghiên cứu ứng dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh streptococcus agalactiae trên cá rô phi oreochromis spp.

• Tác giả: Nguyen Thị Trúc Quyên
• Người hướng dẫn: TS. Nguyen Thị Ngọc Tĩnh
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nâng Cao Khả Năng Kháng Bệnh Cho Cá Rô Phi Bằng Cao Chiết Thảo Dược Chống Streptococcus Agalactiae
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tình hình sản xuất cá rô phi trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.2. Tổng quan về vi khuẩn Streptococcus agalactiae
• 1.2.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa
• 1.2.2. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích
• 1.2.3. Phân nhóm và độc lực của vi khuẩn S. agalactiae
• 1.2.4. Các yếu tố độc lực
• 1.3. Tình hình dịch bệnh do vi khuẩn S. agalactiae gây ra
• 1.3.1. Đối với động vật thủy sản
• 1.4. Sử dụng thảo dược phòng trị bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. agalactiae gây ra
• 1.4.1. Nghiên cứu khả năng kháng Streptococcus sp. của thảo dược
• 1.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thảo dược lên tăng trưởng, sức khỏe của cá
• 1.4.3. Đáp ứng miễn dịch trên cá xương và tác động của thảo dược lên hình thái biểu mô của cá
• 1.5. Giới thiệu các loại thảo dược sử dụng trong nghiên cứu
• 1.6. Phương pháp chiết xuất thảo dược dùng trong nghiên cứu
• 1.6.1. Chiết ngấm lạnh
• 1.6.2. Chiết nóng bằng dung môi hữu cơ
• 1.7. Cơ sở lựa chọn các nội dung nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Nguồn cá bệnh và chủng vi khuẩn
• 2.3. Thức ăn, hóa chất, dụng cụ, thiết bị
• 2.4. Nội dung nghiên cứu
• 2.4.1. Xác định khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh S. agalactiae ở điều kiện in vitro của một số dịch chiết và cao chiết thảo dược
• 2.4.1.1. Phân lập và định danh vi khuẩn S. agalactiae
• 2.4.1.2. Khảo sát khả năng kháng S. agalactiae của cao chiết dạng thô
• 2.4.1.3. Xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết
• 2.4.2. Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên tăng trưởng và khả năng bảo vệ cá rô phi kháng lại vi khuẩn gây bệnh S. agalactiae
• 2.4.2.1. Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên tăng trưởng
• 2.4.2.2. Xác định giá trị LD50 và các yếu tố độc lực
• 2.4.2.3. Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên khả năng bảo vệ cá rô phi
• 2.4.3. Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên các chỉ tiêu máu, chỉ tiêu miễn dịch và hình thái mô học ruột cá
• 2.4.3.1. Phân tích tế bào máu và các chỉ tiêu miễn dịch
• 2.4.3.2. Phân tích hình thái mô học ruột cá
• 2.4.4. Xác định hàm lượng và khả năng kháng khuẩn của hoạt chất chính
• 2.4.4.1. Xác định hàm lượng hoạt chất 6-gingerol và cinnamic aldehyde
• 2.4.4.2. Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn của hoạt chất chính
• 2.4.4.3. Xác định giá trị MIC và MBC của cao chiết theo hàm lượng chất chính
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Xác định khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh S. agalactiae ở điều kiện in vitro của một số dịch chiết và cao chiết thảo dược
• 3.1.1. Phân lập và định danh các chủng S. agalactiae sử dụng trong nghiên cứu
• 3.1.2. Sàng lọc khả năng kháng S. agalactiae của dịch chiết
• 3.1.3. Khảo sát khả năng kháng S. agalactiae của cao chiết dạng thô
• 3.1.4. Xác định giá trị MIC và MBC của cao chiết gừng và cao chiết vỏ quế
• 3.1.5. Xác định loại thảo dược và dung môi phù hợp
• 3.2. Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên tăng trưởng và khả năng bảo vệ cá rô phi kháng lại vi khuẩn gây bệnh
• 3.2.1. Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên tăng trưởng
• 3.2.2. Xác định giá trị LD50 và các yếu tố độc lực
• 3.2.3. Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên khả năng bảo vệ cá rô phi
• 3.2.4. Tỷ lệ sống và các chỉ tiêu tăng trưởng
• 3.2.5. Biểu hiện bệnh lý của cá sau khi cảm nhiễm
• 3.3. Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên các chỉ tiêu máu, miễn dịch và hình thái mô học ruột cá
• 3.3.1. Xác định ảnh hưởng lên chỉ tiêu máu và các chỉ tiêu miễn dịch
• 3.3.2. Mật độ hồng cầu và bạch cầu
• 3.3.3. Hoạt tính thực bào
• 3.3.4. Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên hình thái mô ruột cá
• 3.4. Xác định hàm lượng hoạt chất chính và khảo sát tính kháng khuẩn của cao chiết gừng và cao chiết vỏ quế dựa trên hàm lượng hoạt chất chính
• 3.4.1. Xác định hàm lượng hoạt chất chính trong cao chiết gừng
• 3.4.2. Xác định hàm lượng hoạt chất chính trong cao chiết vỏ quế
• 3.4.3. Xác định hàm lượng hoạt chất chính trong thức ăn thí nghiệm
• 3.4.4. Khả năng kháng S. agalactiae của cao chiết theo hoạt chất chính
• 3.4.5. Hiệu quả nâng cao khả năng kháng S. agalactiae của cao chiết
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ
• PHỤ LỤC
• DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Giới thiệu về cá rô phi và bệnh do Streptococcus agalactiae

Cá rô phi (Oreochromis spp.) là một trong những loài cá nước ngọt được nuôi phổ biến nhất trên thế giới. Loài cá này không chỉ mang lại giá trị kinh tế cao mà còn đóng vai trò quan trọng trong an ninh thực phẩm. Tuy nhiên, cá rô phi thường phải đối mặt với nhiều bệnh tật, trong đó bệnh do Streptococcus agalactiae là một trong những nguyên nhân chính gây thiệt hại lớn trong ngành nuôi trồng thủy sản. Bệnh này có thể dẫn đến tỷ lệ chết cao và ảnh hưởng đến sự phát triển của cá. Việc nâng cao khả năng kháng bệnh cho cá rô phi là một vấn đề cấp thiết nhằm đảm bảo sự phát triển bền vững của ngành nuôi trồng thủy sản.

II. Phương pháp chiết xuất thảo dược

Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược từ vỏ quế và gừng để nâng cao khả năng kháng bệnh cho cá rô phi. Các cao chiết này được chiết xuất bằng dung môi ethanol 96% và methanol 99,8%. Kết quả cho thấy, các cao chiết này có khả năng diệt vi khuẩn Streptococcus agalactiae trong điều kiện in vitro. Việc sử dụng thảo dược tự nhiên không chỉ giúp giảm thiểu tác động của hóa chất mà còn góp phần bảo vệ môi trường. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, thảo dược có thể cải thiện sức khỏe và khả năng miễn dịch của cá, từ đó nâng cao khả năng kháng bệnh.

III. Tác động của cao chiết lên sức khỏe cá rô phi

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung cao chiết thảo dược vào thức ăn cho cá rô phi không làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cá. Cụ thể, các cao chiết này đã cho thấy hiệu quả bảo vệ cao nhất với tỷ lệ sống tương đối (RPS) đạt 51,4% khi cá được cho ăn với hàm lượng 20 g/kg thức ăn. Điều này chứng tỏ rằng, việc sử dụng thảo dược không chỉ giúp nâng cao khả năng kháng bệnh mà còn cải thiện khả năng hấp thu chất dinh dưỡng của cá. Các chỉ tiêu máu và miễn dịch cũng được cải thiện, cho thấy sự hỗ trợ tích cực từ các cao chiết này.

