Luận văn: Xác định Methanol, Ethanol và sản phẩm chuyển hóa trong rượu, huyết tương người

Luận văn thạc sĩ trình bày phương pháp phân tích định lượng methanol, ethanol trong rượu và huyết tương người, ứng dụng trong chẩn đoán ngộ độc.

• Tác giả: Nguyễn Thị Ngân
• Người hướng dẫn: PGS. Tạ Thị Thảo
• Trường học: Trường Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
• Đề tài: Xác định Metanol, Etanol và các Sản phẩm Chuyển hóa của chúng trong Rượu và Huyết tương Người
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Xác Định Metanol và Ethanol Trong Rượu

Xác định metanol và ethanol là một lĩnh vực quan trọng trong hóa phân tích và pháp y học. Luận văn của Nguyễn Thị Ngân tập trung vào việc phát triển các phương pháp xác định chính xác các chất này trong rượu và huyết tương người. Metanol và ethanol là những hợp chất có công thức cấu trúc tương tự nhưng tác dụng sinh học hoàn toàn khác nhau. Ethanol là loại cồn có trong rượu bia thông thường, trong khi metanol là độc chất gây ngộ độc nguy hiểm. Việc phân biệt và định lượng hai chất này có ý nghĩa sâu sắc đối với chẩn đoán ngộ độc metanol, kiểm soát chất lượng sản phẩm rượu, và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Luận văn này đề xuất các phương pháp phân tích hiện đại và kỹ thuật mới để nâng cao độ chính xác của xét nghiệm.

1.1. Giới Thiệu Chung Về Metanol Và Ethanol

Metanol (CH₃OH) và ethanol (C₂H₅OH) là những alcohol aliphatic đơn giản có tính chất hoá học tương tự. Tuy nhiên, metanol độc hại với cơ thể người, gây tổn thương thần kinh, mù mắt, thậm chí tử vong. Ethanol là loại cồn có trong rượu thông thường, được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và tiêu dùng. Sự khác biệt về cấu trúc phân tử nhỏ nhưng lại tạo ra những khác biệt lớn trong tác động sinh học, làm cho việc xác định chính xác trở nên cấp thiết.

1.2. Ý Nghĩa Y Học Của Xác Định Chính Xác

Việc xác định metanol, ethanol và sản phẩm chuyển hóa trong rượu và huyết tương có ý nghĩa sức khỏe công cộng rất lớn. Các trường hợp ngộ độc metanol qua thực phẩm giả hoặc rượu kém chất lượng gây ra các biến chứng nặng nề. Phương pháp xác định nhanh và chính xác giúp các bác sĩ có thể chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời, cứu sống bệnh nhân.

II. Phương Pháp Phân Tích Metanol Và Ethanol

Luận văn của Nguyễn Thị Ngân giới thiệu nhiều phương pháp phân tích hiện đại cho xác định metanol và ethanol. Phương pháp 1H-NMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân) được xem là kỹ thuật tiên tiến, cho phép xác định định tính và định lượng các chất với độ chính xác cao. Ngoài ra, luận văn cũng phát triển phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis cho việc xác định nhanh metanol trong phòng thí nghiệm. Các kỹ thuật tủa protein và xử lý mẫu sinh học được áp dụng để chuẩn bị mẫu huyết tương một cách tối ưu. Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng, cần lựa chọn phù hợp với điều kiện thực tế và yêu cầu của từng bài toán phân tích.

2.1. Phương Pháp 1H NMR Trong Xác Định

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR là phương pháp hiện đại cho phép xác định cấu trúc phân tử và định lượng chất. Phương pháp này có thể phân biệt rõ ràng metanol với ethanol dựa trên sự khác biệt trong các tín hiệu NMR. Ưu điểm là độ chính xác cao, không cần đối chứng phức tạp, có thể xác định đồng thời nhiều chất trong một mẫu.

2.2. Phương Pháp Quang Phổ UV Vis

Phương pháp quang phổ hấp thụ sử dụng tác chất axit chromotropic tạo phức màu với metanol. Phương pháp này nhanh chóng, chi phí thấp, thích hợp cho xét nghiệm lâm sàng. Luận văn khảo sát chi tiết các điều kiện tối ưu như nồng độ chất oxi hóa, thời gian phản ứng, để nâng cao độ chính xác của phương pháp.

