MỞ ĐẦU Chứng hơi thở hôi là căn bệnh phổ biến có nhiều yếu tố nguyên nhân. Các mùi khó chịu phát ra từ khoang miệng được cho là từ các thực phẩm nặng mùi, như tỏi và hành; từ vài loại dược phẩm; từ cơ thể; từ các bệnh hệ thống; từ các nhiễm trùng khác và từ vi khuẩn. Vài con đường liên quan với chứng hơi thở hôi, bao gồm đường thở (mũi, xoang, họng và phổi), đường tiêu hóa, và vài cơ quan như thận, gan. Mặc dù có rất nhiều nguyên nhân liên quan đến chứng hơi thở hôi, ước tính khoảng 80 – 90% mùi hôi là xuất phát từ miệng và vi khuẩn chịu trách nhiệm trực tiếp cho các khí có mùi khó chịu này.
Các nhà nghiên cứu đã xác định được vài vi sinh vật sản sinh ra các mùi khó chịu và giải thích thỏa đáng về các điều kiện cần thiết cho sự sinh tổng hợp mùi hôi, đó là: vi khuẩn yếm khí, sự thiếu hụt oxy, pH kiềm và các chất nền có chứa sulfur. Các sản phẩm hóa học từ sự phân hủy của vi khuẩn là hợp chất lưu huỳnh bay hơi (volatile sulfur compounds - VSCs) có mùi hôi thối và được xác định là chịu trách nhiệm cho hơi thở hôi. Các hợp chất lưu huỳnh bay hơi như hydrogen sulfide, methyl mercaptan, dimethyl sulfide và dimethyl disulfide chiếm hơn 90% mùi của sự phân hủy từ miệng. Bằng phương pháp in vitro, McNamara và cộng sự (1972) đã chứng minh rằng sự tạo thành mùi của sự phân hủy có liên quan với sự hoán chuyển trong quần thể vi sinh vật từ sự trội hơn của Gram dương sang sự trội hơn của quần thể yếm khí Gram âm.
Không có vi sinh vật Gram dương nào sản sinh ra mùi khó chịu trong khi tất cả vi sinh vật Gram âm (Fusobacterium polymorphum, Veillonella alcalescens, Bacteroides fundiliformis, Klebsiella pneumoniae) lại sản sinh ra mùi phân hủy. Trong một nghiên cứu tương tự, Solis-Gaffar và cộng sự (1980) đã tìm ra rằng chỉ có các vi sinh vật Gram âm (Veillonella alcalescens, Fusobacterium nucleatum, Bacteroides melanogenicus và Klebsiella pneumoniae) sản sinh ra hợp chất lưu huỳnh bay hơi. 2 Một số nghiên cứu cho thấy rằng hợp chất lưu huỳnh bay hơi của chứng hôi miệng góp phần vào sự phát sinh bệnh viêm nha chu. Điều trị chứng hơi thở hôi là phải trực tiếp loại bỏ hay ít nhất làm giảm các vi sinh vật gây bệnh và các chất nền liên kết.
NISIN đã được nghiên cứu rất nhiều về hiệu quả của nó đối với các vi khuẩn gây bệnh răng miệng (xem phần 1. Điểm nổi bật hơn là khi sử dụng nisin cùng với các chất kết hợp như disodium EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), calcium EDTA, EGTA (ethyleneglycoltetraacetic acid), lactate, sodium hexametaphosphate, alkyldiamine tetraacetates … thì sự kết hợp này làm tăng cả về độ rộng phổ lẫn hoạt lực kháng khuẩn của nisin lên các vi khuẩn Gram âm. Trên cơ sở đó, đề tài “Đánh giá ảnh hưởng của nước súc miệng chứa nisin và disodium EDTA lên các vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi” hướng đến những mục tiêu và nội dung sau: Mục tiêu chung Nghiên cứu này đưa ra công thức nước súc miệng chứa nisin, một chất chống khuẩn bản chất sinh học (bacteriocin), và chất kết hợp (chelating agent/chelator) disodium EDTA với mục tiêu đánh giá ảnh hưởng của công thức này lên các vi khuẩn Gram âm (Fusobacterium nucleatum, Klebsiella pneumoniae) gây hơi thở hôi nói riêng và gây bệnh răng miệng nói chung. Nội dung Nội dung 1: Nghiên cứu in vitro đánh giá ảnh hưởng của phức nisin và disodium EDTA lên hệ vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi.