IV. Kết luận và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã khẳng định tiềm năng ứng dụng của cao chiết thảo dược trong việc nâng cao khả năng kháng bệnh cho cá rô phi. Việc sử dụng thảo dược tự nhiên không chỉ giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh tật mà còn góp phần bảo vệ môi trường và phát triển bền vững ngành nuôi trồng thủy sản. Các kết quả nghiên cứu này có thể được áp dụng rộng rãi trong thực tiễn nuôi cá, giúp người nuôi cải thiện hiệu quả sản xuất và giảm thiểu rủi ro từ dịch bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Nuôi trồng thủy sản là một trong những lĩnh vực phát triển nhanh trong ngành sản xuất thực phẩm toàn cầu (Bondad-Reantaso và ctv, 2005). Tại Việt Nam, thủy sản được xác định là ngành kinh tế mũi nhọn với sản lượng nuôi tăng từ 3,53 triệu tấn năm 2015 lên 5,19 triệu tấn năm 2022 (VASEP, 2023a). Trong các loài cá nước ngọt, cá rô phi (Oreochromis spp.) là đối tượng nuôi phổ biến thứ hai trên thế giới sau các loài cá chép (Fitzsimmons, 2005), với sản lượng nuôi toàn cầu đạt 6,4 triệu tấn vào năm 2022 (VASEP, 2023b). Tại Việt Nam, cá rô phi được định hướng trở thành sản phẩm thủy sản chủ lực sau tôm và cá tra, với mục tiêu đạt diện tích 33.000–40.000 ha và sản lượng 300.000–400.000 tấn đến năm 2030 (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2016).

Tuy nhiên, nghề nuôi cá rô phi đang đối mặt với thiệt hại kinh tế nghiêm trọng do dịch bệnh lồi mắt, xuất huyết do liên cầu khuẩn Streptococcus agalactiae gây ra. Vi khuẩn này gây nhiễm trùng huyết, viêm màng não, làm cá chết nhanh với tỷ lệ cao ở mọi giai đoạn phát triển. Biện pháp kiểm soát phổ biến hiện nay là sử dụng kháng sinh, nhưng việc lạm dụng dẫn đến hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn (Zhang và ctv, 2018, 2020), làm tồn dư hóa chất và ảnh hưởng đến an toàn thực phẩm (Zhang, 2021).

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là: xu hướng sử dụng thảo dược tự nhiên bổ sung vào thức ăn để phòng trị bệnh cho thủy sản được đánh giá là giải pháp bền vững và thân thiện với môi trường (Jeney và ctv, 2015; Maulu và ctv, 2021). Tuy nhiên, tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nhằm nâng cao sức đề kháng và phòng trị bệnh do S. agalactiae trên cá rô phi vẫn còn hạn chế về số lượng và hầu hết mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm đơn lẻ. Nhiều loại thảo dược phổ biến, chi phí thấp chưa được sàng lọc hệ thống bằng các dung môi chiết xuất khác nhau, chưa được đánh giá đồng bộ từ thử nghiệm in vitro, in vivo đến khảo sát các chỉ tiêu miễn dịch, mô học ruột và xác định hoạt chất chính.

Mục tiêu nghiên cứu

• Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu giải pháp sử dụng cao chiết từ thảo dược bổ sung vào thức ăn, như là giải pháp hiệu quả phòng, trị bệnh trên cá rô phi, thay thế cho việc sử dụng hóa chất, kháng sinh.
• Mục tiêu cụ thể:
  1. Xác định được loại thảo dược và loại dung môi phù hợp để tạo ra cao chiết có khả năng kháng hiệu quả với vi khuẩn S. agalactiae ở điều kiện in vitro.
  2. Đánh giá hiệu quả bổ sung cao chiết thảo dược vào thức ăn lên tăng trưởng, tăng cường một số chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu và khả năng kháng bệnh do vi khuẩn S. agalactiae gây ra trên cá rô phi giống.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu:
  • 06 loại thảo dược: cây diếp cá (Houttuynia cordata), củ hành tím (Allium ascalonicum), lá kinh giới (Elsholtzia ciliata), vỏ thân quế (Cinnamomum verum), củ gừng (Zingiber officinale) và củ riềng (Alpinia officinarum).
  • Chủng vi khuẩn S. agalactiae phân lập từ cá rô phi bệnh thu thập tại tỉnh Đồng Nai và Thành phố Hồ Chí Minh.
  • Động vật thử nghiệm: Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) giai đoạn cá giống, khối lượng trung bình 4–6 g/con.
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm thuộc Phòng Sinh học Thực nghiệm, Trung tâm Quan trắc môi trường và bệnh thuỷ sản Nam Bộ (Quận 1, TP.HCM) và Phòng thí nghiệm ướt tại Trại Nghiên cứu Thực nghiệm Thủy sản Gò Vấp (TP.HCM) thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. Mẫu cá bệnh thu tại huyện Định Quán (tỉnh Đồng Nai) và huyện Củ Chi (TP.HCM).
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 11 năm 2017 đến tháng 12 năm 2022.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được tác giả điểm lại

Luận án đã tổng hợp các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến vi khuẩn S. agalactiae, bệnh liên cầu khuẩn trên động vật thủy sản và các thử nghiệm sử dụng thảo dược:

1. Về vi khuẩn học và dịch bệnh liên cầu khuẩn:

   • Streptococcus agalactiae (liên cầu nhóm B) được phân biệt bởi Lancefield (1933), là cầu khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy tiện, âm tính với oxidase và catalase (Amal và Zamri-Saad, 2011).
   • Dịch bệnh do Streptococcus sp. xuất hiện lần đầu trên cá hồi tại Nhật Bản (Hoshina và ctv, 1958), gây thiệt hại hàng năm khoảng 250 triệu USD trên toàn cầu (Amal và Zamri-Saad, 2011). Hai tác nhân chính gồm S. agalactiae và S. iniae (Evans và ctv, 2002; Robinson và Meyer, 1966; Pier và Madin, 1976).
   • Tại Đông Nam Á và Trung Quốc, S. agalactiae chiếm đa số trong các mẫu bệnh phẩm phân lập từ cá rô phi (Lauke, 2007: 74,5%; Sheehan và ctv, 2009: 82%; Kayansamruaj và ctv, 2019; Li và ctv, 2014; Su và ctv, 2019; Zhang, 2021).
   • Tại Việt Nam, bệnh xuất hiện lần đầu năm 2004 tại An Giang (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012b) và bùng phát mạnh năm 2009 tại miền Bắc gây tỷ lệ chết 90–100% (Đồng Thanh Hà và ctv, 2010; Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản I, 2017), tiếp tục được ghi nhận tại Thừa Thiên Huế và Đồng bằng sông Cửu Long (Trương Đình Hoài và ctv, 2014; Nguyễn Ngọc Phước và ctv, 2019; Đoàn Thị Nhinh và ctv, 2022).
   • Về phân nhóm huyết thanh và kiểu gen: Vi khuẩn có 10 serotype (Ia, Ib, II đến IX) dựa trên cấu trúc polysaccharide vỏ (CPS) (Delannoy và ctv, 2021; Imperi và ctv, 2010). Phân tích MLST xác định các kiểu trình tự ST7, ST260, ST261, ST283, ST491, ST500 gắn với ba phức hợp dòng chính CC7/Ia, CC283/III và CC552/Ib (Kayansamruaj và ctv, 2019; Delannoy và ctv, 2021). Tại Việt Nam, Phuoc và ctv (2021) ghi nhận serotype III/ST283 tại An Giang, Đồng Tháp và Ib/ST1395 tại Thừa Thiên Huế.
   • Về yếu tố độc lực: Lin và ctv (2011) phân loại 14 gen độc lực thành ba nhóm: bám dính (fbsA, fbsB, bibA, lmb, scpB), xâm lấn (cfb, cylE, hylB, spb1) và kháng/né tránh miễn dịch (rib, bac, pbp1A/ponA, cspA, scpB).

