Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học ứng dụng quy trình kỹ thuật multiplex pcr để phát hiện một số nhóm escherichia coli gây bệnh trong thực phẩm

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu công nghệ sinh học ứng dụng quy trình kỹ thuật multiplex pcr để phát hiện một số nhóm escherichia, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân,

• Tác giả: Lê Anh Đào
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Đỗ Phúc
• Trường học: Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Ứng dụng quy trình kỹ thuật Multiplex PCR phát hiện một số nhóm Escherichia coli gây bệnh trong thực phẩm
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Nguồn gốc tên gọi
• 1.2. Phân loại khoa học
• 1.3. Phân bố
• 1.4. Đặc điểm hình thái
• 1.5. Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
• 1.6. Phân loại E. coli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic E. coli - EPEC)
• 1.7. Ưu và nhược điểm của phản ứng Multiplex - PCR để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm
• 1.8. Ứng dụng của kỹ thuật Multiplex - PCR
• 1.9. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.10. Phương thức đánh giá hiệu lực phương pháp phân tích mới
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu
• 2.2. Dụng cụ - Thiết bị
• 2.3. Môi trường, hóa chất
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu
• 2.6. Qui trình Multiplex - PCR
• 2.7. Khảo sát độ đặc hiệu của các cặp mồi dùng cho phát hiện các gen gây bệnh của các nhóm E. coli gây bệnh (EPEC, ETEC và EHEC) bằng phản ứng PCR đơn
• 2.8. Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp Multiplex - PCR dùng cho phát hiện các gen gây bệnh của các nhóm E. coli (EPEC, ETEC và EHEC) bằng các chủng không đích
• 2.9. Khảo sát các thông số kỹ thuật của qui trình Multiplex - PCR: giới hạn phát hiện, độ nhạy tương đối, độ chính xác tương đối, độ đặc hiệu tương đối, tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả theo ISO/TS 16140
• 2.10. Ứng dụng phương pháp Multiplex - PCR để xác định nhóm E. coli gây bệnh (EPEC, ETEC và EHEC) trên các chủng E. coli phân lập được từ các mẫu thực phẩm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Khảo sát độ đặc hiệu của các cặp mồi dùng cho phát hiện các gen gây bệnh của các nhóm E. coli gây bệnh (EPEC, ETEC và EHEC) bằng phản ứng PCR đơn
• 3.2. Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp Multiplex - PCR bằng các chủng không đích
• 3.3. Khảo sát các thông số kỹ thuật của phương pháp Multiplex - PCR: giới hạn phát hiện, độ nhạy tương đối, độ chính xác tương đối, độ đặc hiệu tương đối, tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả theo ISO/TS 16140 (2003)
• 3.4. Giới hạn phát hiện (LOD)
• 3.5. Ứng dụng phương pháp Multiplex - PCR để xác định nhóm E. coli gây bệnh (EPEC, ETEC và EHEC) trên các chủng E. coli phân lập được từ các mẫu thực phẩm
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Multiplex PCR và E

Multiplex PCR là một kỹ thuật phân tử tiên tiến, cho phép phát hiện đồng thời nhiều mục tiêu gen trong một phản ứng duy nhất. Kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiện E. Coli, đặc biệt là các chủng gây bệnh trong thực phẩm. E. Coli là một vi khuẩn phổ biến trong đường ruột, nhưng một số chủng có thể gây ra các bệnh nghiêm trọng như tiêu chảy, viêm ruột, và thậm chí tử vong. Việc phát hiện E. Coli kịp thời là yếu tố quan trọng trong an toàn thực phẩm.

1.1. Ứng dụng của Multiplex PCR

Ứng dụng PCR trong phân tích vi sinh giúp xác định nhanh chóng và chính xác các chủng E. Coli gây bệnh. Kỹ thuật này không chỉ tiết kiệm thời gian mà còn giảm chi phí so với các phương pháp truyền thống. Multiplex PCR đặc biệt hữu ích trong việc phát hiện đồng thời các gen độc lực như LT, ST, bfpA, eaeA, stx1, và stx2, giúp xác định các nhóm E. Coli gây bệnh như EPEC, ETEC, và EHEC.

