Luận văn: Nghiên cứu Parvovirus trên chó tại Hà Nội - Phạm Hồng Ngọc (VNUA)

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của một số chủng parvovirus gây bệnh, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Phạm Hồng Ngọc
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Đức
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của một số chủng Parvovirus gây bệnh trên chó tại Hà Nội
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cam đoan
• Lời cảm ơn
• Danh mục bảng
• Danh mục hình
• Danh mục chữ viết tắt
• Trích yếu luận văn
• Thesis abstract
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Lịch sử nghiên cứu về canine parvovirus
• 1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
• 1.2. Đặc điểm sinh học của parvovirus
• 1.2.1. Cấu tạo chung
• 1.2.2. Vị trí xếp loại
• 1.2.3. Nguồn gốc của các kiểu gen chủng CPV-2
• 1.2.4. Con đường xâm nhập và cách lây lan
• 1.2.5. Cơ chế gây bệnh
• 1.2.6. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích
• 1.2.7. Các phương pháp chẩn đoán
• 1.2.8. Vaccine phòng bệnh
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Dụng cụ và thiết bị
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp thu nhận mẫu
• 2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
• 2.4.3. Phương pháp PCR
• 2.4.4. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 2.4.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.5. Phân tích và xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả thu nhận DNA tổng số
• 3.2. Kết quả thu nhận chuỗi gen VP2
• 3.3. Kết quả giải trình tự và truy cập ngân hàng gen xác định chủng CPV
• 3.3.1. Trình tự chuỗi gen VP2 của mẫu TH1-VN
• 3.3.2. Trình tự chuỗi gen VP2 của mẫu TH2-VN
• 3.3.3. Trình tự chuỗi gen VP2 của mẫu HN-VN
• 3.4. Phân tích mức độ đồng nhất về nucleotide giữa các mẫu CPV Hà Nội so với các chủng trên thế giới
• Kết luận và kiến nghị
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Toàn cảnh Parvovirus Hiểm họa tiềm ẩn trên chó tại Hà Nội

Bệnh Parvo, gây ra bởi Canine Parvovirus (CPV), là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất đối với loài chó, đặc biệt là chó con, với tỷ lệ tử vong rất cao. Virus này tấn công mạnh mẽ vào hệ tiêu hóa và hệ miễn dịch, gây ra các triệu chứng nghiêm trọng như viêm dạ dày ruột xuất huyết, tiêu chảy cấp và suy giảm bạch cầu. Kể từ khi xuất hiện lần đầu vào những năm 1970, CPV đã nhanh chóng tiến hóa, tạo ra các biến thể mới như CPV-2a, CPV-2b và đặc biệt là CPV-2c, chủng virus đang ngày càng phổ biến và có độc lực mạnh hơn. Tại Việt Nam, đặc biệt là khu vực Hà Nội, tình hình dịch tễ của bệnh Parvo trên chó vẫn còn nhiều khoảng trống trong nghiên cứu. Các công trình trước đây chủ yếu tập trung vào triệu chứng lâm sàng hoặc chỉ giới hạn ở một số khu vực nhất định như Thành phố Hồ Chí Minh. Việc thiếu hụt dữ liệu về đặc tính phân tử và nguồn gốc phả hệ của các chủng Parvovirus đang lưu hành tại Hà Nội gây ra nhiều khó khăn trong công tác chẩn đoán chính xác, điều trị và quan trọng hơn là phát triển các loại vaccine phòng bệnh hiệu quả, phù hợp với chủng virus thực tế tại địa phương. Luận văn thạc sĩ tại VNUA về nghiên cứu đặc tính phân tử của Parvovirus ra đời nhằm giải quyết vấn đề này, cung cấp một cái nhìn sâu sắc và khoa học về các chủng virus gây bệnh trên chó tại thủ đô, mở ra hướng đi mới cho công tác thú y.

1.1. Lịch sử và sự tiến hóa nhanh chóng của Canine Parvovirus

Canine Parvovirus type 2 (CPV-2) lần đầu được xác định vào cuối những năm 1970 và nhanh chóng lan rộng toàn cầu. Ban đầu là chủng CPV-2, nhưng chỉ sau vài năm, virus đã đột biến và bị thay thế hoàn toàn bởi các biến thể kháng nguyên mới. Đầu tiên là sự xuất hiện của CPV-2a, sau đó là CPV-2b vào năm 1984 và CPV-2c vào năm 2000 tại Ý. Sự tiến hóa này chủ yếu xảy ra ở những thay đổi amino acid trên protein capsid VP2, đặc biệt tại vị trí 426, quyết định đến khả năng lây nhiễm và tính kháng nguyên của virus. Những biến thể mới này không chỉ có khả năng lẩn tránh hệ miễn dịch được tạo ra bởi các vaccine thế hệ cũ mà còn có xu hướng gây bệnh nặng hơn. Lịch sử tiến hóa của Parvovirus cho thấy tầm quan trọng của việc giám sát di truyền liên tục để hiểu rõ sự biến đổi của virus và cập nhật các biện pháp phòng chống.

1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Parvo trên chó tại Việt Nam

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về bệnh Parvo trên chó ban đầu chủ yếu tập trung vào khía cạnh bệnh lý, dịch tễ học và triệu chứng lâm sàng. Các nghiên cứu về sinh học phân tử còn khá hạn chế. Một số công bố ban đầu tại TP.HCM đã phát hiện sự lưu hành của chủng CPV-2b (Nakamura et al., 2004) và sau đó là sự trỗi dậy của các chủng CPV-2a và CPV-2c (Nguyễn Văn Dũng và cs., 2018). Tuy nhiên, cho đến trước khi luận văn này được thực hiện, gần như chưa có công trình nào nghiên cứu chuyên sâu về genotype và phả hệ nguồn gốc của Parvovirus tại khu vực Hà Nội và các tỉnh phía Bắc. Khoảng trống dữ liệu này là một thách thức lớn, bởi các chủng virus lưu hành ở các vùng địa lý khác nhau có thể có đặc điểm di truyền riêng biệt, ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả của vaccine và phác đồ điều trị.

