Chương 1 TỔNG QUAN 1. Đặc điểm sinh vật học của nấm Cryptococcus neoformans 1.1 Lịch sử phát hiện Cryptococcus neoformans là một loại nấm men được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1894 ở Ý bởi F. Sanfelice từ một loại nước ép quả đào. Cùng năm đó, trong một nghiên cứu bệnh học ở Đức, Otto Busse phân lập được nấm từ tổn thương xương chày của một bệnh nhân và lần đầu tiên C.
neoformans được xác định là một tác nhân gây bệnh cho con người. Một năm sau, bác sĩ phẫu thuật Abraham Buschke cũng phân lập được loại nấm này từ một bệnh nhân tương tự [45], [52], [76]. Những năm sau đó, đã có nhiều báo cáo về loại nấm này trên các bệnh nhân ung thư. Năm 1905, Von Hansemann đã giới thiệu ca bệnh viêm màng não do nấm C.
neoformans đầu tiên [52]. Tiếp theo đó, người ta mô tả những ca nhiễm trùng do C. neoformans ở phổi, thận và nhiều cơ quan khác. Ban đầu, loại nấm này mang nhiều tên gọi khác nhau như: Saccharomyces hominis, Cryptococcus hominis, Torula histolytica, Debaryomyces hominis.
Sau đó, tên nấm được thống nhất gọi là Cryptococcus neoformans theo tác giả F. Trước đây, người ta cho rằng nấm C. neoformans có 2 giống, đó là C. Hiện nay, người ta đã khẳng định có 3 giống C.
neoformans là grubii (typ A), gattii (typ B, C) và neoformans (typ D), trong đó C. gattii đang dần được coi là một loài riêng biệt gọi tên là C. neoformans còn được gọi là Filobasidiella neoformans [45], [52], [67]. Đặc điểm sinh vật học.
Đặc điểm hình thể. neoformans là một loại nấm có hình thái thay đổi tùy theo điều kiện sống hoặc nuôi cấy [9]. Kiểu hình thái chính của C. neoformans là nấm men, đường kính tế bào khoảng 5-10 µm, được bao ngoài bởi một nang (capsule) hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thước nang thay đổi từ 1-50 µm [52], [62].
Hình ảnh nấm C.neoformans dạng men khi Hình ảnh dạng sợi của nấm C.neoformans khi nhuộm mực tàu nuôi cấy ở 25 0C Trích ảnh: Gross L, PLoS Biology Vol. Trích ảnh : VTCC-Y-0479 4/12/2006, e427. Hình ảnh nấm C. neoformans Khi nhuộm Gram, tế bào nấm bắt màu Gram dương với những tế bào nấm hình bầu dục, được bao quanh bởi một vách mỏng, đường kính thay đổi.
Có những tế bào nấm nảy chồi có thể quan sát được. Khi nhuộm bằng mực tàu, C. neoformans xuất hiện như những vòng tròn có quầng sáng bao quanh trên nền tối [47]. Trong những điều kiện nhất định (khi nuôi cấy ở 25 0C, với điều kiện dinh dưỡng thấp, khô, trong bóng tối và có sự kích thích của pheromone), nấm C.
neoformans có những kiểu hình dạng khác như hình sợi và giả sợi. Ở kiểu 5 hình giả sợi, các sợi nấm có thể uốn quăn lại, hoặc thẳng, hoặc hình vòng với độ dài từ 15-150µm và chúng phân nhánh với số lượng nhánh khác nhau [54], [75]. Tính chất nuôi cấy C. neoformans có thể mọc trên môi trường thạch Sabouraud dextrose, thạch máu cừu, thạch chocolate và các môi trường khác ở nhiệt độ từ 20-37 0C trong vòng 48h - 72h.
Tuy nhiên, nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 370C [52], [54]. neoformans phát triển tốt trong môi trường chứa khoảng 5 % CO2, pH hơi kiềm và một lượng nhỏ chất sắt. Môi trường nuôi cấy có một lượng nhỏ chất sắt có tác dụng kích thích tổng hợp các capsule của nấm [52], [ 79]. Trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở 25-370C, nấm C.
neoformans mọc thành các khuẩn lạc lồi, mịn, nhày, màu trắng hoặc màu kem, đường kính có thể đến vài milimet [52], [61]. Trên môi trường thạch Niger Seed, nấm mọc thành những khuẩn lạc lồi, nhày và có màu vàng hoặc vàng nâu [76]. Khuẩn lạc nấm C.neoformans trên Khuẩn lạc nấm C. neoformans trên thạch thạch Bird Seed Sabouraud Trích ảnh: Red Book Online Visual Library, Trích ảnh: Mycology online 2009 Hình 2.