1.2. Tầm quan trọng của phát hiện E. Coli

Việc phát hiện E. Coli trong thực phẩm là yếu tố then chốt để ngăn ngừa các vụ ngộ độc thực phẩm. Các chủng E. Coli gây bệnh có thể gây ra các triệu chứng từ nhẹ đến nặng, thậm chí tử vong. Kỹ thuật PCR giúp xác định nhanh chóng các chủng này, đóng góp vào việc đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

II. Phương pháp và quy trình nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào việc ứng dụng Multiplex PCR để phát hiện E. Coli gây bệnh trong các mẫu thực phẩm. Quy trình bao gồm các bước: khảo sát độ đặc hiệu, đánh giá các thông số kỹ thuật như giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ chính xác, và áp dụng kỹ thuật để xác minh các nhóm E. Coli gây bệnh. Các mẫu thực phẩm được thu thập và xử lý theo tiêu chuẩn ISO/TS 16140.

2.1. Khảo sát độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu của các cặp mồi được khảo sát để đảm bảo chúng chỉ phản ứng với các chủng E. Coli mục tiêu. Kết quả cho thấy các cặp mồi có độ đặc hiệu cao, không phản ứng chéo với các vi khuẩn không đích như Salmonella, Shigella, và Staphylococcus aureus.

2.2. Đánh giá thông số kỹ thuật

Các thông số kỹ thuật như giới hạn phát hiện, độ nhạy, và độ chính xác được đánh giá. Multiplex PCR có giới hạn phát hiện từ 1-7 CFU/25g tùy loại mẫu, độ nhạy và độ chính xác đạt 90-100%. Điều này khẳng định hiệu quả của kỹ thuật trong việc phát hiện E. Coli gây bệnh.

III. Kết quả và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của Multiplex PCR trong việc phát hiện E. Coli gây bệnh trong các mẫu thực phẩm. Kỹ thuật này có thể phát hiện đồng thời các gen độc lực của EPEC, ETEC, và EHEC với độ chính xác cao. Kết quả này có ý nghĩa lớn trong việc giám sát và điều tra các vụ ngộ độc thực phẩm, góp phần nâng cao an toàn thực phẩm.

3.1. Giới hạn phát hiện

Giới hạn phát hiện của Multiplex PCR là 1-3 CFU/25g đối với mẫu sữa, 2-6 CFU/25g đối với mẫu thủy sản, và 2-7 CFU/25g đối với mẫu thịt. Điều này cho thấy kỹ thuật có độ nhạy cao, phù hợp với việc kiểm soát chất lượng thực phẩm.

3.2. Ứng dụng trong thực tiễn

Multiplex PCR đã được áp dụng để xác định các nhóm E. Coli gây bệnh trong các mẫu thực phẩm từ các vụ ngộ độc. Kết quả cho thấy kỹ thuật này có thể phát hiện chính xác các chủng gây bệnh, giúp điều tra nguyên nhân và ngăn ngừa các vụ ngộ độc trong tương lai.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã khẳng định hiệu quả của Multiplex PCR trong việc phát hiện E. Coli gây bệnh trong thực phẩm. Kỹ thuật này không chỉ tiết kiệm thời gian và chi phí mà còn có độ chính xác cao, phù hợp với việc kiểm soát chất lượng an toàn thực phẩm. Cần tiếp tục nghiên cứu với quy mô lớn hơn để hoàn thiện và mở rộng ứng dụng của kỹ thuật này.

4.1. Kiến nghị

Cần triển khai Multiplex PCR rộng rãi trong các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thực phẩm để nâng cao hiệu quả giám sát và điều tra các vụ ngộ độc thực phẩm. Đồng thời, cần nghiên cứu thêm về các chủng E. Coli mới nổi để cập nhật các cặp mồi phù hợp.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong những năm gần đây, các nhóm Escherichia coli (E. coli) gây bệnh đã trở thành tác nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm, chiếm tỷ lệ khoảng 20-30% các trường hợp tiêu chảy liên quan đến vi sinh vật. Các chủng E. coli gây bệnh như Enteropathogenic E. coli (EPEC), Enterotoxigenic E. coli (ETEC) và Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) có khả năng gây ra các triệu chứng rối loạn tiêu hóa từ nhẹ đến nặng, thậm chí tử vong, tùy thuộc vào mức độ nhiễm và khả năng đáp ứng của từng cá nhân. Việc phát hiện chính xác các nhóm E. coli này trong thực phẩm là rất cần thiết để điều tra nguyên nhân các vụ ngộ độc và đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm.