III. Chế Tạo Test Kit Xác Định Metanol

Một trong những đóng góp quan trọng của luận văn là chế tạo test kit thử nhanh metanol trong rượu và huyết tương người. Test kit được thiết kế dựa trên nguyên tắc tạo phức màu giữa metanol với axit chromotropic dưới tác dụng của chất oxi hóa KMnO₄. Luận văn tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nồng độ ethanol, lượng chất oxi hóa, các chất độn, đến kết quả phân tích. Test kit được thiết kế để dễ sử dụng, không yêu cầu thiết bị phức tạp, phù hợp cho các phòng xét nghiệm địa phương. Quy trình sử dụng rõ ràng, có bảng so màu tiêu chuẩn để giúp xác định nồng độ metanol nhanh chóng, hỗ trợ hiệu quả cho công tác phòng ngộ độc.

3.1. Quy Trình Chế Tạo Và Tối Ưu Hóa

Chế tạo test kit bao gồm việc lựa chọn các thành phần phù hợp, xác định tỷ lệ từng chất, và kiểm định độ ổn định. Luận văn khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố như thứ tự thêm thuốc thử, thời gian ổn định màu, nồng độ formaldehit. Kết quả cho thấy kit có khoảng hoạt động từ 0-5000 mg/L metanol, phù hợp với thực tế chẩn đoán.

3.2. Ứng Dụng Trong Huyết Tương Người

Test kit metanol trong huyết tương cần cải tiến để tránh sự ảnh hưởng của protein máu. Luận văn nghiên cứu kỹ các phương pháp tủa protein hiệu quả. Kit được điều chỉnh đặc biệt để phù hợp với nền mẫu phức tạp của huyết tương, đảm bảo độ chính xác cao và có thể ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng.

IV. Kết Quả Và Ứng Dụng Thực Tiễn

Luận văn của Nguyễn Thị Ngân đạt được nhiều kết quả quan trọng và có ứng dụng thực tiễn cao. Các phương pháp xác định metanol được phát triển đã được kiểm định độ chính xác, độ lặp lại, và khoảng tuyến tính. Test kit thử nhanh được chế tạo có thể sử dụng trực tiếp tại các bệnh viện địa phương mà không cần thiết bị phức tạp. Kết quả nghiên cứu có thể hỗ trợ trong công tác kiểm soát chất lượng rượu, phòng ngộ độc metanol trong cộng đồng, và hỗ trợ chẩn đoán lâm sàng. Luận văn cũng đóng góp những kiến thức mới trong lĩnh vực hóa phân tích ứng dụng cho y tế pháp y tại Việt Nam.

4.1. Hiệu Quả Kiểm Chứng Phương Pháp

Các phương pháp xác định metanol, ethanol trong luận văn đã được kiểm chứng chi tiết. Độ chính xác đạt trên 95%, độ lặp lại tốt với RSD < 5%. Khoảng tuyến tính phù hợp cho nhu cầu chẩn đoán lâm sàng và kiểm soát chất lượng. Các kết quả này khẳng định giá trị khoa học của những phương pháp được đề xuất.

4.2. Tiềm Năng Ứng Dụng Tại Địa Phương

Test kit thử nhanh có thể được sản xuất hàng loạt và phân phối đến các bệnh viện, trạm y tế. Công cụ này giúp kiểm soát rượu giả, phát hiện ngộ độc metanol sớm. Với chi phí thấp và quy trình đơn giản, kit có tiềm năng lớn trong bảo vệ sức khỏe cộng đồng tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Metanol và Etanol là 2 ancol thƣờng gặp nhất và đƣợc ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp và đời sống. Mặc dù có nhóm chức rƣợu nhƣng metanol không dùng để uống nhƣ rƣợu etanol. Phơi nhiễm metanol qua đƣờng uống, đƣờng hít hoặc thậm chí tiếp xúc qua da, nếu số lƣợng đủ lớn có thể gây ra ngộ độc nặng nề. Trong đó ngộ độc qua đƣờng tiêu hóa là hay gặp nhất [4].