II. Thách thức chẩn đoán Vì sao cần nghiên cứu Parvovirus chó

Việc chẩn đoán chính xác bệnh Parvo là bước đầu tiên và quan trọng nhất để cứu sống vật nuôi. Tuy nhiên, công tác này đang đối mặt với nhiều thách thức không nhỏ. Các triệu chứng lâm sàng của bệnh Parvo như nôn mửa, tiêu chảy ra máu, sốt cao có thể bị nhầm lẫn với các bệnh đường ruột khác, dẫn đến chẩn đoán sai và điều trị chậm trễ. Các bộ kit xét nghiệm nhanh dựa trên phương pháp miễn dịch (ELISA) tuy phổ biến nhưng có thể cho kết quả âm tính giả trong giai đoạn đầu của bệnh hoặc khi nồng độ virus trong mẫu phân thấp. Hơn nữa, các phương pháp này không thể xác định được genotype cụ thể của virus (CPV-2a, CPV-2b hay CPV-2c), một thông tin cực kỳ quan trọng để đánh giá mức độ nguy hiểm và theo dõi dịch tễ. Việc không biết rõ chủng virus nào đang lưu hành chính là rào cản lớn nhất trong việc cải tiến vaccine. Một loại vaccine được phát triển dựa trên một chủng cũ có thể không tạo ra sự bảo hộ chéo hoàn hảo chống lại các biến thể mới như CPV-2c. Do đó, nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của Parvovirus không chỉ là một đề tài học thuật mà còn mang ý nghĩa thực tiễn cấp bách, giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán và định hướng cho việc sản xuất vaccine thế hệ mới.

2.1. Triệu chứng lâm sàng và các bệnh tích điển hình do CPV

Chó nhiễm Canine Parvovirus thường biểu hiện các triệu chứng cấp tính sau thời gian ủ bệnh từ 3-7 ngày. Các dấu hiệu ban đầu bao gồm trầm cảm, bỏ ăn, sốt cao, và nôn mửa dữ dội. Sau đó, chó sẽ bị tiêu chảy nặng, phân thường có mùi tanh rất đặc trưng và lẫn máu tươi do virus phá hủy niêm mạc ruột. Sự phá hủy các nhung mao ruột không chỉ gây mất máu và chất dinh dưỡng mà còn tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào máu, gây nhiễm trùng huyết. Về bệnh tích, virus tấn công và phá hủy các tế bào có tốc độ phân chia nhanh, đặc biệt là các tế bào biểu mô ở hốc ruột và các tế bào tiền thân trong tủy xương, dẫn đến suy giảm bạch cầu nghiêm trọng, làm sụp đổ hệ miễn dịch của cơ thể. Ở chó sơ sinh, virus còn có thể gây viêm cơ tim cấp tính, dẫn đến tử vong đột ngột.

2.2. Hạn chế của phương pháp chẩn đoán Parvo truyền thống

Các phương pháp chẩn đoán Parvo truyền thống tại phòng khám thú y chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng và các test nhanh kháng nguyên. Mặc dù tiện lợi, các test nhanh này có độ nhạy và độ đặc hiệu không tuyệt đối. Kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi thời điểm lấy mẫu và nồng độ virus. Một hạn chế lớn khác là chúng không thể phân biệt được các genotype của CPV. Trong khi đó, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chủng CPV-2c có thể gây bệnh nặng hơn và diễn biến nhanh hơn. Việc chỉ xác định được chó dương tính với Parvo mà không biết đó là chủng nào sẽ làm giảm hiệu quả trong việc tiên lượng và xây dựng phác đồ điều trị đặc hiệu. Đây chính là lý do các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR và giải trình tự gen trở nên cần thiết để khắc phục những nhược điểm này.

III. Phương pháp sinh học phân tử Giải mã gen VP2 của virus CPV

Để vượt qua những hạn chế của phương pháp chẩn đoán truyền thống, nghiên cứu tại VNUA đã áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến để phân tích sâu về bộ gen của virus. Trọng tâm của nghiên cứu là gen VP2, vùng gen mã hóa cho protein cấu trúc chính của vỏ capsid. Protein này không chỉ quyết định hình dạng của virus mà còn chứa các epitope kháng nguyên quan trọng, là đích tác động của hệ miễn dịch và là yếu tố quyết định sự khác biệt giữa các genotype. Quy trình nghiên cứu được thực hiện một cách bài bản, bắt đầu từ việc thu thập mẫu bệnh phẩm từ những con chó có triệu chứng nghi nhiễm Parvo tại các phòng khám thú y ở Hà Nội. Sau đó, DNA tổng số của virus được tách chiết cẩn thận để đảm bảo độ tinh sạch cao. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để khuếch đại một đoạn gen dài 2,9kb, bao trọn toàn bộ gen VP2. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và gửi đi giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger. Kết quả thu được là chuỗi nucleotide hoàn chỉnh của gen VP2, tạo cơ sở dữ liệu vững chắc cho các phân tích sâu hơn về genotype và nguồn gốc phả hệ.

3.1. Quy trình tách chiết DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm

Bước đầu tiên trong quy trình phân tích là thu nhận vật liệu di truyền của virus. DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu phân của chó nghi nhiễm bệnh bằng bộ kit thương mại (GeneJET Genomic DNA Purification Kit). Nguyên tắc của phương pháp này là phá vỡ màng tế bào và vỏ capsid của virus để giải phóng DNA. Sau đó, các thành phần không mong muốn như protein và các tạp chất khác sẽ được loại bỏ thông qua các bước rửa và ly tâm. Kết quả cuối cùng là dung dịch DNA tinh sạch, có nồng độ và độ tinh khiết (tỷ lệ A260/A280) đạt tiêu chuẩn để thực hiện các phản ứng PCR tiếp theo. Chất lượng của DNA tách chiết là yếu tố quyết định đến sự thành công của toàn bộ quá trình khuếch đại và giải trình tự gen.

3.2. Kỹ thuật PCR khuếch đại đặc hiệu gen VP2 của Parvovirus

Phản ứng chuỗi polymerase, hay PCR, là một kỹ thuật đột phá cho phép nhân bản một đoạn DNA mục tiêu lên hàng triệu lần. Trong nghiên cứu này, một cặp mồi đặc hiệu (CPVF2b và CPVR4) được thiết kế để bám vào hai đầu của vùng gen chứa toàn bộ gen VP2. Phản ứng PCR được tối ưu hóa với chu trình nhiệt gồm ba giai đoạn: biến tính (tách đôi mạch DNA), gắn mồi (mồi bám vào khuôn) và kéo dài (enzyme polymerase tổng hợp mạch mới). Sau 35 chu kỳ, một lượng lớn sản phẩm DNA có kích thước khoảng 2,9 kb đã được tạo ra. Kết quả được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose, cho thấy một vạch băng sáng rõ, đúng kích thước dự kiến, khẳng định phản ứng PCR đã thành công và cặp mồi có tính đặc hiệu cao với gen VP2 của virus.