Mục tiêu nghiên cứu là ứng dụng quy trình kỹ thuật Multiplex-PCR để phát hiện đồng thời các gen độc lực đặc trưng của các nhóm E. coli gây bệnh trong mẫu thực phẩm, bao gồm các gen LT, ST, bfpA, eaeA, stx1 và stx2. Nghiên cứu được thực hiện tại thành phố Hồ Chí Minh trong năm 2013, với phạm vi khảo sát trên các mẫu thực phẩm phổ biến như sữa, thủy sản và thịt chế biến. Việc áp dụng kỹ thuật Multiplex-PCR giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán, tăng độ nhạy và độ đặc hiệu so với các phương pháp truyền thống, góp phần nâng cao hiệu quả giám sát và phòng chống ngộ độc thực phẩm.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các phương pháp xét nghiệm nhanh, chính xác, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho các cơ quan quản lý an toàn thực phẩm trong việc kiểm soát và xử lý các vụ ngộ độc do E. coli gây ra.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết về đặc điểm sinh học và phân loại E. coli gây bệnh: E. coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng sinh độc tố và gây bệnh qua đường tiêu hóa. Các nhóm EPEC, ETEC và EHEC được phân biệt dựa trên các gen độc lực đặc trưng như bfpA, eaeA (EPEC), LT, ST (ETEC), stx1, stx2 (EHEC).

• Mô hình kỹ thuật Multiplex-PCR: Phản ứng PCR đa mồi cho phép khuếch đại đồng thời nhiều đoạn gen mục tiêu trên một mẫu DNA duy nhất, tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời tăng hiệu quả phát hiện các nhóm vi khuẩn gây bệnh.

• Khái niệm về các thông số kỹ thuật của phương pháp xét nghiệm: Giới hạn phát hiện (LOD), độ nhạy tương đối (SE), độ đặc hiệu tương đối (SP), độ chính xác tương đối (AC), tỷ lệ dương tính giả (PD) và âm tính giả (ND) theo tiêu chuẩn ISO/TS 16140:2003.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nghiên cứu sử dụng các chủng chuẩn E. coli gây bệnh (EPEC, ETEC, EHEC) và các chủng vi khuẩn không đích như Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus để khảo sát độ đặc hiệu và tính chọn lọc của phương pháp. Mẫu khảo sát gồm 157 mẫu thực phẩm chế biến (thịt, thủy sản, sữa) thu thập tại các siêu thị ở TP. Hồ Chí Minh.

• Phương pháp phân tích: DNA được chiết xuất từ các mẫu và chủng vi khuẩn, sau đó thực hiện phản ứng Multiplex-PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho các gen độc lực LT, ST, bfpA, eaeA, stx1, stx2. Kết quả được phân tích bằng điện di gel agarose để xác định sự có mặt của các đoạn gen mục tiêu.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 6 đến tháng 11 năm 2013, bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, tối ưu hóa quy trình PCR, khảo sát các thông số kỹ thuật và ứng dụng trên mẫu thực phẩm thực tế.

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: 157 mẫu thực phẩm được chọn ngẫu nhiên từ các siêu thị nhằm đảm bảo tính đại diện cho các loại thực phẩm phổ biến có nguy cơ nhiễm E. coli gây bệnh.

• Lý do lựa chọn phương pháp phân tích: Multiplex-PCR được chọn vì khả năng phát hiện đồng thời nhiều gen độc lực trong một phản ứng, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời tăng độ chính xác và độ nhạy so với các phương pháp đơn lẻ.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Độ đặc hiệu của các cặp mồi PCR: Các cặp mồi được thiết kế đặc hiệu hoàn toàn với các chủng chuẩn EPEC, ETEC và EHEC, không khuếch đại các chủng không đích như Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Enterobacter sakazakii, Pseudomonas aeruginosa và Listeria monocytogenes. Độ đặc hiệu tương đối đạt 100% trên 3 nhóm mẫu thực phẩm.

2. Giới hạn phát hiện (LOD): Phương pháp Multiplex-PCR có khả năng phát hiện vi khuẩn ở mức rất thấp, cụ thể: 1-3 CFU/25g đối với mẫu sữa, 2-6 CFU/25g đối với mẫu thủy sản và 2-7 CFU/25g đối với mẫu thịt. Đây là mức phát hiện phù hợp với yêu cầu giám sát an toàn thực phẩm.