Khuẩn lạc nấm C. neoformans trên môi trường nuôi cấy C. neoformans tăng trưởng nhanh hay chậm phụ thuộc vào chủng và điều kiện nuôi cấy. Một vài môi trường có chứa chất xycloheximid, nồng độ glucose cao hoặc sự có mặt của một số vi khuẩn như Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis và Proteus vulgaris cũng có khả năng ức chế sự phát triển của nấm [76].
6 Các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ thẩm thấu, nồng độ CO 2, độ pH ảnh hưởng tới sự phát triển của các capsule. Nhiệt độ cao từ 39 - 40 0C hoặc quá thấp ức chế sự tăng trưởng của nấm. Nồng độ CO2 ở mức sinh lý làm tăng tổng hợp và kích thước capsule, ở nồng độ CO2 cao nấm chỉ sản suất các capsule với kích thước nhỏ. Môi trường có độ thẩm thấu cao (chứa glucose 16% hoặc NaCl 2,9%), hoặc pH acid sẽ làm giảm sản xuất các capsule [52], [79], [80].
Tính chất hóa sinh Tính chất hóa sinh có sự khác nhau giữa các chủng nấm, điều này có thể được sử dụng làm các xét nghiệm để nhận biêt chủng nấm gây bệnh trên bệnh nhân. Tất cả các loài C.neoformans đều không lên men với lactose, maltose, galactose, trehalose, dulcite, salicin, sorbitol, adonitol hoặc inulin; nấm có khả năng thủy phân tinh bột, đồng hóa inositol, sản xuất protease [52], [61]. gatti kháng với canavanine và có khả năng đồng hóa glycin nên phát triển trên môi trường canavanine glycine bromothymol blue, chúng làm thay đổi màu của môi trường từ màu vàng sang màu xanh, còn C. neoformmans thì không có tính chất này [52], [76].
neoformans có khả năng tổng hợp creatinin determinase, urease và diphenol oxidase [52]. Kháng nguyên và yếu tố độc lực Các chủng C. neoformans khác nhau về độc tính đối với động vật. Độc tính của nấm là do nhiều yếu tố gây nên, độc tố làm tăng mức độ sinh bệnh của nấm.
Các yếu tố độc lực của nấm C. neformans được nhắc đến ở đây bao gồm: capsule, các sản phẩm cryptoccocal (polysaccharide capsule và các thành phần ngoại tế bào), melanin, manitol và các yếu tố như superoxide dismutase, proteases, phospholipase B, và lysophospholipase [44]. Capsule (nang) 7 Yếu tố độc lực chính của C. neoformans là những polysaccharides của capsule mà thành phần chính là glucuronoxylomannan (GXM), ngoài ra còn có galactoxylomannan (GalXM) và mannoprotein (MP).
Các capsule được tổng hợp từ tế bào chất của tế bào nấm, kích thước thay đổi tùy thuộc vào chủng và điều kiện môi trường phát triển [28], [76], [62]. Vào năm 2004, Zaragoza đã nghiên cứu và nhận thấy rằng nồng độ glucose cao có tác dụng ức chế sự phát triển của capsule trong khi môi trường có ít dinh dưỡng với mật độ loãng của dextrose ở pH 7,3 có tác dụng tăng cường sản xuất các capsule [79]. Rất khó để có thể nghiên cứu cấu trúc của các capsule bởi vì các kỹ thuật kính hiển vi điện tử đã làm thay dổi cấu trúc của tế bào nấm men, bởi vậy người ta xác định các thành phần của capsule bằng kỹ thuật cộng hưởng từ hạt nhân [25], [76]. Capsule có tác dụng giúp tế bào nấm né tránh sự thực bào của đại thực bào, bạch cầu mono và bạch cầu trung tính bằng cách trình bày một bề mặt làm cho các tế bào thực bào không thể nhận biết và tiêu diệt được.