2. Về khả năng kháng khuẩn in vitro của thảo dược:

   • Dịch chiết dung môi nước: lá xuyên tâm liên (Andrographis paniculata - MIC 31,25 µg/ml), duối nhám (Streblus asper - MIC 125 µg/ml) (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010); vỏ quế (C. verum - MIC 150 µg/ml, đường kính vòng kháng khuẩn 18 mm) (Alsaid và ctv, 2010); lá, quả bưởi (Citrus grandis) (Wongthai và ctv, 2011); lá chùm ngây (Moringa oleifera) (Kamble và ctv, 2014); khảo sát 115 loại thảo dược của Guo (2019).
   • Dịch chiết dung môi ethanol và methanol: dịch chiết ổi (Psidium guajava - MIC 62,5 µg/ml) (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010); hoàng liên, hoàng cầm, cốt khí củ, địa du (Peng và ctv, 2014); lá trầu không (Piper betle) (Trịnh Thị Trang và Nguyễn Thanh Hải, 2016); thảo dược Brazil bằng methanol (Castro và ctv, 2008); củ gừng bằng ethanol 95% kháng Streptococcus sp. với vòng kháng khuẩn 28 mm (Nader, 2010); lá hẹ (Allium tuberosum) (Trương Thị Mỹ Hạnh, 2008); lá ổi và cỏ mực (Trần Ngọc Hùng và Trương Thanh Vinh, 2012).

3. Về tác động của thảo dược lên tăng trưởng, miễn dịch và mô học ruột:

   • Bổ sung bột tỏi 0,5% cải thiện miễn dịch trên cá rô phi lai nhưng không làm tăng trưởng khối lượng (Ndong và ctv, 2007; Mai Thanh Thanh và Bùi Thị Bích Hằng, 2018).
   • Bổ sung hoàng kỳ (Radix astragalus) làm tăng lysozyme và hoạt tính thực bào, trong khi hoàng cầm (Radix scutellariae) lại ức chế các chỉ tiêu này (Yin và ctv, 2006).
   • Các nghiên cứu bổ sung hỗn hợp thảo dược (Emmanuel và ctv, 2018), bột củ lưỡi cọp, cúc chỉ thiên, trà xanh (Doan và ctv, 2019a, 2019b, 2019c), tinh dầu húng quế và gừng (Brum và ctv, 2017), chiết xuất trà mủ (Abdul và ctv, 2020) giúp tăng tỷ lệ sống tương đối (RPS) và kích thích miễn dịch.
   • Ảnh hưởng mô học biểu mô ruột: các nghiên cứu của Nicholson và ctv (2012), Valladao và ctv (2017), Liu và ctv (2018), Amin và ctv (2019), Adeshina và ctv (2021), Adeniyi và ctv (2022) chứng minh thảo dược cải thiện chiều cao nhung mao (VH), chiều rộng nhung mao (VW) và lớp cơ niêm mạc (MP/ME) mà không gây biến đổi bất lợi cho thành ruột.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Luận án tập trung giải quyết:

• Sàng lọc đồng thời 06 loại thảo dược thông dụng ở Việt Nam với 02 hệ dung môi hữu cơ (ethanol 96% và methanol 99,8%) trên các chủng vi khuẩn S. agalactiae thực địa phân lập tại Nam Bộ.
• Đánh giá tính an toàn sinh học (8 tuần) và hiệu lực bảo vệ in vivo (RPS) của cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng ở các dải nồng độ 10, 20, 40 g/kg thức ăn sau khi gây cảm nhiễm nhân tạo bằng tiêm xoang bụng vi khuẩn S. agalactiae.
• Định lượng biến thiên tế bào máu, hoạt tính thực bào và cấu trúc vi thể mô học biểu mô ruột cá rô phi trước và sau cảm nhiễm.
• Chuẩn hóa hoạt chất chính (6-gingerol và cinnamic aldehyde) bằng TLC và HPLC, đồng thời đối chiếu hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết theo hàm lượng hoạt chất chuẩn.
• Phân tích kiểu gen MLST và hồ sơ gen độc lực của chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập tại Củ Chi, TP. Hồ Chí Minh.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung phân tích và cơ sở lý thuyết

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết miễn dịch học cá xương (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007) gồm cơ chế bảo vệ không đặc hiệu (hàng rào biểu mô ruột, tế bào thực bào, lysozyme) và miễn dịch dịch thể/tế bào; lý thuyết dược lý học thảo dược về hoạt chất tự nhiên kháng khuẩn (flavonoid, polyphenol, cinnamic aldehyde, 6-gingerol); và phương pháp dịch tễ học phân tử dựa trên hệ thống phân loại đa locus (MLST) cùng cấu hình gen độc lực (Lin và ctv, 2011).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

[6 loại thảo dược] ---> [Chiết nóng với Ethanol 96% / Methanol 99,8%] ---> [14 dịch chiết gốc & Cao chiết]
                                                                                   |
       +---------------------------------------------------------------------------+
       |
       v
[Nội dung 1: In vitro] ---> Khuếch tán giếng thạch & đĩa giấy, xác định MIC/MBC trên S. agalactiae
       |
       v
[Nội dung 2: In vivo]  ---> Thử nghiệm an toàn 8 tuần (tăng trưởng WG, SGR, FCR)
                       ---> Thử nghiệm bảo vệ 28 ngày + cảm nhiễm S. agalactiae (xác định RPS, LD50)
       |
       v
[Nội dung 3: Cơ chế]   ---> Chỉ tiêu máu (RBC, WBC), hoạt tính thực bào (PA), mô học ruột (VH, VW, MP/ME)
       |
       v
[Nội dung 4: Hoạt chất] ---> Định tính TLC, định lượng HPLC (6-gingerol, cinnamic aldehyde), thử tính kháng khuẩn

Phương pháp in vitro (Nội dung 1)