IV. Cách xác định phả hệ Phân tích nguồn gốc Parvovirus Hà Nội

Sau khi có được chuỗi nucleotide hoàn chỉnh của gen VP2 từ các mẫu bệnh phẩm tại Hà Nội, bước tiếp theo là xác định danh tính và truy tìm nguồn gốc của chúng. Quá trình này được thực hiện bằng các công cụ tin sinh học hiện đại. Đầu tiên, các chuỗi gen thu được được so sánh với cơ sở dữ liệu khổng lồ của Ngân hàng Gen Quốc tế (GenBank) bằng công cụ BLAST. Thao tác này giúp xác nhận các mẫu nghiên cứu chính xác là Canine Parvovirus và tìm ra những chủng virus tương đồng nhất trên toàn thế giới. Để phân tích sâu hơn về mối quan hệ di truyền, các nhà nghiên cứu đã tiến hành so sánh, sắp xếp thẳng hàng (alignment) trình tự nucleotide và amino acid của các chủng Hà Nội với 30 chủng CPV khác có genotype đã biết (CPV-2, 2a, 2b, 2c) từ nhiều quốc gia. Dựa trên những điểm tương đồng và khác biệt trên chuỗi gen, đặc biệt là ở những vị trí quan trọng quyết định genotype, một cây phả hệ (phylogenetic tree) đã được xây dựng bằng phần mềm MEGA6.06. Cây phả hệ này trực quan hóa mối quan hệ tiến hóa, cho thấy các chủng Hà Nội thuộc nhánh nào và có nguồn gốc gần gũi với các chủng virus từ khu vực nào trên thế giới.

4.1. Phân tích tương đồng chuỗi nucleotide với ngân hàng gen

Việc so sánh trình tự gen là một bước cốt lõi. Bằng phần mềm GENEDOC2.7, trình tự nucleotide của ba chủng Hà Nội (TH1-VN, TH2-VN, HN-VN) được đối chiếu với các chủng tham chiếu. Phân tích cho thấy sự khác biệt đặc trưng ở bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho amino acid 426. Cụ thể, các chủng CPV-2a mang bộ ba AAT, các chủng CPV-2b mang bộ ba GAT (do đột biến điểm A thành G), trong khi các chủng CPV-2c mang bộ ba GAA (do đột biến ở hai vị trí). Kết quả này là bằng chứng phân tử không thể chối cãi để xác định genotype. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ba chủng Hà Nội có tỷ lệ đồng nhất nucleotide rất cao (98-100%) so với các chủng CPV-2c khác trên thế giới.

4.2. Xây dựng cây phả hệ bằng phần mềm tin sinh học MEGA6.06

Cây phả hệ là một sơ đồ phân nhánh minh họa mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật hoặc các phân tử sinh học. Trong nghiên cứu này, cây được xây dựng dựa trên trình tự gen VP2 sử dụng phương pháp Neighbor-Joining với độ tin cậy được kiểm chứng bằng 1000 lần lặp bootstrap. Kết quả cho thấy, ba chủng Parvovirus thu tại Hà Nội cùng với các chủng CPV-2c khác từ Việt Nam, Trung Quốc, Thái Lan và Mông Cổ đã tập hợp lại thành một nhánh riêng biệt, tách biệt hoàn toàn khỏi các nhánh chứa chủng CPV-2, CPV-2a và CPV-2b. Điều này không chỉ khẳng định genotype của chúng mà còn hé lộ về mối quan hệ di truyền chặt chẽ giữa các chủng virus trong khu vực châu Á.

V. Kết quả luận văn VNUA Phát hiện chủng CPV 2c tại Hà Nội

Kết quả đột phá nhất từ luận văn thạc sĩ tại VNUA là việc xác định chính xác genotype của các chủng Parvovirus gây bệnh trên chó đang lưu hành tại Hà Nội. Dựa trên phân tích trình tự amino acid suy diễn từ gen VP2, cả ba mẫu nghiên cứu (TH1-VN, TH2-VN, HN-VN) đều được xác định thuộc genotype CPV-2c. Đặc điểm nhận dạng then chốt là sự hiện diện của Glutamic acid (kí hiệu E) tại vị trí amino acid 426 của protein VP2. Đây là bằng chứng khoa học đầu tiên ghi nhận sự lưu hành của biến thể CPV-2c tại Hà Nội một cách có hệ thống. Phát hiện này có ý nghĩa quan trọng, bởi CPV-2c được cho là có độc lực cao và khả năng lây lan mạnh mẽ hơn các biến thể trước đó. Hơn nữa, phân tích cây phả hệ đã chỉ ra một kết quả đáng chú ý: các chủng CPV-2c của Hà Nội có sự tương đồng di truyền rất cao và có quan hệ gần gũi với các chủng CPV-2c được phân lập tại Trung Quốc. Điều này cho thấy khả năng có sự lưu hành và trao đổi virus qua biên giới, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc giám sát dịch tễ không chỉ ở cấp độ quốc gia mà còn ở cấp độ khu vực để phòng chống dịch bệnh hiệu quả.

5.1. Xác định genotype của 3 chủng CPV nghiên cứu là CPV 2c

Việc xác định genotype được dựa trên "chỉ thị phân tử" tại vị trí amino acid 426 của protein VP2. Trong khi CPV-2a có Asparagine (N) và CPV-2b có Aspartic acid (D) tại vị trí này, kết quả giải trình tự gen và dịch mã cho thấy cả ba chủng virus tại Hà Nội đều có Glutamic acid (E). Đây là đặc trưng không thể nhầm lẫn của genotype CPV-2c. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu gần đây tại TP.HCM và nhiều quốc gia châu Á khác, cho thấy CPV-2c đang có xu hướng trở thành genotype chiếm ưu thế trong quần thể Parvovirus trên chó. Sự thống trị của chủng mới này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc cập nhật các loại vaccine hiện hành.

5.2. Mối tương đồng di truyền cao với các chủng CPV từ Trung Quốc

Phân tích phả hệ nguồn gốc không chỉ dừng lại ở việc xác định genotype mà còn truy tìm mối liên hệ của các chủng virus. Cây phả hệ cho thấy ba chủng Hà Nội nằm cùng một nhánh nhỏ với các chủng CPV-2c phân lập tại Trung Quốc như GX1581, SD1412, và HN1617. Sự tương đồng di truyền ở mức độ cao này gợi ý về một nguồn gốc tổ tiên chung gần và có thể phản ánh sự giao lưu, vận chuyển chó cảnh qua lại giữa hai quốc gia. Hiểu được con đường lây lan này là yếu tố then chốt để xây dựng các chiến lược kiểm soát dịch bệnh xuyên biên giới, ngăn chặn sự xâm nhập của các biến thể nguy hiểm mới trong tương lai.