3. Độ nhạy, độ chính xác và độ đặc hiệu tương đối: Trên 3 nhóm mẫu thực phẩm khảo sát, độ nhạy tương đối, độ chính xác tương đối và độ đặc hiệu tương đối của phương pháp đạt từ 90% đến 100%, cho thấy quy trình Multiplex-PCR có hiệu quả cao trong phát hiện các nhóm E. coli gây bệnh.

4. Tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả: Tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả đều dưới 10%, phù hợp với tiêu chuẩn ISO/TS 16140:2003, đảm bảo tính tin cậy của phương pháp trong thực tế giám sát.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy kỹ thuật Multiplex-PCR là một công cụ hiệu quả, nhanh chóng và chính xác để phát hiện đồng thời các nhóm E. coli gây bệnh trong thực phẩm. Độ đặc hiệu cao giúp tránh được các kết quả dương tính giả do phản ứng chéo với các vi khuẩn không đích, điều này được minh chứng qua việc không phát hiện sản phẩm PCR trên các chủng vi khuẩn khác.

Giới hạn phát hiện thấp cho phép phát hiện vi khuẩn ở mức độ rất nhỏ, phù hợp với yêu cầu kiểm soát an toàn thực phẩm, đặc biệt trong các mẫu thực phẩm có mật độ vi khuẩn thấp. Độ nhạy và độ chính xác tương đối cao so với phương pháp nuôi cấy truyền thống giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán từ vài ngày xuống còn vài giờ, góp phần nâng cao hiệu quả giám sát và xử lý kịp thời các vụ ngộ độc thực phẩm.

So sánh với các nghiên cứu trong và ngoài nước, kết quả này tương đồng với các báo cáo về ứng dụng Multiplex-PCR trong phát hiện E. coli gây bệnh trên mẫu bệnh phẩm và thực phẩm. Tuy nhiên, nghiên cứu cũng chỉ ra cần mở rộng quy mô mẫu và đa dạng loại mẫu để đánh giá toàn diện hơn giá trị sử dụng của phương pháp.

Dữ liệu có thể được trình bày qua các biểu đồ thể hiện độ nhạy, độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện trên từng loại mẫu thực phẩm, cũng như bảng tổng hợp các thông số kỹ thuật của phương pháp Multiplex-PCR so với phương pháp nuôi cấy truyền thống.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai áp dụng quy trình Multiplex-PCR trong giám sát an toàn thực phẩm: Khuyến nghị các cơ quan quản lý và phòng kiểm nghiệm thực phẩm áp dụng kỹ thuật Multiplex-PCR để phát hiện nhanh các nhóm E. coli gây bệnh, nhằm nâng cao hiệu quả kiểm soát ngộ độc thực phẩm. Thời gian thực hiện: trong vòng 1 năm tới.

2. Mở rộng nghiên cứu với quy mô mẫu lớn hơn và đa dạng hơn: Thực hiện các nghiên cứu bổ sung với số lượng mẫu lớn hơn, bao gồm nhiều loại thực phẩm khác nhau để đánh giá toàn diện giá trị sử dụng và tính ứng dụng rộng rãi của phương pháp. Chủ thể thực hiện: các viện nghiên cứu và trường đại học chuyên ngành công nghệ sinh học, trong 2-3 năm tiếp theo.

3. Đào tạo và nâng cao năng lực cho cán bộ kỹ thuật: Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật Multiplex-PCR cho cán bộ phòng xét nghiệm nhằm đảm bảo quy trình được thực hiện chính xác, hiệu quả và đồng bộ trên toàn quốc. Thời gian: trong 6 tháng tới.

4. Phát triển hệ thống giám sát và cảnh báo sớm ngộ độc thực phẩm: Kết hợp kỹ thuật Multiplex-PCR với hệ thống thu thập và phân tích dữ liệu để xây dựng mạng lưới giám sát ngộ độc thực phẩm hiệu quả, giúp phát hiện sớm và xử lý kịp thời các vụ ngộ độc do E. coli gây ra. Chủ thể thực hiện: cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm, trong vòng 2 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học: Luận văn cung cấp kiến thức chuyên sâu về đặc điểm sinh học của các nhóm E. coli gây bệnh và ứng dụng kỹ thuật Multiplex-PCR trong phát hiện vi sinh vật gây bệnh, hỗ trợ nghiên cứu và học tập.