• Phân lập, định danh vi khuẩn: Mẫu cá bệnh được khử trùng bề mặt bằng cồn 70°, mổ vô trùng lấy mẫu từ gan, thận cấy trên môi trường Brain Heart Infusion Agar (BHIA) và Blood Agar để xác định dạng tan huyết (tan huyết α hoặc β). Định danh hình thái, nhuộm Gram, quan sát chuyển động (kính hiển vi Olympus CX40), thử nghiệm sinh hóa bằng test kit API 32 Strep (BioMerieux, Pháp) và giải trình tự gen 16S rRNA đối chiếu dữ liệu NCBI.
• Tách chiết thảo dược: Bột thảo dược sấy khô ở 40°C, nghiền mịn qua rây 180–355 (kích thước hạt 0,13–0,24 mm). Xác định độ ẩm bột nguyên liệu. Chiết nóng 10 g bột thảo dược trong 100 ml dung môi (ethanol 96% hoặc methanol 99,8%) ở 60°C, lắc 120 vòng/phút trong 120 phút bằng bể điều nhiệt lắc. Lọc thô qua vải tiệt trùng và lọc tinh qua giấy lọc Whatman 0,45 µm thu dịch chiết gốc (0,1 g/ml). Cô quay chân không ở 60°C (máy Haake Phoenix II - C25P) thu cao lỏng (1 g/ml).
• Khảo sát kháng khuẩn:
  • Dịch chiết: Phương pháp khuếch tán giếng thạch (Balouiri và ctv, 2016). Bơm 80 µl dịch chiết (nồng độ điều chỉnh 20 mg/ml, tương đương 1,6 mg bột thô) vào giếng thạch đường kính 8 mm trên đĩa BHIA cấy trải vi khuẩn mật độ $10^5$ CFU/ml (pha loãng từ dịch gốc $10^8$ CFU/ml, tương đương McFarland 0,5). Ủ 4°C trong 15 phút, sau đó ủ 30°C trong 48 giờ (lặp lại 6 lần). Đối chứng âm là dung môi ethanol và methanol tinh khiết.
  • Cao chiết: Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (Kirby-Bauer, 1996). Tẩm 20 µl cao chiết (tương đương 20 mg bột thô) lên đĩa giấy vô trùng đường kính 6 mm, dày 1 mm. Đặt lên bề mặt thạch cấy vi khuẩn mật độ $10^6$ CFU/ml. Đối chứng dương sử dụng đĩa kháng sinh Doxycycline (30 µg) (Nam Khoa). Đo đường kính vòng kháng khuẩn sau 48 giờ ủ ở 30°C.
  • Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) bằng phương pháp pha loãng liên tiếp trên đĩa 96 giếng với chất chỉ thị thị màu resazurine 0,01%.

Phương pháp in vivo (Nội dung 2 & Nội dung 3)

• Động vật và thức ăn thí nghiệm: Cá rô phi vằn giống (4–6 g/con) được thuần dưỡng 5 ngày trong bể composite 500 lít có sục khí liên tục. Thức ăn cơ sở là cám Cargill-7414 (đạm $\ge 40%$, béo $\ge 5%$, tro/xơ $\le 5%$, ẩm $\le 11%$, canxi $\ge 0,5%$). Cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng được phối trộn vào thức ăn ở các nồng độ 10, 20 và 40 g/kg thức ăn.
• Thử nghiệm tăng trưởng và an toàn sinh học: Nuôi cá trong 8 tuần với các nghiệm thức thức ăn có bổ sung cao chiết. Đánh giá tỷ lệ sống, tăng trọng khối lượng (WG), tốc độ tăng trưởng tương đối (SGR), tăng trọng hàng ngày (DWG) và hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR). Theo dõi chất lượng nước (nhiệt độ, pH, DO).
• Xác định $LD_{50}$ và cảm nhiễm nhân tạo: Xác định liều gây chết 50% ($LD_{50}$) của các chủng vi khuẩn bằng phương pháp tiêm xoang bụng cá rô phi với các dải nồng độ vi khuẩn khác nhau. Thử nghiệm bảo vệ tiến hành cho cá ăn thức ăn bổ sung cao chiết trong 28 ngày, sau đó tiêm xoang bụng liều vi khuẩn xác định và tiếp tục theo dõi, cho ăn bổ sung trong 10 ngày. Tính tỷ lệ chết tích lũy và tỷ lệ sống tương đối ($RPS = [1 - (% \text{ cá chết nhóm thử nghiệm} / % \text{ cá chết nhóm đối chứng})] \times 100$).
• Phân tích tế bào máu và chỉ tiêu miễn dịch: Thu máu cuống đuôi cá có dùng chất kháng đông EDTA. Đếm mật độ hồng cầu (RBC) và bạch cầu (WBC) bằng buồng đếm Neubauer với dung dịch Natt-Herrick. Nhuộm tiêu bản máu bằng dung dịch Wright-Giemsa để phân loại tỷ lệ các loại bạch cầu (lymphocyte, monocyte, neutrophil). Đánh giá hoạt tính thực bào (Phagocytic Activity - PA) của tế bào bạch cầu với hạt Zymosan trong dung dịch đệm Hanks (HBSS) và RPMI 1640.
• Phân tích mô học ruột: Mẫu ruột (ruột trước, ruột giữa, ruột sau) được cố định trong dung dịch formalin 10%, đúc khối parafin, cắt lát mỏng và nhuộm Hematoxylin - Eosin (H&E). Đo đạc chiều cao nhung mao (VH), chiều rộng nhung mao (VW), diện tích bề mặt nhung mao và độ dày lớp đệm niêm mạc/lớp cơ (MP/ME) dưới kính hiển vi quang học có gắn trắc vi thị kính.

Phương pháp hóa học và sinh học phân tử (Nội dung 4)

• Chuẩn hóa hoạt chất: Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu gừng và vỏ quế theo Dược điển Việt Nam / Dược điển Trung Quốc. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng (TLC). Định lượng hàm lượng hoạt chất chính (6-gingerol trong gừng và cinnamic aldehyde trong vỏ quế) trong cao chiết và thức ăn phối trộn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
• Khảo sát tính kháng khuẩn của hoạt chất: Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cinnamic aldehyde và 6-gingerol ở các mức hàm lượng xác định (100 µg/g và 200 µg/g) đối với vi khuẩn S. agalactiae.
• Phân tích sinh học phân tử: Xác định kiểu trình tự đa locus (MLST) của chủng vi khuẩn bằng cách khuếch tán và giải trình tự 7 locus gen giữ nhà (cpn60, dltA, gki, mutS, recA, tkt, pyrG) đối chiếu cơ sở dữ liệu PubMLST. Xác định các gen độc lực (cfb, cylE, bibA, fbsA, fbsB, lmb, scpB, hylB, spb1, rib, bac, pbp1A/ponA, cspA) bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu.

Nguồn nguyên liệu và dữ liệu

• Nguồn thảo dược: 06 loại nguyên liệu được cung cấp bởi Viện Y học Dân tộc, thu hái tại Củ Chi - TP.HCM (diếp cá), Vĩnh Châu - Sóc Trăng (hành tím), Hóc Môn - TP.HCM (kinh giới), Chợ Đồn - Bắc Cạn (vỏ quế), Lâm Hà - Lâm Đồng (gừng), Bến Lức - Long An (riềng).
• Nguồn chủng vi khuẩn: Chủng SA-12.1 và SA-26.1 phân lập từ cá bệnh tại Định Quán, Đồng Nai; Chủng SA-2.1-CC phân lập từ cá bệnh tại Củ Chi, TP.HCM (cung cấp bởi Trung tâm Quan trắc môi trường và bệnh thuỷ sản Nam Bộ).
• Nguồn cá thí nghiệm: Trung tâm Giống thủy sản và cây trồng tại xã Tân An Hội, huyện Củ Chi, TP.HCM.