Trên thế giới, báo cáo ca lâm sàng ngộ độc metanol đầu tiên từ năm 1855 bởi MacFarlan, với triệu trứng nhƣ thở nhanh sâu, toan chuyển hóa, rối loạn ý thức từ lú lẫn đến hôn mê, suy thận cấp và tụt huyết áp [5]. Sau đó, có rất nhiều báo cáo về ngộ độc đƣợc công bố [4],[ 10],[ 16]. Tất cả đều để lại hậu quả nặng nề với tỉ lệ tử vong rất cao: 18 –56,3 %. Nhiều trƣờng hợp sống sót thì di chứng giảm hoặc mất thị lực và tử vong một thời gian sau do di chứng thần kinh tiến triển nặng lên.

Ở Việt Nam, tại Trung tâm Chống độc – Bệnh viện Bạch Mai, trong năm 2014 đã tiếp nhận và điều trị 16 ca, năm 2015 số ca ngộ độc là 33 ca và năm 2016 lên tới 46 ca ngộ độc metanol và trong 6 tháng đầu năm 2017 số ca ngộ độc đã tăng lên tới 48 ca. Đáng báo động là một số vụ ngộ độc tập thể có tính chất nghiêm trọng nhƣ tại Lai Châu vào tháng 2 năm 2017 với 40 ngƣời ngộ độc metanol sau khi uống rƣợu tại 1 đám cƣới trong đó có 9 ngƣời đã tử vong do nồng độ metanol quá cao. Tháng 3 năm 2017 tại Hà nội, 9 BN quê Gia Lai bị ngộ độc metanol do uống rƣợu không rõ nguồn gốc. Trong mẫu bệnh phẩm bệnh nhân uống có thể chứa etanol, metanol và các andehit và axit tƣơng ứng.

Tuy nhiên, BN ngộ độc chủ yếu do bởi metanol khi vào cơ thể chuyển hóa thành axit fomic. Trong các phác đồ điều trị ngộ độc metanol, etanol đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc giải độc nhằm hạn chế sự chuyển hóa của metanol thành axit fomic, sau đó các chất độc này sẽ loại bỏ ra khỏi cơ thể nhờ phƣơng pháp lọc máu hấp phụ. Do vậy, để tiên lƣợng mức độ nặng cũng nhƣ đƣa ra phác đồ điều trị hợp lý cho bệnh nhân, cần phải xác định nhanh nồng độ của 1 metanol etanol và các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong huyết tƣơng BN ngay khi nhập viện cũng nhƣ trong quá trình điều trị. Để xác định nhanh BN nhiễm metanol, một số nƣớc trên thế giới, đã sản xuất các test thử metanol trong rƣợu và máu, chủ yếu dựa trên phản ứng oxi hóa chọn lọc metanol bằng chất oxi hóa khi có enzym đặc hiệu sau đó tạo phức màu với thuốc thử hữu cơ thích hợp, có kết hợp với thang đo màu để bán định lƣợng.

Tuy nhiên, khi về Việt Nam giá thành của các bộ kit tăng lên đáng kể và khó đặt mua, đặc biệt enzym rất dễ bị mất hoạt tính trong điều kiện phòng thí nghiệm. Ở Việt Nam cũng đã có bộ kit thử nhanh phân tích metanol trong rƣợu của Bộ Công An nhƣng chƣa đƣợc ứng dụng xác định metanol trong huyết tƣơng. Để định lƣợng metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa của chúng, trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng phƣơng pháp GC-MS, GC-FID, điện thế, pp điện di mao quản. Các phƣơng pháp này có độ nhạy tốt, tuy nhiên việc xử lý mẫu lại phức tạp và thời gian phân tích tƣơng đối dài.

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton [1H-NMR] là một trong những phƣơng pháp tỏ ra rất tối ƣu để giải quyết cho vấn đề này. Đây là phƣơng pháp phân tích hiện đại, mới đƣợc phát triển gần đây với độ đúng cao, có thể phân tích đƣợc đồng thời các chất và tiết kiệm thời gian phân tích do quá trình xử lí mẫu rất đơn giản. Trƣớc tình hình ngộ độc metanol ngày càng diễn biến phức tạp và có xu hƣớng gia tăng song cho đến nay tại Trung tâm Chống độc chƣa có quy trình xác định nhanh metanol, etanol trong máu và rƣợu để kịp thời đáp ứng trong chẩn đoán và điều trị bệnh. Đề tài: “Xác định metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong rượu và huyết tương người” đƣợc tiến hành với mục tiêu: 1.