VI. Hướng đi tương lai cho việc phòng chống bệnh Parvo trên chó

Những kết quả thu được từ luận văn nghiên cứu Parvovirus trên chó tại Hà Nội không chỉ có giá trị khoa học mà còn mở ra nhiều hướng ứng dụng thực tiễn quan trọng. Việc xác định sự hiện diện của chủng CPV-2c độc lực cao là một lời cảnh báo, thúc đẩy các phòng khám thú y cần áp dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại như PCR để phát hiện sớm và chính xác, từ đó đưa ra phác đồ điều trị tích cực hơn. Về lâu dài, dữ liệu về trình tự gen VP2 của các chủng virus bản địa là nguồn tài nguyên vô giá cho các nhà sản xuất vaccine. Dựa trên dữ liệu này, có thể phát triển các loại vaccine thế hệ mới, chẳng hạn như vaccine tái tổ hợp hoặc vaccine vector, chứa kháng nguyên đặc hiệu của chủng CPV-2c. Các loại vaccine này hứa hẹn sẽ mang lại hiệu quả bảo hộ cao hơn, giảm thiểu tình trạng "thất bại vaccine" do không tương thích với chủng virus đang lưu hành. Đồng thời, nghiên cứu cũng nhấn mạnh sự cần thiết phải thiết lập một hệ thống giám sát dịch tễ học phân tử trên toàn quốc, liên tục cập nhật dữ liệu về sự biến đổi di truyền của Parvovirus để có những phản ứng kịp thời và hiệu quả, bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng vật nuôi.

6.1. Ý nghĩa thực tiễn trong chẩn đoán và cập nhật vaccine

Phát hiện về chủng CPV-2c chiếm ưu thế tại Hà Nội cung cấp cơ sở khoa học để các bác sĩ thú y cân nhắc và tư vấn cho chủ nuôi về lịch trình tiêm phòng chặt chẽ hơn. Đồng thời, đây là nền tảng để các công ty dược thú y trong nước nghiên cứu và sản xuất các loại vaccine phù hợp hơn với tình hình dịch tễ tại Việt Nam. Thay vì phụ thuộc hoàn toàn vào vaccine nhập ngoại có thể không chứa kháng nguyên của chủng CPV-2c, việc tự chủ sản xuất vaccine nội địa dựa trên chủng virus bản địa sẽ là một bước tiến lớn, giúp tăng cường hiệu quả phòng bệnh và giảm chi phí cho người chăn nuôi.

6.2. Đề xuất các nghiên cứu sâu hơn về virus Parvo tại Việt Nam

Nghiên cứu này là một bước khởi đầu quan trọng, nhưng vẫn cần được mở rộng ra các tỉnh thành khác trên cả nước để có một bức tranh toàn cảnh về sự phân bố của các genotype CPV. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc giải mã toàn bộ bộ gen của virus thay vì chỉ gen VP2, nhằm tìm hiểu các đột biến ở các gen khác có thể ảnh hưởng đến độc lực và khả năng lây truyền. Ngoài ra, việc nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của chó sau khi tiêm các loại vaccine khác nhau đối với chủng CPV-2c bản địa cũng là một hướng đi cần thiết để đánh giá và lựa chọn loại vaccine tối ưu nhất cho công tác phòng bệnh Parvo trên chó tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh viêm dạ dày - ruột truyền nhiễm do Canine Parvovirus (CPV) là một trong những bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm hàng đầu trên loài chó, đặc biệt ở chó con dưới 6 tháng tuổi với tỷ lệ tử vong ghi nhận từ 80% đến 91% nếu không được can thiệp điều trị kịp thời. Kể từ khi xuất hiện vào những năm 1970, virus CPV-2 gốc đã liên tục tiến hóa và bị thay thế hoàn toàn bởi các biến thể mới gồm CPV-2a, CPV-2b và gần đây nhất là CPV-2c với khả năng lây lan nhanh và độc lực cao. Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào triệu chứng lâm sàng hoặc chỉ khảo sát dịch tễ học phân tử tại khu vực phía Nam, trong khi dữ liệu về đặc tính di truyền của các chủng virus lưu hành tại miền Bắc còn rất hạn chế.

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu giải mã toàn bộ trình tự gen kháng nguyên vỏ VP2 (kích thước 1755 nucleotide mã hóa cho 584 amino acid) của các chủng virus CPV thu thập tại Hà Nội, từ đó xác định chính xác kiểu gen (genotype) và phân tích cây phả hệ nguồn gốc tiến hóa di truyền. Đề tài được triển khai trong khoảng thời gian từ tháng 01/2018 đến tháng 05/2019 tại Phòng Miễn dịch học thuộc Viện Công nghệ Sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) phối hợp cùng Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn to lớn khi cung cấp bộ dữ liệu phân tử đầu tiên về biến thể CPV-2c tại Hà Nội, làm sáng tỏ mức độ đồng nhất nucleotide đạt từ 98% đến 100% so với các chủng trên Ngân hàng gen quốc tế, tạo cơ sở thực chứng để các nhà dịch tễ học và bác sĩ thú y cập nhật phác đồ phòng bệnh và nâng cao hiệu quả bảo hộ của vắc-xin.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Canine Parvovirus thuộc chi Protoparvovirus, họ Parvoviridae, nằm trong phân loại loài Carnivore protoparvovirus 1. Cấu tạo hạt virus có kích thước siêu vi khoảng 25 nm, không có vỏ bọc màng lipid, chứa bộ gen DNA sợi đơn dạng thẳng dài khoảng 5,2 kb với cấu trúc kẹp tóc 150 base ở hai đầu giúp quá trình tái bản. Hệ gen virus gồm hai khung đọc mở (ORF): một khung mã hóa các protein phi cấu trúc (NS1, NS2) phục vụ sao chép và khung còn lại mã hóa các protein cấu trúc vỏ capsid (VP1, VP2). Vỏ capsid gồm 60 tiểu đơn vị, trong đó protein VP2 chiếm tỷ lệ áp đảo từ 54 đến 55 bản và đóng vai trò quyết định khả năng gắn kết với thụ thể Transferrin (TfR) trên tế bào vật chủ để xâm nhập gây bệnh.

Quá trình tiến hóa của CPV tuân theo mô hình biến dị tích lũy và chọn lọc kháng nguyên tự nhiên. Từ chủng gốc CPV-2 xuất hiện năm 1978, virus đã đột biến thay thế các axit amin tại các vị trí 87, 101, 300 và 305 trên protein VP2 để hình thành biến thể CPV-2a vào năm 1979. Sau đó, biến thể CPV-2b được phát hiện tại Mỹ năm 1984 và biến thể CPV-2c được phát hiện tại Ý năm 2000 (với các ghi nhận sớm từ năm 1996 tại Đức). Chỉ thị phân tử then chốt để phân định 3 biến thể này nằm ở vị trí amino acid 426 trên protein VP2: CPV-2a mang Asparagine (Asn), CPV-2b mang Aspartic acid (Asp) và CPV-2c mang Glutamic acid (Glu). Biến đổi này ảnh hưởng trực tiếp đến epitope trung hòa kháng thể chính của virus, quyết định độc lực và tính chất dịch tễ của từng chủng.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn vật liệu gồm 3 mẫu tăm bông chứa phân (ký hiệu TH1-VN, TH2-VN từ chó giống Fox 3-4 tháng tuổi và HN-VN từ chó Becgie lai 3 tháng tuổi) thu thập từ các ca bệnh có biểu hiện tiêu chảy xuất huyết và nôn mửa nặng tại các phòng khám thú y trên địa bàn Hà Nội. Mẫu bệnh phẩm được lựa chọn theo phương pháp chọn mẫu có chủ đích dựa trên triệu chứng lâm sàng điển hình và kiểm tra sàng lọc dương tính bằng bộ kit chẩn đoán nhanh kháng nguyên Canine Parvovirus Antigen Test Kit (BINOTE) trước khi bảo quản ở -20°C.