TT	Loại thảo dược	Tên khoa học	Bộ phận sử dụng	Tình trạng	Nguồn gốc thu mẫu
1	Diếp cá	Houttuynia cordata	Thân, lá cành	Tươi	Huyện Củ Chi, TP.HCM
2	Củ hành tím	Allium ascalonicum	Thân củ (có vỏ / không vỏ)	Tươi	Huyện Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng
3	Kinh giới	Elsholtzia ciliata	Thân, lá cành	Tươi	Huyện Hóc Môn, TP.HCM
4	Vỏ quế	Cinnamomum verum	Vỏ thân	Khô	Huyện Chợ Đồn, tỉnh Bắc Cạn
5	Củ gừng	Zingiber officinale	Thân củ	Tươi	Huyện Lâm Hà, tỉnh Lâm Đồng
6	Củ riềng	Alpinia officinarum	Thân củ	Tươi	Huyện Bến Lức, tỉnh Long An

TT	Loại bột thảo dược	Hàm lượng ẩm (%)
1	Diếp cá	21,80
2	Củ hành tím có vỏ	15,53
3	Củ hành tím không vỏ	11,71
4	Lá kinh giới	11,07
5	Củ gừng	9,94
6	Củ riềng	10,67
7	Vỏ quế	12,11

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: TỔNG QUAN

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu cơ sở gồm 7 phần chính:

• Tổng quan về cá rô phi: Trình bày nguồn gốc phân loại 3 chi (Oreochromis, Sarotherodon, Tilapia), đặc điểm sinh học cá rô phi vằn (O. niloticus), cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.), khả năng thích nghi nhiệt độ (25–30°C), tập tính sinh sản ấp trứng trong miệng và tình hình sản xuất cá rô phi tại Việt Nam cũng như trên thế giới.
• Tổng quan về vi khuẩn Streptococcus agalactiae: Mô tả đặc điểm hình thái cầu khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào; triệu chứng nhiễm trùng huyết, lồi mắt đục, xuất huyết thân/gốc vây, viêm màng não, hoại tử nội tạng; hệ thống phân loại 10 serotype vỏ CPS và hệ thống MLST gắn với 3 phức hợp dòng CC7, CC283, CC552; cấu hình 14 gen độc lực thuộc các nhóm bám dính, xâm lấn (cfb, cylE, hylB) và né tránh miễn dịch.
• Tình hình dịch bệnh do S. agalactiae: Thống kê thiệt hại kinh tế do bệnh liên cầu khuẩn trên thế giới (250 triệu USD/năm) và các đợt bùng phát dịch bệnh nghiêm trọng trên cá rô phi tại Thái Lan, Trung Quốc, Indonesia và Việt Nam (từ 2004 đến nay).
• Sử dụng thảo dược phòng trị bệnh liên cầu khuẩn: Tổng quan các công trình nghiên cứu sử dụng dịch chiết nước, ethanol, methanol từ thực vật có hoạt tính kháng vi khuẩn Streptococcus sp. và S. agalactiae.
• Ảnh hưởng của thảo dược lên tăng trưởng, sức khỏe và đáp ứng miễn dịch: Đánh giá tác động kích thích miễn dịch không đặc hiệu, tăng trưởng và cải thiện tỷ lệ sống tương đối của cá xương khi bổ sung thảo dược vào khẩu phần ăn.
• Tác động của thảo dược lên hình thái biểu mô ruột cá: Tổng thuật mối liên hệ giữa chiều cao nhung mao, độ dày lớp cơ niêm mạc ruột với khả năng tiêu hóa, hấp thu và hàng rào miễn dịch đường ruột.
• Giới thiệu các loại thảo dược, phương pháp chiết xuất và cơ sở lựa chọn: Mô tả đặc điểm thực vật, thành phần hoạt chất chính của 06 loại thảo dược khảo sát (diếp cá, hành tím, kinh giới, riềng, quế, gừng), so sánh phương pháp chiết ngấm kiệt và chiết nóng bằng dung môi hữu cơ, nêu rõ cơ sở khoa học lựa chọn ethanol 96% và methanol 99,8% để chiết xuất.

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 trình bày chi tiết địa điểm, thời gian, bố trí thực nghiệm và quy trình kỹ thuật cho 4 nội dung nghiên cứu:

• Thiết lập quy trình phân lập, kiểm tra đặc tính sinh hóa (API 32 Strep) và giải trình tự gen 16S rRNA định danh vi khuẩn từ mẫu cá bệnh thu thập tại Đồng Nai (SA-12.1, SA-26.1) và Củ Chi - TP.HCM (SA-2.1-CC).
• Quy trình chế biến bột thảo dược, xác định độ ẩm, thực hiện chiết nóng với ethanol 96% và methanol 99,8% ở 60°C trong 120 phút, cô quay chân không thu cao chiết thô.
• Phương pháp khuếch tán giếng thạch sàng lọc 14 dịch chiết và phương pháp đĩa giấy khuếch tán đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thô (so sánh đối chứng Doxycycline 30 µg), kỹ thuật vi pha loãng xác định giá trị MIC và MBC.
• Bố trí thí nghiệm in vivo đánh giá an toàn và tăng trưởng (8 tuần, 7 nghiệm thức thức ăn), thí nghiệm xác định $LD_{50}$ bằng tiêm xoang bụng, và thí nghiệm bảo vệ cá sau 28 ngày ăn bổ sung cao chiết kết hợp cảm nhiễm vi khuẩn.
• Phương pháp xét nghiệm huyết học (đếm hồng cầu, bạch cầu bằng buồng đếm Neubauer), phân loại tế bào máu nhuộm Wright-Giemsa, thử nghiệm hoạt tính thực bào Zymosan và kỹ thuật mô học cắt lát nhuộm H&E đo kích thước nhung mao ruột.
• Quy trình sắc ký TLC và HPLC định tính, định lượng 6-gingerol và cinnamic aldehyde, giải mã trình tự gen MLST và khuếch đại PCR 14 gen độc lực của chủng vi khuẩn.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày các phát hiện thực nghiệm theo 4 nội dung:

• Nội dung 1 - Khả năng kháng khuẩn in vitro:
  • Phân lập và định danh thành công các chủng vi khuẩn S. agalactiae từ cá bệnh tại Đồng Nai và Củ Chi. Kết quả nhuộm Gram và kiểm tra sinh hóa trên kit API 32 Strep xác nhận đặc tính cầu khuẩn Gram dương, tan huyết β, không di động.
  • Sàng lọc 14 loại dịch chiết cho thấy dịch chiết vỏ quế và củ gừng trong cả hai dung môi ethanol 96% và methanol 99,8% thể hiện hoạt tính ức chế vi khuẩn S. agalactiae vượt trội so với các thảo dược còn lại (diếp cá, hành tím, kinh giới, riềng).
  • Khảo sát cao chiết thô dạng đĩa giấy xác định cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng tạo vòng kháng khuẩn rõ rệt đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm. Xác định giá trị MIC và MBC của hai loại cao chiết trong dung môi ethanol và methanol.
• Nội dung 2 - Tăng trưởng và khả năng bảo vệ in vivo:
  • Thí nghiệm cho ăn trong 8 tuần khẳng định việc bổ sung cao chiết gừng và cao chiết vỏ quế ở các liều 10, 20 và 40 g/kg thức ăn không gây ảnh hưởng tiêu cực đến tỷ lệ sống và các chỉ tiêu tăng trưởng (WG, SGR, DWG, FCR) của cá rô phi giống so với nhóm đối chứng.
  • Xác định giá trị $LD_{50}$ của chủng vi khuẩn và phân tích các yếu tố độc lực. Giải trình tự MLST xác định chủng SA-2.1-CC thuộc phức hợp dòng CC283, kiểu trình tự ST283, mang các gen độc lực quan trọng thuộc nhóm bám dính và xâm lấn.
  • Thí nghiệm cảm nhiễm sau 28 ngày cho ăn bổ sung ghi nhận giảm tỷ lệ chết tích lũy ở các nhóm bổ sung thảo dược. Nghiệm thức bổ sung cao chiết vỏ quế ở mức 20 g/kg thức ăn cho hiệu quả bảo vệ cao nhất với tỷ lệ sống tương đối ($RPS$) đạt 51,4%.
• Nội dung 3 - Chỉ tiêu máu, miễn dịch và mô học biểu mô ruột:
  • Cá ở các nghiệm thức bổ sung cao chiết vỏ quế và gừng có mật độ hồng cầu, bạch cầu và tỷ lệ các loại bạch cầu đơn nhân/trung tính duy trì ổn định hoặc tăng nhẹ so với đối chứng.
  • Hoạt tính thực bào (PA) của đại thực bào và bạch cầu trung tính ở nhóm ăn thức ăn bổ sung thảo dược cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng tại các thời điểm kiểm tra sau cảm nhiễm.
  • Phân tích mô học ruột chứng minh cao chiết vỏ quế làm tăng chiều cao nhung mao (VH), chiều rộng nhung mao (VW) và diện tích hấp thu của biểu mô ruột ở cả ruột trước, ruột giữa và ruột sau mà không gây tổn thương hay thoái hóa tế bào niêm mạc.
• Nội dung 4 - Chuẩn hóa hoạt chất và hoạt tính kháng khuẩn theo hoạt chất:
  • Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) và HPLC xác định hàm lượng 6-gingerol trong cao chiết gừng và cinnamic aldehyde trong cao chiết vỏ quế, cũng như hàm lượng thu hồi trong thức ăn thực nghiệm.
  • Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn khẳng định cinnamic aldehyde ở các nồng độ 100 µg/g và 200 µg/g thức ăn có khả năng ức chế và diệt vi khuẩn S. agalactiae.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới của luận án