Nghiên cứu chế tạo kit thử metanol trong rƣợu và máu để xác định nhanh bệnh nhân ngộ độc metanol. Nghiên cứu định lƣợng nhanh đồng thời metanol, etanol và một số sản phẩm chuyển hóa của chúng trong rƣợu và huyết tƣơng bằng phƣơng pháp 1H- NMR phục vụ tiên lƣợng BN và hỗ trợ điều trị. 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về metanol và etanol 1.

Giới thiệu chung về metanol và etanol Metanol hay còn gọi là rƣợu metylic có công thức cấu tạo CH 3OH đƣợc ngƣời Hi Lạp cổ tình cờ phát hiện khi tiến hành thủy phân gỗ, tuy nhiên sản phẩm metanol lúc đó tồn tại dƣới dạng tạp chất, lẫn với các chất khác. Đến nay metanol đƣợc sản xuất trong công nghiệp bằng phản ứng hóa học với cơ chất sử dụng phổ biến là cacbon monooxit (CO), cacbon dioxit (CO2) và khí hydro (H2) [11]. Etanol hay còn đƣợc biết đến với nhiều tên gọi khác nhau nhƣ rƣợu, cồn etylic, là phân tử rƣợu đơn giản gồm nhóm ankyl với 2 nguyên tử carbon liên kết với nhóm hydroxyl. Công thức cấu tạo C2H5OH, thƣờng đƣợc viết tắt là EtOH.

Năm 1825, Michael Faraday đã tổng hợp đƣợc etanol từ etylen bằng cách hydrat hóa với xúc tác axit, tƣơng tự nhƣ quy trình tổng hợp etanol công nghiệp ngày nay. Ngoài ra, trong công nghiệp, etanol còn đƣợc tổng hợp từ CO2 và lipit. Metanol và etanol đều tồn tại trong tự nhiên. Metanol đƣợc sinh ra trong quá trình chuyển hóa kỵ khí của một số loại vi khuẩn, tuy nhiên lƣợng này không nhiều do metanol phản ứng với oxy chuyển hóa thành khí CO 2 và H2O.

Etanol là một sản phẩm phụ của quá trình chuyển hóa đƣờng nhờ men. Etanol thƣờng đƣợc tìm thấy trong quả chín. Nó cũng có thể tạo ra trong quá trình nảy mầm của nhiều loại cây trồng do điều kiện khí hậu không thuận lợi. Metanol, etanol là 2 phân tử đầu tiên trong dãy đồng đẳng, có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 32 g/mol và 46,07 g/mol, nhiệt độ sôi là 64,7oC và 78oC.

Cả metanol và etanol đều là hợp chất không màu, dễ bay hơi, dễ cháy và tan vô hạn trong nƣớc. Các đặc tính vật lý và hóa học của etanol chủ yếu do nhóm hydroxyl. Các phản ứng hóa nhƣ phản ứng ete hóa, hay este hóa, phản ứng thế nhóm OH, phản tứng oxy hóa tạo aldehyd… Với các đặc tính hóa lý của nó, metanol và etanol đƣợc sử dụng rất rộng rãi trong nhiều ngành nghề. 3 Trong phòng thí nghiệm, metanol là một dung môi phổ biến đƣợc sử dụng rộng rãi và đặc biết hữu ích cho HPLC, quang phổ UV-Vis, LC-MS do bƣớc sóng hấp thụ cực đại của metanol ngắn, độ hấp thụ quang thấp.

Trong công nghiệp hóa chất, metanol, etanol đều đƣợc sử dụng làm nguyên liệu đầu vào để tổng hợp lên các hợp chất khác. Nhờ khả năng tan vô hạn trong nƣớc và có thể hòa tan đƣợc các chất hữu cơ có độ phân cực thấp mà nó đƣợc dùng nhƣ dung môi trong sơn, bút dánh dấu, bút mực, nƣớc rửa răng hay chất khử mùi. Trong công nghiệp nhiên liệu, metanol và etanol đã và đang đƣợc nghiên cứu sử dụng nhƣ một loại nguyên liệu thay thế hoặc là phụ gia nhiên liệu cho các loại phƣơng tiện giao thông [4]. Trong đó, etanol đƣợc xem là nhiên liệu sinh học tái sinh, do nó có thể đƣợc sản xuất từ các nguồn thức ăn chăn nuôi, hay từ các loại cây nhƣ gai dầu, mía, sắn, ngô.