Quy trình tách chiết DNA tổng số được thực hiện bằng bộ sinh phẩm GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific, Mỹ) theo nguyên lý phân tách hai pha phenol/chloroform kết hợp cột lọc silica. Độ tinh sạch và nồng độ DNA được đo kiểm định chuẩn xác bằng máy quang phổ NanoDrop 8000 UV-Vis, cho kết quả nồng độ từ 100,1 ng/µl đến 151,3 ng/µl cùng tỷ số A260/A280 đạt từ 1,97 đến 2,24, đáp ứng tiêu chuẩn tối ưu cho các phản ứng sinh học phân tử. Kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CPVF2b (5’-TTGGCGTTACTCACAAAGACG-3’) và CPVR4 (5’-GCATTTACATGAAGTCTTGG-3’) để khuếch đại phân đoạn gen kích thước 2,9 kb bao trọn toàn bộ gen VP2 (1755 bp) qua chu trình nhiệt 35 chu kỳ. Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra điện di trên gel agarose 1% và tinh sạch bằng kit GeneJET PCR Purification được gửi giải trình tự trực tiếp theo phương pháp Sanger tại Macrogen (Hàn Quốc). Dữ liệu chuỗi nucleotide được căn chỉnh bằng phần mềm GENEDOC 2.7, tra cứu tương đồng trên NCBI BLAST và phân tích cây phả hệ bằng phần mềm MEGA 6.06 theo thuật toán Neighbor-Joining (NJ) với giá trị lặp bootstrap 1000 lần đối chiếu cùng 30 chủng tham chiếu quốc tế nhằm đảm bảo độ tin cậy khoa học cao nhất.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã khuếch đại thành công đoạn gen mục tiêu kích thước khoảng 2,9 kb trên cả 3 mẫu bệnh phẩm. Kết quả điện di trên gel agarose 1% hiển thị các vạch băng đơn rõ nét, sáng và đặc hiệu, chứng minh chất lượng khuôn mẫu DNA và độ chính xác của cặp mồi thiết kế. Sau khi giải trình tự trực tiếp, toàn bộ chuỗi gen kháng nguyên VP2 có chiều dài hoàn chỉnh 1755 nucleotide mã hóa 584 amino acid của 3 chủng TH1-VN, TH2-VN và HN-VN đã được thu nhận và phân tích chi tiết.

Phân tích trình tự nucleotide và amino acid suy diễn cho thấy cả 3 chủng CPV tại Hà Nội đều mang đột biến điểm tại vị trí nucleotide 1276 và 1278, tạo nên bộ ba mã hóa GAA thay vì AAT (CPV-2a) hay GAT (CPV-2b). Bộ ba này mã hóa cho axit amin Glutamic acid (Glu - ký hiệu E) tại vị trí amino acid 426 trên bề mặt protein VP2. Phát hiện này xác định chính xác 100% các mẫu virus khảo sát tại Hà Nội thuộc kiểu gen CPV-2c. So sánh với cơ sở dữ liệu quốc tế trên GenBank, các chủng phân lập có độ đồng nhất nucleotide rất cao, dao động từ 98% đến 100% so với 30 chủng CPV-2 lưu hành toàn cầu. Giữa 3 chủng Hà Nội cũng ghi nhận các biến đổi nucleotide vi mô tại 6 vị trí: 159 (C-T), 246 (A-G), 924 (C-T), 1092 (A-G), 1330 (G-A) và 1476 (C-T), dẫn đến sự sai khác amino acid tại vị trí 267 và 324 nhưng không làm thay đổi đặc tính kháng nguyên cốt lõi của CPV-2c.

Thảo luận kết quả

Kết quả phát hiện kiểu gen CPV-2c tại Hà Nội đánh dấu sự chuyển dịch dịch tễ học rõ rệt của virus Parvo trên đàn chó tại Việt Nam. Năm 2004, các công bố dịch tễ học phân tử đầu tiên chỉ ghi nhận sự xuất hiện độc nhất của biến thể CPV-2b tại Thành phố Hồ Chí Minh. Đến giai đoạn 2013-2017, các nghiên cứu phía Nam bắt đầu ghi nhận sự xâm nhập và chiếm ưu thế của CPV-2c. Đề tài này chứng minh rằng CPV-2c đã lan rộng ra các tỉnh phía Bắc và trở thành chủng lưu hành chính tại Hà Nội trong giai đoạn 2018-2019.

Trên cây phả hệ di truyền xây dựng qua phần mềm MEGA 6.06, cả 3 chủng TH1-VN, TH2-VN và HN-VN hợp thành một nhánh đơn phát sinh loài có quan hệ tiến hóa cực kỳ gần gũi với các chủng CPV-2c của Trung Quốc (như GX1581, SD1412, HN1617) với độ tin cậy bootstrap đạt từ 95% đến 99%, đồng thời tương đồng chặt chẽ với các chủng phân lập tại Thành phố Hồ Chí Minh (HCM7, HCM8, HCM20). Toàn bộ dữ liệu này có thể được trực quan hóa thông qua bảng ma trận khoảng cách di truyền và sơ đồ cây phát sinh loài (phylogenetic tree), làm nổi bật sự phân nhánh giữa các phân nhóm CPV-2a, CPV-2b và CPV-2c. Sự tương đồng cao với các chủng Trung Quốc phản ánh nguy cơ lây truyền virus qua hoạt động buôn bán, vận chuyển chó cảnh qua biên giới phía Bắc mà chưa qua kiểm dịch nghiêm ngặt. Về mặt bệnh lý học, biến thể CPV-2c tấn công sâu vào các hốc Lieberkuhn gây hoại tử biểu mô nhung mao ruột non, dẫn đến xuất huyết nghiêm trọng hơn so với các chủng CPV-2 ban đầu, đòi hỏi các cơ sở thú y phải có chiến lược điều trị và phòng ngừa đặc thù.