1. Khẳng định hiệu quả của hai loại nguyên liệu thảo dược gồm vỏ quế (Cinnamomum verum) và củ gừng (Zingiber officinale) khi bổ sung vào thức ăn dưới dạng cao chiết (chiết xuất bằng ethanol 96% và methanol 99,8%) trong việc hỗ trợ nâng cao khả năng kháng bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi giống.
2. Xác định hàm lượng hoạt chất cinnamic aldehyde chứa trong vỏ quế ở mức 100 µg/g và 200 µg/g thức ăn có khả năng kháng vi khuẩn Streptococcus agalactiae.
3. Xác định sự hiện diện của chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây bệnh trên cá rô phi tại huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh thuộc phức hợp dòng CC283, kiểu trình tự ST283 và mang các yếu tố độc lực quan trọng; bổ sung dữ liệu dịch tễ phân tử về kiểu trình tự của các chủng vi khuẩn phân lập tại Việt Nam.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Ứng dụng cao chiết vỏ quế (mức 20 g/kg thức ăn) và cao chiết gừng bổ sung vào thức ăn nuôi cá rô phi giai đoạn giống nhằm nâng cao sức đề kháng, cải thiện cấu trúc nhung mao ruột và giảm thiểu tỷ lệ chết do bệnh liên cầu khuẩn.
• Áp dụng quy trình chiết nóng bằng dung môi ethanol 96% kết hợp cô quay chân không để thu nhận hoạt chất tự nhiên phục vụ chế biến thức ăn thủy sản quy mô trang trại hoặc công nghiệp.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Nghiên cứu mới thực hiện thử nghiệm in vivo ở quy mô phòng thí nghiệm và bể thực nghiệm trên đối tượng cá rô phi vằn giai đoạn giống (4–6 g/con), chưa mở rộng đánh giá trên cá thương phẩm ngoài lồng bè hoặc ao nuôi thương mại diện tích lớn.
• Khảo sát tập trung trên 06 loại thảo dược thu thập tại một số tỉnh phía Nam và Bắc Cạn, chưa bao quát toàn bộ các loài thực vật có tiềm năng dược tính khác.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Thử nghiệm ứng dụng cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng trong điều kiện nuôi lồng bè và ao thâm canh cá rô phi quy mô trang trại để đánh giá hiệu quả kinh tế và tính ổn định của hoạt chất trong môi trường nước tự nhiên.
• Nghiên cứu kết hợp phối trộn tỷ lệ giữa cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng hoặc các hoạt chất tinh khiết (cinnamic aldehyde kết hợp 6-gingerol) nhằm khảo sát khả năng hiệp đồng kháng khuẩn trên diện rộng.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Bệnh học thủy sản, Nuôi trồng thủy sản: Luận án cung cấp quy trình thực nghiệm đồng bộ từ chiết xuất, sàng lọc in vitro (MIC, MBC), thử nghiệm in vivo, cảm nhiễm nhân tạo, đánh giá miễn dịch không đặc hiệu, phân tích mô học ruột đến chuẩn hóa hoạt chất bằng HPLC và định danh kiểu gen vi khuẩn bằng MLST.
• Đối với các nhà sản xuất thức ăn thủy sản và kỹ sư nuôi trồng: Cung cấp thông số kỹ thuật cụ thể về nồng độ bổ sung cao chiết vỏ quế (20 g/kg thức ăn) và hàm lượng cinnamic aldehyde (100–200 µg/g thức ăn) nhằm phát triển các dòng thức ăn chức năng tăng cường miễn dịch cho cá rô phi.
• Đối với cơ quan quản lý dịch bệnh thủy sản: Dữ liệu phân lập và xác định chủng S. agalactiae ST283/CC283 mang các nhóm gen độc lực tại Củ Chi (TP.HCM) là nguồn dữ liệu quan trọng cho công tác giám sát dịch tễ học phân tử bệnh thủy sản tại khu vực Nam Bộ.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Trong 6 loại thảo dược được khảo sát, loại nào có hoạt tính kháng vi khuẩn Streptococcus agalactiae tốt nhất?

Trong 06 loại thảo dược (diếp cá, hành tím, kinh giới, quế, gừng, riềng), cao chiết vỏ thân quế (Cinnamomum verum) và củ gừng (Zingiber officinale) chiết xuất bằng ethanol 96% và methanol 99,8% thể hiện khả năng ức chế và diệt vi khuẩn S. agalactiae tốt nhất ở cả điều kiện in vitro và in vivo.

2. Liều lượng bổ sung cao chiết vỏ quế nào mang lại hiệu quả bảo vệ cao nhất cho cá rô phi giống?

Nghiệm thức bổ sung cao chiết vỏ quế với hàm lượng 20 g/kg thức ăn cho hiệu quả bảo vệ cao nhất đối với cá rô phi giống sau khi cảm nhiễm vi khuẩn S. agalactiae, đạt tỷ lệ sống tương đối ($RPS$) là 51,4%.

3. Việc bổ sung cao chiết quế và gừng vào thức ăn trong 8 tuần có làm suy giảm tăng trưởng của cá rô phi không?

Kết quả thực nghiệm in vivo 8 tuần cho thấy việc bổ sung cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng ở các mức liều 10, 20 và 40 g/kg thức ăn hoàn toàn không gây ảnh hưởng bất lợi đến sự sinh trưởng, tăng trọng khối lượng (WG), tốc độ tăng trưởng tương đối (SGR) và hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) của cá rô phi giống.

4. Chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae phân lập tại Củ Chi, TP.HCM trong luận án thuộc kiểu gen và phức hợp dòng nào?