2. Cán bộ kỹ thuật và chuyên gia phòng xét nghiệm thực phẩm: Tài liệu hướng dẫn chi tiết quy trình Multiplex-PCR, các thông số kỹ thuật và cách đánh giá hiệu quả phương pháp, giúp nâng cao năng lực xét nghiệm và chẩn đoán nhanh các tác nhân gây ngộ độc.

3. Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và y tế dự phòng: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng các chính sách, quy trình giám sát và kiểm soát ngộ độc thực phẩm do E. coli, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

4. Doanh nghiệp sản xuất và kinh doanh thực phẩm: Hiểu rõ về nguy cơ ô nhiễm E. coli gây bệnh và các phương pháp phát hiện nhanh, giúp doanh nghiệp nâng cao chất lượng sản phẩm và tuân thủ các quy định an toàn thực phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Multiplex-PCR là gì và ưu điểm của nó so với PCR đơn lẻ?
   Multiplex-PCR là kỹ thuật khuếch đại đồng thời nhiều đoạn gen mục tiêu trong một phản ứng PCR duy nhất. Ưu điểm là tiết kiệm thời gian, chi phí và mẫu thử, đồng thời tăng hiệu quả phát hiện nhiều tác nhân gây bệnh cùng lúc.

2. Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp Multiplex-PCR trong nghiên cứu này là bao nhiêu?
   Phương pháp có thể phát hiện từ 1-3 CFU/25g mẫu sữa, 2-6 CFU/25g mẫu thủy sản và 2-7 CFU/25g mẫu thịt, cho thấy độ nhạy cao phù hợp với yêu cầu giám sát an toàn thực phẩm.

3. Phương pháp Multiplex-PCR có thể phân biệt được vi khuẩn sống và chết không?
   Phương pháp PCR không phân biệt được vi khuẩn sống hay chết vì phát hiện DNA tổng thể. Tuy nhiên, kết hợp bước nuôi cấy làm giàu trước khi PCR giúp tăng khả năng phát hiện vi khuẩn sống.

4. Tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của phương pháp này như thế nào?
   Tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả đều dưới 10%, đáp ứng tiêu chuẩn ISO/TS 16140:2003, đảm bảo độ tin cậy và chính xác của phương pháp trong thực tế.

5. Phương pháp này có thể áp dụng cho các loại thực phẩm khác ngoài sữa, thịt và thủy sản không?
   Có thể áp dụng cho nhiều loại thực phẩm khác nhau, tuy nhiên cần nghiên cứu bổ sung để đánh giá hiệu quả trên từng loại mẫu cụ thể nhằm đảm bảo độ nhạy và đặc hiệu.

Kết luận

• Kỹ thuật Multiplex-PCR đã được phát triển và tối ưu hóa để phát hiện đồng thời các gen độc lực đặc trưng của nhóm E. coli gây bệnh (EPEC, ETEC, EHEC) trong mẫu thực phẩm.
• Phương pháp có độ đặc hiệu và độ nhạy tương đối cao, giới hạn phát hiện thấp, phù hợp với yêu cầu giám sát an toàn thực phẩm.
• Tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả đều nằm trong giới hạn cho phép, đảm bảo tính tin cậy của kết quả xét nghiệm.
• Nghiên cứu đề xuất mở rộng quy mô mẫu và đa dạng loại mẫu để đánh giá toàn diện hơn giá trị sử dụng của phương pháp.
• Khuyến nghị triển khai áp dụng kỹ thuật Multiplex-PCR trong giám sát và điều tra ngộ độc thực phẩm do E. coli gây ra, đồng thời đào tạo cán bộ kỹ thuật và phát triển hệ thống giám sát hiệu quả.

Các cơ quan quản lý và phòng xét nghiệm nên phối hợp triển khai áp dụng quy trình Multiplex-PCR, đồng thời thực hiện các nghiên cứu mở rộng để hoàn thiện phương pháp. Độc giả quan tâm có thể liên hệ các đơn vị nghiên cứu để nhận hỗ trợ kỹ thuật và đào tạo chuyên sâu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TONG QUANN. ngnnenesenessie 4 Bi ng ố ẽ. Nguồn gốc tên gọi. Đặc điểm hình thai.

Đặc điểm nuôi cay và đặc điểm sinh hóa. Đặc điểm cau trúc kháng nguyÊn. Khả năng gây bệnh. - - -GG HH re 8 1.