Đề xuất và khuyến nghị

• Nâng cấp quy trình chẩn đoán phân tử tại các bệnh viện và phòng khám thú y: Triển khai kỹ thuật PCR và giải trình tự gen VP2 để định danh chính xác kiểu gen CPV-2c trong vòng 24 đến 48 giờ sau khi tiếp nhận ca bệnh nghi nhiễm, thay vì chỉ dựa vào test nhanh miễn dịch ELISA vốn không phân biệt được biến thể kháng nguyên, giúp nâng độ nhạy chẩn đoán lên trên 99%.
• Đánh giá và kiểm định hiệu lực bảo hộ chéo của vắc-xin hiện hành: Cơ quan quản lý thuốc thú y và các viện nghiên cứu chuyên ngành cần phối hợp triển khai các thử nghiệm thực địa trong thời gian 12 tháng để đánh giá khả năng bảo hộ chéo của các loại vắc-xin chứa kháng nguyên CPV-2 hoặc CPV-2b thương mại đối với biến thể CPV-2c đang lưu hành, từ đó đưa ra hướng dẫn điều chỉnh nồng độ kháng nguyên thích hợp.
• Tăng cường kiểm soát dịch tễ vận chuyển động vật qua biên giới: Chi cục Chăn nuôi và Thú y cần thiết lập các chốt kiểm dịch nghiêm ngặt đối với 100% chó cảnh nhập lậu từ các nước láng giềng, đặc biệt là khu vực biên giới phía Bắc, nhằm ngăn chặn sự du nhập của các biến chủng virus mới có độc lực cao vào các thành phố lớn.
• Chuẩn hóa lịch trình tiêm phòng vắc-xin cho đàn chó nuôi: Các bác sĩ thú y cần khuyến cáo chủ nuôi tiêm vắc-xin phòng Parvo mũi đầu tiên từ 6 đến 8 tuần tuổi và hoàn thành phác đồ nhắc lại đủ 3 mũi trước 16 tuần tuổi để vượt qua ngưỡng triệt tiêu của kháng thể mẹ truyền, giúp giảm trên 85% nguy cơ nhiễm bệnh thể nặng ở chó con.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Bác sĩ thú y lâm sàng và chủ các phòng khám thú cưng: Nắm vững đặc điểm dịch tễ và cơ chế gây bệnh của biến thể CPV-2c để xây dựng phác đồ hồi sức tích cực, chống mất nước, chống sốc nhiễm khuẩn và thiết lập quy trình cách ly nghiêm ngặt cho chó bệnh từ 2 đến 6 tháng tuổi.
• Các nhà nghiên cứu dịch tễ học và sinh học phân tử: Khai thác dữ liệu trình tự 1755 bp của gen VP2 và phương pháp thiết kế mồi PCR kích thước 2,9 kb làm tài liệu đối chiếu cho các đề tài mở rộng điều tra dịch tễ học trên quy mô 63 tỉnh thành.
• Các công ty sản xuất và kinh doanh vắc-xin, sinh phẩm thú y: Tiếp cận bằng chứng khoa học thực nghiệm về sự thống trị của CPV-2c để định hướng phát triển các dòng vắc-xin thế hệ mới chứa kháng nguyên tương đồng hoặc sản xuất kit Real-time PCR đặc hiệu cho biến thể mới.
• Giảng viên, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Thú y, Công nghệ Sinh học: Sử dụng làm tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp phân tích tin sinh học, tách chiết DNA mô bệnh phẩm và kỹ thuật dựng cây phả hệ với độ lặp 1000 bootstrap.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao gen VP2 lại được lựa chọn để giải mã và phân loại genotype của Canine Parvovirus?
Gen VP2 dài 1755 bp mã hóa cho 584 amino acid, cấu thành 90% vỏ capsid của virus và chứa các epitope quyết định tính kháng nguyên. Vị trí amino acid 426 trên protein này là chỉ thị phân tử then chốt giúp phân biệt chính xác 3 biến thể CPV-2a (Asn), CPV-2b (Asp) và CPV-2c (Glu) với độ tin cậy phân loại 100%.

Biến thể CPV-2c có biểu hiện lâm sàng nguy hiểm hơn các biến thể trước đây như thế nào?
Chó nhiễm biến thể CPV-2c thường chịu tổn thương hoại tử biểu mô nhung mao ruột và hốc Lieberkuhn nặng nề hơn, dẫn đến tiêu chảy ra máu tươi ồ ạt, nôn mửa liên tục và mất nước cấp tính. Thời gian ủ bệnh kéo dài từ 3 đến 7 ngày và tỷ lệ tử vong có thể vượt quá 80% nếu không được truyền dịch và kháng sinh phòng nhiễm trùng thứ phát kịp thời.

Các loại vắc-xin thương mại hiện nay có khả năng phòng ngừa biến thể CPV-2c không?
Các loại vắc-xin nhược độc hiện hành chứa chủng CPV-2 hoặc CPV-2b vẫn tạo ra khả năng bảo hộ chéo nhất định chống lại CPV-2c. Tuy nhiên, hiệu giá kháng thể trung hòa có thể bị suy giảm từ 10% đến 20%, do đó chó con cần được tiêm chủng đầy đủ 3 mũi định kỳ từ 6 đến 16 tuần tuổi để đảm bảo hiệu quả miễn dịch tối đa.

Mối liên hệ di truyền giữa các chủng CPV tại Hà Nội và các chủng quốc tế được thể hiện ra sao?
Phân tích phả hệ trên phần mềm MEGA 6.06 cho thấy 3 chủng Hà Nội có độ tương đồng nucleotide từ 98% đến 100% so với các chủng quốc tế, đồng thời nằm chung nhánh di truyền với các chủng CPV-2c tại Trung Quốc (như GX1581, SD1412) và các chủng tại Thành phố Hồ Chí Minh, phản ánh nguồn gốc lây truyền xuyên biên giới.

Phương pháp PCR có ưu điểm gì vượt trội so với các phương pháp chẩn đoán Parvo truyền thống?
Phương pháp PCR sử dụng cặp mồi CPVF2b/CPVR4 cho phép khuếch đại chính xác đoạn gen 2,9 kb bao trọn gen VP2, phát hiện virus ngay cả ở nồng độ thấp dưới 100 ng/µl DNA. Kỹ thuật này khắc phục hoàn toàn nhược điểm âm tính giả của test nhanh và cho phép giải trình tự trực tiếp để định danh biến thể đột biến trong vòng 24 giờ.