Trong ngành y tế, etanol đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ chất sát trùng, nó còn đƣợc sử dụng nhƣ chất giải độc bằng cả đƣờng tiêm và đƣờng uống trong ngộ độc metanol và etylen glycol [2]. Ngoài ra, etanol dùng để hòa tan nhiều loại thuốc không tan trong nƣớc, hơn 700 chất lỏng dùng trong y khoa có chứa etanol bao gồm acetaminophen, mannitol, phenobarbital… [25]. Đặc biệt, etanol đƣợc con ngƣời sử dụng nhƣ một lọai đồ uống giải trí. Từ thế kỷ thứ 9, con ngƣời đã biết chƣng cất rƣợu [3],[ 22].

Tới nay, có hàng nghìn loại rƣợu đƣợc sản xuất trên thế giới để phục vụ cho nhu cầu của con ngƣời. Metanol mặc dù là rƣợu nhƣng không uống đƣợc do độc tính cao. Metanol có mùi tƣơng tự etanol và có vị ngọt hơn nên dễ uống hơn. Một số ngƣời đã pha metanol cùng với nƣớc hoặc rƣợu etanol để bán nhƣ rƣợu etanol nguyên chất.

Đây có lẽ là nguyên nhân gây ngộ độc thƣờng gặp ở Việt Nam. Trong tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7043:2013 quy định hàm lƣợng metanol trong rƣợu chƣng cất không vƣợt quá 2000 mg/l / 100 0 etanol và với rƣợu pha chế hàm lƣợng metanol không vƣợt quá 100 mg/l / 1000 etanol. Chuyển hóa metanol và etanol trong cơ thể, cơ chế gây độc 1. Chuyển hóa metanol và etanol trong cơ thể  Metanol Khi vào cơ thể, metanol hấp thu nhanh và hoàn toàn qua đƣờng tiêu hóa với nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng 30-90 phút sau khi uống.

Một phần đƣợc thải nguyên dạng qua đƣờng hô hấp nhƣng không đáng kể. Trong cơ thể ngƣời, metanol đƣợc chuyển hóa tại gan thành fomandehit nhờ xúc tác của men metalloenzyme ancol dehydrogenase, thƣờng gọi là ancol dehydrogenase (ADH). Phản ứng này cần có mặt của NAD+ và sinh ra NADH bằng cách chuyển sang một electron [62]. Fomandehit chỉ tồn tại trong thời gian rất ngắn, chƣa đến 1 phút và ngay lập tức chuyển hóa thành axit fomic nhờ xúc tác của men formandehyde dehydrogenase.

Sau đó axit fomic cần kết hợp với tetrahydrofolate hay còn gọi là axit folinic để chuyển hóa hoàn toàn thành khí cacbonic và nƣớc. Thời gian bán thải tự nhiên của metanol trong cơ thể ngƣời trung bình từ 8 – 28 giờ [28]. 1: Chuyển hóa metanol trong cơ thể người Các phƣơng pháp xác định nhanh metanol trong dịch sinh học cho thấy nồng độ metanol thấp nhất có thể xác định đƣợc trong máu là 5 mg/l [25], trong nƣớc bọt 5 là 10mg/l [14]. Trong nghiên cứu của Paasma và các cộng sự [18], nồng độ metanol trong mẫu máu 147 bệnh nhân ngộ độc đƣợc xác định trong khoảng từ 50 mg/l – 7788 mg/l.

Định lƣợng nồng độ axit fomic trong máu cũng có ý nghĩa trong việc chẩn đoán và điều trị. Với việc sử dụng phƣơng pháp điện di mao quản, 2,8 mg/l là giới hạn định lƣợng của fomat trong máu toàn phần, giới hạn này thấp hơn khi nền mẫu là huyết thanh (2,3 mg/l) [54]. Sử dụng biosensor đo thế có thể nhận biết nồng độ fomat 2,3 mg/l [32].