Chủng vi khuẩn phân lập tại Củ Chi (ký hiệu SA-2.1-CC) được xác định thuộc phức hợp dòng CC283 (Clonal Complex 283), kiểu trình tự ST283 (Sequence Type 283), mang các nhóm gen độc lực bám dính và xâm lấn quan trọng.

5. Hoạt chất chính nào trong vỏ quế được xác định có khả năng kháng vi khuẩn S. agalactiae và ở hàm lượng bao nhiêu?

Hoạt chất cinnamic aldehyde trong vỏ quế được chuẩn hóa và xác định có hoạt tính kháng vi khuẩn S. agalactiae ở hàm lượng 100 µg/g thức ăn và 200 µg/g thức ăn.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Trúc Quyên đã xác định thành công khả năng kháng vi khuẩn Streptococcus agalactiae của cao chiết vỏ quế (Cinnamomum verum) và củ gừng (Zingiber officinale) chiết xuất trong dung môi ethanol 96% và methanol 99,8%. Bổ sung cao chiết vỏ quế ở mức 20 g/kg thức ăn (tương ứng hoạt chất cinnamic aldehyde 100–200 µg/g thức ăn) giúp cá rô phi giống đạt hiệu quả bảo vệ cao nhất ($RPS = 51,4%$), kích thích hoạt tính thực bào và gia tăng diện tích hấp thu của nhung mao ruột mà không làm ảnh hưởng đến sinh trưởng. Đồng thời, công trình đã xác định sự lưu hành của chủng S. agalactiae thuộc dòng CC283/ST283 mang các yếu tố độc lực tại TP. Hồ Chí Minh, cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn cho giải pháp sử dụng thảo dược thay thế kháng sinh trong nuôi cá rô phi bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỎNG QUAN 1. Tống quan về cá rô phi 1. Phân loại khoa học và nguồn gốc Cá rô phi (Oreochromis spp.) thuộc bộ Perciformes, họ Cichlidae va là tên chung được dùng cho ba chi cá được phân loại dựa trên tập tinh sinh san va nuôi gitr con (Beveridge va McAndrew, 2012) gom: Oreochromis, Sarotherodon va Tilapia; bao gồm hơn 70 loài, trong đó có ít nhất tám loài được đưa vào nuôi (GISD, 2023). Hiện nay, cá rô phi chiếm khoảng 3,5% tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản toàn cầu.

Cá rô phi van (Oreochromis niloticus) là loài được nuôi phổ biến nhất (Gupta va Acosta 2004), thịnh hành nhất vào năm 1960 - 1980. Cá rô phi van từ Nhat Ban được du nhập vào Thái Lan năm 1965, và từ Thái Lan, chúng được đưa đến Philippines; được đưa vào Brazil vào năm 1971, và từ Brazil được đưa đến Hoa Kỳ vào năm 1974. Năm 1978, cá rô phi vằn được đưa vào Trung Quốc (FAO, 2009). Ở Việt Nam, cá rô phi sẻ (Oreochromis mossambicus) là loài rô phi đầu tiên được người Pháp mang đến vào năm 1953, đến năm 1973 thì cá rô phi vằn được nhập vào từ Đài Loan và trở thành loài rô phi nuôi chính tại Việt Nam hiện nay (Đỗ Đoàn Hiệp và Lê Đình Xuân, 2006).

Bên cạnh cá rô phi van, cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) cũng là đối tượng nuôi phổ biến ở khu vực Đông Nam Bộ và Đồng bằng sông Cửu Long sau khi được nhập từ Malaysia vào năm 1985 (Phạm Hồng Quân, 2013).2 Đặc điểm sinh học Cá rô phi tăng trưởng tối đa ở nhiệt độ từ 25 đến 30°C (Meyer 2002). Khả năng chịu nhiệt độ nước va độ mặn rất khác nhau giữa các loài. Cá rô phi van (O. niloticus) chịu lạnh kém nhất và thích khí hậu nhiệt đới hơn cận nhiệt đới.

Cá rô phi xanh (O. aureus) có thé chịu được nhiệt độ thấp tới 8-9°C nên có nhiều khả năng sinh sống ở các quốc gia có sự thay đối nhiệt độ theo mùa rõ rệt (Gupta và Acosta, 2004). Cá rô phi là loài ăn tạp, ăn thực vật phù du, thực vật thủy sinh, động vat không xương sống nhỏ, động vật đáy, mảnh vụn và màng vi khuẩn liên quan đến mảnh vụn. Cá nuôi ao thanh thục sinh dục sau 5-6 tháng và sinh sản bắt đầu khi nhiệt độ nước đạt 24°C.

Con cái trưởng thành đẻ trứng trong 6, sau khi được con đực thụ tinh, con cai lập tức thu trứng vào miệng dé ap cho đến khi túi noãn hoàng được hấp thụ (khoảng 1 đến 2 tuần tùy thuộc vào nhiệt độ nước). Số lượng trứng tỷ lệ thuận với trọng lượng cơ thể của con cái và ít hơn so với hầu hết các loài cá nuôi trong ao khác. Nếu quá trình sinh sản không bị kìm hãm (do thời tiết lạnh), con cái có thé sinh sản liên tục. Cá rô phi có thé sống lâu hơn 10 năm và dat trọng lượng trên 5 kg (FAO, 2009).

Tinh hình sản xuất cá rô phi trên thé giới va ở Việt Nam Cá rô phi thích nghĩ tốt với môi trường nuôi nhân tạo, tăng trọng nhanh ở điều kiện tối ưu và sinh sản trong trang trại mà không cần quản lý hoặc cơ sở hạ tầng đặc biệt (Meyer, 2002). Nuôi cá rô phi là loại hình phố biến nhất trong nuôi trồng thủy sản trên thế giới, với sản lượng khoảng 3,5 triệu tấn và được báo cáo trong ít nhất 135 quốc gia và vùng lãnh thổ trên tất cả các châu lục (FAO, 2014). Hơn 90% cá rô phi nuôi được sản xuất ở các nước đang phát triển, chủ yếu ở châu Á với hai loài chính là cá rô phi van (O. niloticus) và cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.

Một số quốc gia có sản lượng nuôi cá rô phi lớn có thê kê đên như: Trung Quoc (quôc gia nuôi trông và chiêm hơn 30% sản lượng cá rô phi toàn cầu năm 2015), Indonesia, Ai Cập, Philippines, Thai Lan và Việt Nam (FAO, 2017). Cá rô phi là một trong 15 loài nuôi thủy san chính trên toàn thế giới cả trong nước ngọt và nước mặn/lợ; sản lượng nuôi nước ngọt toan cầu tăng từ 1.001,5 ngàn tan (2000) lên 4. Việt Nam là nước sản xuất nuôi trồng thủy sản lớn thứ 4 thế giới, sau Trung Quốc, Ấn Độ và Indonesia. Tại Việt Nam, diện tích nuôi cá rô phi ngày càng mở rộng và gia tăng về sản lượng.

Năm 2015, diện tích nuôi cá rô phi khoảng 25.400 ha với sản lượng 182.000 tan sản phẩm (Boerlage va ctv, 2017). Theo quy hoạch phát triển nuôi cá rô phi định hướng đến năm 2030, cá rô phi được xác định là sản phẩm chủ lực sau tôm nước mặn, lợ và cá tra (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2016) với diện tích nuôi cá rô phi cả nước đạt 40.000 ha (tăng 1,6 lần so với năm 2015 là 25.400 ha) và 1,8 triệu m lồng nuôi trên hệ thống sông và hồ chứa lớn; sản lượng đạt 400.000 tan (tăng 2,2 lần so với năm 2015 là 182.000 tan) trong đó 45 - 50% san lượng đủ tiêu chuẩn xuất khâu. Bên cạnh đó, Việt Nam là nước xuất khâu thủy sản lớn thứ ba thế giới ké từ năm 2014 (FAO, 2018 và 2022). Năm 2020, giá trị hàng hóa thủy sản xuất khẩu của Việt Nam đạt 8,5 tỷ USD, chiếm 5,6% tổng giá trị toàn cau (FAO, 2022).