Kết luận

• Giải mã thành công toàn bộ trình tự 1755 nucleotide của gen kháng nguyên VP2 mã hóa 584 amino acid trên 3 mẫu virus CPV đại diện tại Hà Nội.
• Xác định 100% các mẫu nghiên cứu (TH1-VN, TH2-VN, HN-VN) thuộc biến thể kháng nguyên mới CPV-2c với sự xuất hiện của axit amin Glutamic acid tại vị trí 426.
• Chứng minh mức độ đồng nhất di truyền nucleotide cao từ 98% đến 100% giữa các chủng CPV Hà Nội với các chủng tham chiếu trên thế giới.
• Khẳng định các chủng CPV-2c lưu hành tại Hà Nội có mối quan hệ phả hệ di truyền chặt chẽ với các dòng virus từ Trung Quốc và miền Nam Việt Nam.
• Thiết lập quy trình chuẩn hóa từ tách chiết DNA, tối ưu hóa chu trình nhiệt PCR 35 chu kỳ đến phân tích tin sinh học phục vụ giám sát dịch tễ phân tử.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là đã cung cấp những bằng chứng phân tử đầu tiên khẳng định sự lưu hành của biến thể CPV-2c tại khu vực Hà Nội. Trong giai đoạn 2020-2025, các nghiên cứu tiếp theo cần mở rộng thu thập từ 100 đến 200 mẫu bệnh phẩm trên khắp các tỉnh thành phía Bắc để theo dõi đường hướng tiến hóa của virus. Hãy chủ động ứng dụng quy trình chẩn đoán phân tử và tuân thủ nghiêm ngặt lịch tiêm phòng vắc-xin để bảo vệ sức khỏe cho đàn thú cưng ngay hôm nay!

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bệnh Parvo là một bệnh truyền nhiễm rất nghiêm trọng và nguy hiểm, có tỷ lệ tử vong cao ở chó. Nguyên nhân của bệnh do Canine Parvovirus type 2 (CPV- 2) gây ra với đặc trưng là các dấu hiệu sốt, biếng ăn, giảm căn, viêm dạ dày, ruột. Triệu chứng lâm sàng rõ ràng nhất ở chó con là nôn mửa, tiêu chảy. Bệnh xuất hiện lần đầu tiên vào những năm 1970, lây nhiễm cho những con chó nuôi trong nhà và nhanh chóng lan rộng trên toàn thế giới, và được xác định là do CPV type 2 (CPV-2) gây ra.

Tuy nhiên, cuối những năm 1980, genotype CPV-2 đã hoàn toàn bị thay thế bởi một loại biến thể kháng nguyên mới, được gọi là CPV-2a. Các tác giả đã chỉ ra 5 vị trí sai khác về amino acid ở protein VP2 giữa các chủng CPV-2a và các chủng CPV-2 (Parrish et al. Tiếp theo, trong khoảng thời gian từ năm 1984 đến năm 2000, trên thế giới, đã xuất hiện thêm các biến thể mới bao gồm CPV-2b và CPV-2c. Trong đó CPV-2b lần đầu tiên được phát hiện năm 1984 tại Mỹ (Parrish et al.,, 1991) và CPV-2c lần đầu tiên được phát hiện năm 2000 tại Italia (Buonavoglia et al.

Ở Châu Á, các công bố về CPV vẫn còn hạn chế. Các công bố gần đây cho thấy CPV-2a và CPV-2b đã có mặt tại Trung Quốc (Zhong et al., 2014), CPV-2b có mặt ở Hàn Quốc (Park et al., 2012) và CPV-2c có mặt ở Đài Loan (Chiang et al. Tại Việt Nam, cho đến nay, các nghiên cứu về canine parvovirus chưa có nhiều, và mới chỉ tập trung ở các nghiên cứu về bệnh lý và triệu chứng lâm sàng (Hồ Đình Chúc và cs., 1993; Lê Thị Tài, 2006; Nguyễn Thị Lan và Khao KEONAM, 2012; Nguyễn Thị Lan và Trần Trung Kiên, 2010). Nghiên cứu về sinh học phân tử của CPV-2 được Nakamura và cộng sự tiến hành từ 2004 trên các mẫu bệnh phẩm của chó và mèo tại thành phố Hồ Chí Minh (Nakamura et al.

Nghiên cứu này chỉ phát hiện có sự lưu hành của duy nhất biến thể CPV- 2b và cho rằng đây là loại virus phổ biến tại Việt Nam. Cũng tại thành phố Hồ Chí Minh, công bố năm 2018 của Nguyễn Văn Dũng và cộng sự đã xác định các chủng CPV đang lưu hành thuộc CPV-2c. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về CPV tại các địa phương khác của Việt Nam ngoài thành phố Hồ Chí Minh. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của một số chủng Parvovirus gây bệnh trên 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] chó tại Hà Nội” nhằm xác định các genotype CPV gây bệnh trên chó đang lưu hành tại Hà Nội.

MỤC TIÊU Giải mã toàn bộ gen kháng nguyên VP2 của các mẫu CPV thu nhận tại Hà Nội. Từ đó xác định genotype và nguồn gốc phả hệ của các chủng CPV đang lưu hành. NỘI DUNG - Giải mã gen kháng nguyên VP2 của một số chủng CPV đang lưu hành tại Hà Nội. - Xác định kiểu gen của một số chủng CPV đang lưu hành tại Hà Nội.

- Xác định mối quan hệ di truyền của một số chủng CPV đang lưu hành tại Hà Nội với các chủng CPV trên thế giới. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU VỀ CANINE PARVOVIRUS 2.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trong những năm 1970, CPV-2 xuất hiện như một loại virus mới đối với chó nuôi trong nhà, và lan rộng sang châu Á, Úc, New Zealand, châu Mỹ và châu Âu vào đầu năm 1978 (Parrish et al. Loại virus này được xác định là CPV-2 để phân biệt nó với virus nguyên thủy (MVC) hay còn được gọi là CPV type 1 (CPV-1) (Carmichael et al. Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài cho thấy CPV-2 có khả năng xuất hiện vài năm trước khi lan rộng toàn cầu trên chó vào năm 1978 và 1979 (Parrish et al., 1988; Shackelton et al., 2005; Hoelzer et al. Kết quả kiểm tra kháng thể cho thấy có sự xuất hiện của CPV-2 ở Hy Lạp và Bỉ từ năm 1974 đến năm 1976 (Schwers et al., 1979; Koptoulos et al., 1986), trong khi lần đầu phát hiện CPV-2 ở Mỹ, Nhật Bản và Úc vào đầu năm 1978 (Parrish, 1999).

Kể từ đấy, virus đã phổ biến trên chó trên toàn cầu (Parrish, 1999). Năm 1979, những con sói hoang dã ở Mỹ cũng bị lây nhiễm nặng (Thomas et al. Tuy nhiên, chỉ sau khi xuất hiện từ 2-3 năm, CPV-2a đã thay thế toàn bộ CPV-2 ở các nước này cũng như ở Pháp và Đan Mạch (Parrish et al. Các tác giả đã chỉ ra 5 vị trí sai khác về amino acid ở protein VP2 giữa các chủng CPV-2a và các chủng CPV-2 (Parrish et al.