Phân loại FE. coli gáy bệnh đường ruột (Enteropathogenic E. coli - EPEC) wiecccccccsssscceessnccccesenececeesseeeeseseeccessneeeceseeaeeeeseeaeeeceeeaeeceeenaeeseneqnaees 9 1. coli sinh độc tổ ruột (Enterotoxigenic E.

coli xâm nhập đường ruột (Enteroinvasive E.coli gây chảy máu đường ruột (Enterohemorrhagic E. coli kết dinh ruột (Enteroaggregative E. coli kết dính phân tán (Diffusely Adherent E. 5c St S1 1 111211111111 2111 111101211111 110111 11011111200 29 Luận văn Thạc sĩ Vil 1.

Ưu và nhược điểm của phan ứng Multiplex - PCR dé phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm .------ - + 5E EE+ SE SEEEEE9 E1 111115151521 11 7115111111 xe. Ứng dụng của kỹ thuật Multiplex - PCR. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƯỚC. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam.

Tình hình nghiên cứu trên thé giới. Phuong thức đánh giá hiệu lực phương pháp phân tích mới. 34 CHƯƠNG 2: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vat LSU oo.

Nguyên vật lIỆU.- ng kg 36 VIINNN°s. Dụng cụ - Thiét bị. Môi trường, hóa chất. Môi trường và hóa chat dùng cho phương pháp nuôi cấy.

Hóa chất dùng cho phản ứng Multiplex - PCR. Hóa chất dùng cho phat hiện kết qua bằng điện đi. Phương pháp nghiÊn CỨU. Mô hình nghiÊn CỨU.

Phương pháp tiễn hành .-- + 2-2 S2 S2 SE2E£E£E2EEEEEEEEEEEEEEEEEErkrrrrree Al 2. Phương pháp lấy mẫu và xử lý MAU vesececccccscscscssssssesesesescsesssssssessesees 41 2. Qui trình Multiplex - PCT. Khao sat độ đặc hiệu của các cặp moi ding cho phat hiện các gen cáy bệnh cua các nhóm E.

coli gáy bệnh (EPEC, ETEC va EHEC) bang phan ting PCR AON RERRRRRRRNHAAẠAiii. Khao sát độ chon lọc cua phương pháp Multiplex - PCR dùng cho phat hiện các gen gây bệnh cua các nhóm E. coli (EPEC, ETEC và EHEC) bằng các chủng không đÍch.- + +55c+ccece+ectsesrerered 43 Luận văn Thạc sĩ Vill 2. Khảo sát các thông số kỹ thuật của qui trình Multiplex - PCR: giới hạn phái hiện, độ nhạy tương đối, độ chính xác tương đối, độ đặc hiệu tương doi, ty lệ dương tính giả và âm tính giả theo ISO/TS 16140 0200 Ẽ—.

Ứng dụng phương pháp Multiplex - PCR dé xác định nhóm E. coli cáy bệnh (EPEC, ETEC và EHEC) trên các chung E. coli phân lap được từ các mẫu thực PRG vescececsccecscssecescesssssessesessssssssssesssssssssseseessen 46 CHƯƠNG 3: KET QUÁ NGHIÊN CỨYU. Khảo sát độ đặc hiệu của các cặp môi dùng cho phát hiện các gen gây bệnh của các nhóm E.

coli gây bệnh (EPEC, ETEC và EHEC) bang phản ứng PCR đơn. Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp Multiplex - PCR băng các chủng không đÍch. Khảo sát các thông số kỹ thuật của phương pháp Multiplex - PCR: giới hạn phát hiện, độ nhạy tương đối, độ chính xác tương đối, độ đặc hiệu tương đối, tý lệ dương tính gia và âm tính giả theo ISO/TS 16140 (2003). Giới hạn phát hiện (LOÏ).