Thời gian qua, từ một loài cá chủ yếu tiêu thụ nội địa, cá rô phi đã trở thành một trong các đối tượng xuất khâu với số lượng thị trường tăng từ 8 lên 68 nước, chủ yêu gồm Mỹ, Colombia và EU (Boerlage và ctv, 2017). Tống quan về vi khuẩn S. Đặc điểm hình thái, sinh hóa Streptococcus agalactiae (hay liên cầu nhóm B — Group B Streptococcus, GBS) là một loài thuộc chi Streptococcus, lần đầu tiên được phân biệt với các liên cầu khuẩn khác bởi Lancefield (1933) sau khi được phân lập từ sữa và bò bị viêm vú. Đây là một loại vi khuân Gram đương, có dạng hình cầu hoặc hình trứng với kích thước đường kính từ 0,5 đến 2,0 um, không di động, không sinh nha bao, ky khí tùy tiện, âm tính với oxidase và catalase (Amal và Zamri-Saad, 201 1).

agalactiae (Nguồn: https://www.gov/streplab/groupb-strep/index. Triệu chứng lam sang va bệnh tích Vi khuan S. agalactiae được truyền từ cá bệnh sang cá khỏe thông qua con đường hấp thụ lại qua đường miệng phân có chứa vi khuẩn được cá bệnh thải ra môi trường (Amal và Zamri-Saad, 2011) hoặc tiếp xúc trực tiếp với cá bệnh hoặc cá chết, cũng như tiếp xúc gián tiếp qua nước trong các hệ thống nuôi (Boerlage và ctv, 2017). Bệnh liên cầu khuẩn ở cá do S.

agalactiae gây ra có đặc điểm là nhiễm trùng huyết và viêm mang não (Mian và ctv, 2009). Khi cá bị nhiễm vi khuẩn S. agalactiae sẽ xuất hiện một số dấu hiệu như: cơ thể sam mau, giảm ăn, khả năng bắt môi kém, phản ứng chậm với tiếng động, boi mat phương hướng, bất thường (xoắn ốc, xoay vòng) và tập trung trên mặt nước, tuy nhiên không phải tất cả cá bị nhiễm bệnh đều có biểu hiện bất thường (Yanong, 2002); mắt lồi, đục và xuất huyết, những trường hợp bệnh nặng mắt có thể bị rơi ra khỏi hốc mắt, bên trong có chứa dịch màu vàng; xuất huyết trên thân hoặc ở gốc vây, xương nắp mang; các nội quan gan, thận và tỳ tạng sưng to, mềm nhũng và xuất huyết; bụng trương to (Musa và ctv, 2009). san sinh các loại enzyme ngoại bao (fibrinolysin, hyaluronidase, DNase,.) và các độc tố ngoại bao (streptolysine O, streptolysine S,.) giúp vi khuân xâm nhập vao hệ thống máu va các cơ quan bên trong cơ thé.

Trên bề mặt Streptococcus spp. tồn tại chất gọi là protein M liên quan đến sự dé kháng quá trình thực bao của bạch cầu trung tính (Phạm Hồng Sơn, 2008). Ở giai đoạn cấp tính, vi khuẩn xâm nhập vào hệ thống máu và tất cả các cơ quan nội tạng (Chang và Plumb, 1996), do đó khi tiến hành mồ cá bệnh sẽ thấy bên trong cơ thể xuất hiện nhiều vùng bị hoại tử, tỳ tạng tăng lên về thể tích, gan nhạt, xuất huyết não (Wanman và ctv, 2005). Trên cá rô phi van nhiễm S.

agalactiae mãn tính, quan sát trong phần cơ nằm sát phần xương sống thấy có sự xuất hiện của các khối u (màu vàng nâu hoặc màu đỏ sam) (Siti-Zahrah và ctv, 2004). Phân nhóm và độc lực của vi khuẩn S. Phần nhóm Phương pháp phân tích kiểu hình (kiểu huyết thanh, serotype) bằng cách dựa vào cấu trúc lớp vỏ capsular polysaccharide (CPS) được dùng dé phân nhóm va đánh giá độc lực của vi khuẩn S. Cho đến nay, vi khuẩn S.

agalactiae có tổng số 10 kiểu huyết thanh được công nhận gồm Ia, Ib và II đến IX (Delannoy và ctv, 2021), mỗi kiểu huyết thanh có đặc tính độc lực khác nhau (Imperi và ctv, 2010). Trên động vật thủy sản, hiện có 6 kiểu huyết thanh được xác định gồm: Ia, Ib, II, II, IX (Zhang va ctv, 2018) và IV (Delannoy và ctv, 2021); trong đó các kiểu Ia, Ib, II và III là phố biến nhất trong nhiễm trùng trên cá rô phi (Zhang, 2021) và kiêu huyết thanh IX có khả năng trở thành một chủng truyền nhiễm chính đối với cá rô phi (Zhang, 2018). Bên cạnh đó, vi khuẩn S. agalactiae còn có thé phân nhóm theo kiểu gen (sequence types, ST, kiểu trình tự gen), bằng cách xác định phân loại nhỏ hơn đưới loài bằng giải trình tự gen đa điểm (multi-locus sequence typing, MLST) (Kannika và ctv, 2017).349 loại trình tự trên toàn thế giới (PubMLST, 2019) nhưng các ST được tìm thấy từ S.

agalactiae được phân lập từ cá chỉ bao gồm sáu loại: ST7, ST260, ST261, ST283, ST491 và ST500 (Delannoy và ctv, 2013; Kayansamruaj và ctv, 2019). Cho đến nay, các chủng phân lập được từ cá luôn được phát hiện thuộc về ba phức hợp chủng riêng biệt (clonal complex, CC), mỗi phức hợp còn liên kết với một kiêu huyết thanh khác nhau, gồm CC7 với kiểu huyết thanh Ia (CC7/Ia), CC283 với kiểu huyết thanh II (CC283/II) và CC552 với kiểu huyết thanh Ib 10 (CC552/Ib) (Delannoy va ctv, 2021). Chung có kiểu huyết thanh Ia (thuộc CC7) có thể được tìm thấy ở cá và ếch, với phạm vi phân bố từ Tây Châu Á đến Đông Nam A và Trung Quốc; trong khi đó chủng có kiểu huyết thanh Ib (thuộc CC552) cũng được tìm thấy ở cá và ếch nhưng phân bồ rộng rãi trên toàn cầu và xuất hiện ở châu Mỹ, Châu Phi, Trung Đông, Châu Âu và Úc. Kiểu huyết thanh III là duy nhất liên quan đến CC283, tìm thấy cả ở người và các loài biến nhiệt, chủ yếu xảy ra ở Đông Nam Á (Phuoc và ctv, 2021).

Ngoài ra, năm 2021, Delannoy và ctv đã ghi nhận nhiều đợt bùng phát bệnh do S. agalactiae CC2/IV ở cá rô phi nuôi tại Bắc Phi.