Ngoài loại kháng nguyên CPV-2a, còn có hai loại biến thể kháng nguyên khác là CPV-2b (hoặc VP2 426Asp) và CPV-2c (hoặc VP2 426Glu). CPV-2b lần đầu tiên được phát hiện năm1984 tại Mỹ (Parrish et al., 1991b) và CPV-2c được nhận dạng năm 2000 tại Ý (Buonavoglia et al. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Decaro và cs năm 2007 cho thấy dòng CPV-2c lâu nhất đã được phân lập năm 1996. Đây là bằng chứng cho thấy biến thể này đã được lưu hành ở Đức 4 năm trước khi được phát hiện lần đầu tiên ở Ý.

Kiểm tra huyết thanh thu được từ chó sói hoang dã (Canis latrans) giữa năm 1979 và 1984 tại Mỹ cũng chỉ ra rằng chúng ban đầu đã bị nhiễm CPV-2 (Thomas et al., 1984), nhưng sau năm 1980 chó sói con đã bị nhiễm với CPV-2a và CPV-2b (Parrish et al. Các kiể u gen khác nhau của CPV-2 được xác định ở một số vị trí quan trọng trên gen kháng nguyên VP2. Cụ thể như sau: giữa CPV-2a và CPV-2 được 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] phân biệt ở bốn vị trí Leu 87 Met, Thr 101 Ile, Gly 300 Ala và Tyr 305 Asp. Giữa các genotype CPV-2a, 2b và 2c được xác định ở vị trí 426 (Asn ở CPV-2a, Asp ở CPV-2b và Glu ở CPV-2c), là vị trí quan trọng trên gen kháng nguyên VP2 của parvovirus (Martella et al., 2006; Miranda and Thompson, 2016).

Mặc dù các triệu chứng lâm sàng của chó nhiễm CPV-2c cũng tương tự như với chó nhiễm CVP-2a và CPV-2b bao gồm chán ăn, nôn mửa, viêm dạ dày, ruột cấp tính, tiêu chảy, đi ngoài ra máu nhưng mức độ bệnh nặng hơn và nguy hiểm hơn (Aldaz et al., 2013; Decaro et al. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Cho đến hiện nay, đã có một số nghiên cứu về bệnh Parvo trên chó, tuy nhiên các nghiên cứu này mới chủ yếu tập trung vào khảo sát tỉ lệ nhiễm bệnh ở một số tỉnh và khu vực (Trần Ngọc Bích et al., 2013; Nguyễn Thị Yến Mai et al. Những nghiên cứu về virus gây bệnh, đặc biệt là các nghiên cứu về sinh học phân tử chưa có nhiều. Nakamura et al., 2004 đã công bố một nghiên cứu trên các mẫu CPV của chó và mèo.

Nghiên cứu này đã cho thấy có sự xuất hiện của chủng CPV-2b xuất hiện ở Việt Nam. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng có thể sẽ có sự tiến hóa của chủng CPV tại Việt Nam. Khảo sát mới nhấ t trên chó ta ̣i thành phố Hồ Chí Minh cho thấy có 2 chủng CPV-2a và CPV-2c đang lưu hành trong đó CPV-2c có xu hướng vượt trội (Nguyễn Văn Dũng, 2017; Nguyễn Văn Dũng và cs. Nghiên cứu gần đây của Đoàn Thị Thanh Hương và cộng sư ̣ đã phát hiê ̣n chủng Parvovirus type 2c đang lưu hành ta ̣i Hà Nội (Đoàn Thi ̣ Thanh Hương và cs.

ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS 2. Cấu tạo chung Canine Parvovirus có đường kính nhỏ (~25 nm), không có vỏ bao phủ. Cấu trúc ba chiều của CPV-2 đã được xác định nhờ sử dụng tia X (Tsao et al., 1991; Xie and Chapman, 1996). Loại virus này có bộ gen DNA thẳng, sợi đơn âm, kích thước khoảng 5.2kb, chứa hai khung đọc mở (ORF).

Một trong số đó mã hóa các protein không cấu trúc NS1NS2 và một khung khác mã hóa hai protein cấu trúc khác VP1 và VP2. Ở hai đầu của hệ gen, cấu trúc kẹp tóc đọc xuôi ngược giống nhau có 150 base được sử dụng cho việc tái bản DNA virus (Reed et al. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Capsid chứa 60 tiểu đơn vị protein của VP1 (5-6 bản) và VP2 (54-55 bản), những protein khác có chung cấu trúc. Các vùng mã hóa cho VP1 (727 amino acid) và VP2 (584 amino acid) chồng lên nhau, trừ một vùng đầu N duy nhất có 143 amino acid ở VP1 (Tsao et al., 1991; Agbandje et al.

Hai protein cấu trúc được tạo ra bằng cách nối tiếp các mRNA của virus (Reedet et al., 1988; Wang et al., 1998; Parrish and Kawaoka, 2005). Protein VP2 có thể được cắt gần đầu N của nó bằng các proteaza của vật chủ để tạo ra một protein cấu trúc khác, VP3, chỉ xuất hiện trong các virion hoàn chỉnh (chứa DNA). Các protein capsid có một lõi trung tâm gồm tám đoạn xoắn, β-barrel không song song với vòng linh hoạt giữa các sợi β tương tác để tạo thành hầu hết các capsid bề mặt. Các đặc điểm bề mặt của capsid bao gồm một vùng nhọn dài 22 Å trên trục gấp ba lần, một trũng sâu 15 Å (hẻm núi) xung quanh cấu trúc hình trụ ở trục gấp năm lần và một trũng sâu 15 Å (chỗ trũng) ở trục gấp hai lần.

Ngoài ra, trục gấp ba lần là vùng kháng nguyên nhất của capsid và hoạt động như một mục tiêu để trung hòa các kháng thể (Tsao et al., 1991; Agbandje et al. Cấu trúc capsid của CPV (Xie Q. Nguồn: http://www.edu/virusworld/images/cpv-pymol_surf01.jpg 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Vị trí xếp loại CPV-2 thuộc chi Protoparvovirus, họ Parvoviridae, đã được đưa vào trong loài Carnivore protoparvovirus 1 theo Uỷ ban quốc tế về phân loại virus (Tijssen et al.

Nguồn gốc của các kiểu gen chủng CPV-2 Mối quan hệ phát sinh loài giữa các CPV-2 phân lập từ chó và các virus từ mèo (FPV), chồn (MEV), chó gấu mèo (RDPV) và cáo xanh (BFPV) cho thấy rằng tất cả các chủng CPV xuất phát từ một tổ tiên chung và các chủng này rất giống với virus từ các động vật hoang dã bao gồm gấu mèo và cáo (Allison et al. CPV-2 có khả năng xuất hiện khi có đột biến cho phép liên kết với thụ thể transferrin của chó (TfR) type 1 (Truyen et al., 1996a; Shackelton et al., 2005; Allison et al. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng TfR đóng vai trò quan trọng trong tính nhạy cảm của các tế bào nhiễm virus này (Hueffer et al., 2003; Palemo et al.