Ứng dụng phương pháp Multiplex - PCR để xác định nhóm E. coli gây bệnh (EPEC, ETEC va EHEC) trên các chủng E. coli phân lập được từ các mẫu thực PHAM 00. 58 CHƯƠNG 4: KET LUẬN - KIÊN NGHI.

s11 121v 5191919111 51110151111 1010101111 H112 TT ng nen: 62 4. 63 TÀI LIEU THAM KHẢO. G2 E9 539113 3E 3128 1E 111121 3 xnxx ree 64 PHU LUC 2 67 Luận van Thạc si IX DANH MUC CAC TU VIET TAT AIE Attaching - Effacing AC Accuracy Base pair BFP Bundle — Forming Pilus CFAs Colonization Factor Antigens CFU Colony Forming Unit cAMP Cyclic Adenosine Monophosphate DAEC Diffusely Adherent E. coli DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxynucleotide Triphosphates E.

coli Escherichia coli ETEC Enterotoxigenic E. coli EPEC Enteropathogenic E. coli EIEC Enteroinvasive E. coli EHEC Enterohaemorrhagic E.

coli EAEC Enteroaggregative E. coli ELISA Enzyme — Linked Immunosorbent Assay EAF EPEC Adherence Factor EC EC Broth FAS Fluorescent Actin Stain Fhly Enterohemolysin GC-C Guanylate Cyclase C Gbs Globotriaosylceramide HIV Human Immunodeficiency Virus HUS Hemolytic Uremic Syndrome Ipa Invasion Plasmid Antigen ISO International Organization for Standardization Kilobase Pair Luận van Thạc si LA Localized Adherence LT Heat — Labile Toxins LEE Locus of Enterocyte Effacement LOD Limit Of Detection MUG 4-methylumbelliferone Glucuronide ND Độ lệch âm NA Negative Agreement PCR Polymerase Chain Reaction PD Độ lệch dương PA Positive Agreement Rnase R A Exoribonuclease RNA Ribonucleic Acid STEC Shiga Toxigenic E. coli ST Heat — Stable Toxins STh ST Human STp ST Porcine Stx Shiga Toxin SMAC Sorbitol MacConkey SP Specificity SE Sensitivity TTP Thrombotic Thrombocytopenic Purpura TSA Tryptone Soya Agar VTEC Verocytoxin E. coli Luận van Thạc si XI DANH MỤC BANG Bang 1.1: Kiểu hình ETEC thông thường .2: Các loại huyết thanh thường gặp của E.

coli gây bệnh.3: Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả của PCR da locus.1: Thành phan primer mix của | phản ứng Multiplex - PCR .2: Thành phan master mix của 1 phản ứng Multiplex - PCR .3: Chu ky luân nhiệt của phản ứng Multiplex - PCR.4: Bảng xác định giá trị phương pháp .1: Kết quả khảo sát mức gây nhiễm của các nhóm E. coli gây bệnh (EPEC, ETEC và EHEC) trên các nền mẫu (sữa, thủy sản va thịt).2: Giới hạn phát hiện của phương pháp Multiplex - PCR trên các nền mẫu .3: Mức gây nhiễm 10 x LOD của các nhóm E. coli gây bệnh (EPEC, ETEC và EHEC) trên các nền mẫu (sữa, thủy sản và thịf.4: Bảng xác định giá trị phương pháp .5: Tính toán giá trị các thông số của phương pháp Multiplex — PCR trên các nén mẫu (sữa, thủy sản và thịf).6: Kết quả giá trị xác định giá trị sử dụng của phương pháp Multiplex - PCR trên 3 nên mẫu khảo sat .-- - - - + SE SE SE SE EEEkEEE 1515151311111 x xe 57 Bảng 3.7: Kết quả của phương pháp Multiplex - PCR trên các mẫu giám sát ngộ độc thực phẩm "V6 ằảằằŠằ 60 Luận văn Thạc sĩ XI DANH MỤC HÌNH Hình 1. coli dưới kính hiển vi điện tử .2: Các cách thức gây bệnh của các E.

coli gay tiêu chảy .1: Khảo sát độ đặc hiệu của từng cặp môi của các gen gây bệnh bang phản UNG PCR ON 01177 .2: Kết qua khảo sát tinh chon loc của phương pháp Multiplex - PCR với các vi khuẩn không dich .---- - ¿2E 2E SE SE 2E£E#EEEEEEEEEE9 5 1212111151511 11 71151111 ck.a: Giới hạn phát hiện của phương pháp Multiplex - PCR trên nền mẫu sữa Hình 3.b: Giới hạn phát hiện của phương pháp Multiplex - PCR trên nền mẫu 010007 .c: Giới hạn phát hiện của phương pháp Multiplex - PCR trên nền mẫu thịt Luận văn Thạc sĩ CHUONG MO DAU Ngộ độc thực phẩm xảy ra ngày càng nhiều ở nhiều dia phương trong cả nước, nó không chỉ xảy ra ở các nhà ăn tập thê (nhà máy, xí nghiệp, trường học, .) mà còn xảy ra ở rất nhiều gia đình, kế cả ở thành thị và nông thôn. Do đó ngộ độc thực phẩm đã trở thành mối quan tâm của toàn xã hội [6]. Có nhiều nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phan lớn các trường hop có nguồn gốc từ vi sinh vật. Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra do nguyên liệu dùng chế biến hay thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn.