Các capsule của tế bào nấm tích điện âm trên bề mặt và gây ra một lực đẩy tĩnh điện giữa các vi sinh vật, vì vậy làm giảm khả năng gắn kết và thực bào của các tế bào thực bào [44]. Mặt khác, các capsule ngăn cản cảm ứng trực tiếp của cơ thể vật chủ với các thành phần của tế bào nấm, làm sản xuất thiếu các cytokine. TNFα là cần thiết cho phản ứng miễn dịch bảo vệ cơ thể chống lại C. neoformans, sự sản xuất thiếu TNFα sẽ ngăn chặn phản ứng miễn dịch của cơ thể và làm cho bệnh tiến triển nặng lên.
Vai trò của IL-1β4, IL-6 trong phản ứng miễn dịch chống lại C. neoformans còn chưa được xác định rõ nhưng có nhiều khả năng sự thiếu hụt của 2 cytokin này làm giảm đáp ứng miễn dịch của vật chủ và tạo điều kiện thuận lợi cho nhiễm cryptoccoci [44]. Như vậy, các capsule là cần thiết giúp cho tế bào nấm sống sót được trong các 8 tế bào thực bào. Nó còn có tác dụng hoạt hóa bổ thể, làm giảm đáp ứng với kháng thể và ức chế di chuyển bạch cầu [23], [24], [52], [76].
Người ta nghiên cứu và thấy rằng các capsule được phân tách một cách tự do hoặc các capsule đột biến có độc tính kém hơn capsule của các chủng hoang dại. Những ca bệnh do nhiễm các capsule tự do hoặc các capsule nhỏ có một đáp ứng viêm mạnh từ phía vật chủ và ít gây bệnh nặng hơn. Kích thước của các capsule trong ống nghiệm và trong cơ thể sống khác nhau làm cho độc lực cũng khác nhau nhưng độc lực không tương quan hoàn toàn với kích thước capsule. Capsule là cần thiết nhưng một mình nó không đủ khả năng gây bệnh [52].
Capsule được mã hóa bởi các gene cap10, cap59, cap60 và cap64. Gene đầu tiên của capsule được tìm thấy là gene cap59, nó có mặt ở tất cả các giống C. neoformans, nó quy ước kiểu hình và độc tính của nấm. Nếu thiếu một gene capsule nào đó do kết quả của đột biến, các tế bào nấm sẽ dễ dàng bị bắt và nuốt bởi bạch cầu trung tính và đại thực bào có mặt trong máu.
Chức năng của các gen capsule, đặc biệt gene cap59 là trao đổi chất với ngoại bào hoặc tiết một số hợp chất, chủ yếu là GXM [28], [29], [52]. Cả 3 kháng nguyên GXM, GalXM, MP đều phân tách được từ môi trường nuôi cấy nhờ phương pháp lọc tủa với ethanol và một số hợp chất khác nhau của hexadecyltrimethylammonium bromide và chúng khác nhau giữa các týp huyết thanh, trong đó GXM và MP có hiệu quả riêng rẽ trên hệ thống miễn dịch [17]. GXM (glucuronoxylomannan) là kháng nguyên cơ bản , đặc trưng cho từng týp huyết thanh, là cấu trúc lớp ngoài của capsule. Người ta dựa vào kháng nguyên này để phân C.
neoformans ra thành các týp A, B, C, D, AD. Người ta có thể tạo được kháng thể đơn dòng kháng lại GXM tinh khiết hoặc kết hợp, phản ứng đặc biệt với GXM trong enzyme miễn dịch. Các tài liệu 9 này chứng minh vai trò quan trọng của GXM trong việc quy định tính đặc thù của các týp huyết thanh. Cấu tạo của GXM bao gồm các thành phần liên kết với nhau là α-D-mannopyranan, β-D-xylopyranosyl (Xylp), P-D- glucopyranosyluronic acid (GlcpA) và 6-O-acetyl substituents.
Tùy theo cách sắp xếp với số lượng khác nhau của các thành phần trên mà tạo ra các kiểu typ huyết thanh khác nhau [17]. GXM dưới điều kiện thích hợp có tác dụng ức chế cả đại thực bào và sản xuất kháng thể.