Đứng dau trong các căn nguyên vi khuẩn là các Escherichia coli gây tiêu chảy, chiếm tỉ lệ khoảng 20 - 30% [5]. Trong những năm gần đây, Escherichia coli (E. coli) trở thành một tác nhân gây bệnh tiêu chảy nguy hiểm lây truyền qua con đường thực phẩm và có liên quan tới nhiều vụ ngộ độc của các nước trên thế giới, ngay ở cả các nước phát triển như Anh, Nhật, Mỹ, Đức. 12 người đã chết trong một 6 dịch tai Nhật Bản năm 1996; hơn 9.000 mắc bệnh và 7 trường hợp tử vong trong một đợt dịch tại Canada năm 2000; chủng E.

coli mới đã gay bệnh cho hơn 1.500 người, trong đó 470 người bị biến chứng suy thận hiếm gap, 18 người tử vong và phan lớn là ở Đức vào năm 2011 [28]. Vì thế, việc xác định được chính xác các nhóm E. coli gây bệnh nhiễm trong thực phẩm là rất cần thiết. coli là vi sinh vật hiếu khí tùy ý hiện diện trong đường ruột của người và các loài động vật máu nóng.

Hầu hết các dòng E. coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng trong việc Ôn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên có 4 dòng có thé gây bệnh cho người và một số loài động vật là Enterotoxigenic E. coli (EPEC), Enteroinvasive EF.

coli (EIEC), và Enterohemorrhagic E. coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bi 6 nhiễm phân hay chất thải hữu co, phát triển và tôn tại rất lâu trong môi trường. coli gây bệnh gây ra các triệu chứng rối loạn đường tiêu hóa. Biểu hiện lâm sàng thay đổi từ Luận văn Thạc sĩ nhẹ đến rất nặng, có thể gây chết người phụ thuộc vào mức độ nhiễm, dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của mỗi người [8].

Dé phân biệt giữa E. coli không gây bệnh với các nhóm E. coli gay bệnh thì không chỉ dựa vào các thử nghiệm như: hình thái khuẩn lạc, sinh vật hóa học hay thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh. Nếu sử dung kháng huyết thanh thì phải tốn nhiều thời gian và chi phí cao.

coli gây bệnh người ta thường dựa vào việc phát hiện các độc lực của các chủng E. Nhưng việc xác định độc lực của E. coli thường dùng kỹ thuật ELISA, kỹ thuật nay tốn kém, do vay, việc phát hiện các nhóm E. coli gay bệnh dựa vào việc xác định kiểu gene điều khiến sinh độc tô bang kỹ thuật PCR dang được triển khai ở nhiều phòng kiểm nghiệm trên thế giới.

Hiện nay, hầu hết các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về phát triển các kỹ thuật dùng cho xác định các nhóm E. coli gây bệnh chủ yếu trên nền mẫu bệnh phẩm. Có nhiều nghiên cứu đã được công bố về các phương pháp PCR sử dụng đơn môi dùng cho phát hiện E. coli gây bệnh [26].

Tuy nhiên, nếu cặp mỗi đơn được sử dụng trong các phan ứng PCR riêng biệt thì sự định danh các nhóm E. coli gây bệnh đòi hỏi phải thực hiện một số lượng lớn phản ứng PCR. Vì thế, để giảm số lượng các phản ứng PCR dùng cho chan đoán các nhóm E. coli gây bệnh đã có nhiều nghiên cứu phát triển kỹ thuật Multiplex - PCR đã được công bố [16, 20, 26].

Tuy nhiên, cho đến nay vẫn còn rất ít các nghiên cứu kỹ thuật Multiplex - PCR xác định các nhóm E. coli gây bệnh trong các mẫu thực phẩm. Mặt khác, trong công tác giám sát và điều tra ngộ độc cho thấy răng tỉ lệ phân lập chủng E. coli từ các mẫu ngộ độc khá cao, nhưng việc xác định các nhóm E.

coli gây bệnh vẫn chưa được triển khai.