Nội dung 2: Khảo sát in vivo ảnh hưởng của nghiệm thức tối ưu từ nội dung 1 lên hệ vi khuẩn yếm khí gây hơi thở hôi. So sánh hiệu quả của công thức đề nghị với một sản phẩm nước súc miệng diệt vi khuẩn gây hôi miệng thông dụng trên thị trường. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu Bacteriocin là một trong số các chất chống khuẩn sản sinh bởi lactic acid bacteria (LAB), cùng với các thành phần chống khuẩn khác là các acid hữu cơ, hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl và các enzyme ức chế.
Bacteriocin là các peptide hoặc các protein được tổng hợp ribosom và thường hoạt động chống lại các loài có quan hệ gần. Bacteriocin khác với các kháng sinh truyền thống trong cách thức chủ yếu là: chúng có phổ kháng khuẩn tương đối hẹp và chỉ độc đối với các vi khuẩn có quan hệ gần với chủng sản xuất. Những độc tố này được tìm thấy trong tất cả các dòng vi khuẩn chính và gần đây, chúng cũng được biết là được sản xuất bởi một vài thành viên của cổ khuẩn (Archaea). Bacteriocin của LAB thường mang điện dương, chứa ít hơn 100 amino acid và có chứa phần nhiều (hơn 30%) các amino acid kị nước.
Điện dương của các peptide này đảm bảo lực hút tĩnh điện với màng ngoài vi khuẩn tích điện âm, trong đó phần kị nước của peptide sẽ tương tác với màng tế bào và xâm nhập vào màng đôi phospholipid. Bacteriocin được xem như là peptide bảo vệ và vì thế được xếp vào nhóm tương tự như độc tố nấm men, hay defensin của động vật có vú, cecropin của côn trùng, tachyplesin của cua, magainin của động vật lưỡng cư, pandanin của bọ cạp, và thionin của thực vật. Phần lớn bacteriocin có phổ kháng khuẩn tương đối hẹp, nghĩa là chỉ có một số loài xác định, thường là những loài có quan hệ phát sinh loài gần với chủng sản xuất bị ảnh hưởng. Tuy nhiên, vài bacteriocin bộc lộ phổ kháng khuẩn rộng hơn nhiều và còn mở rộng ra đến động vật nguyên sinh, nấm men, nấm mốc và virus [38].
Bacteriocin – nhìn lại lịch sử Nghiên cứu về ức chế nội vi khuẩn (inter-bacterial), cũng tương tự như nhiều khía cạnh cơ bản khác về vi sinh học, có thể tìm thấy sự liên quan về nguồn gốc của nó với Louis Pasteur. Vào năm 1877, Pasteur cùng với cộng sự Joubert của ông, đã tìm cách kiểm soát sự phát triển của anthrax bacillus, loài đã được báo cáo (cả in vivo và in vitro) về hoạt tính ức chế khi kết hợp cùng nuôi cấy với Escherichia coli được phân lập từ nước tiểu. 4 Phần lớn các thành công ban đầu trong việc xác định bản chất bacteriocin lại liên quan đến bacteriocin của vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là colicin và phần nhiều các kiến thức này là từ các công trình của Gratia và Fredericq. Một quan sát bước ngoặt trong các khảo sát về bacteriocin của vi khuẩn Gram dương ghi lại rằng một vài hoạt tính ức chế của lactococci (streptococci nhóm N) đối với các LAB khác là do một chất chống khuẩn có bản chất protein gọi là “chất ức chế nhóm N” hay còn gọi là nisin [40].
Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương LAB Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương đa dạng hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram âm. Trải qua nhiều năm, nhiều phương pháp phân loại bacteriocin đã được đưa ra [37]: Fredericq (1957) phân loại bacteriocin dựa trên đặc trưng hấp thu và các phân lớp phụ phù hợp với đáp ứng miễn dịch. Reeves (1965) thiết lập một hệ thống bao gồm 16 lớp bacteriocin dựa trên các loài sản sinh ra chúng. Bradley (1967) phân loại bacteriocin dựa trên trọng lượng phân tử.
Klaenhammer (1993) phân loại bacteriocin thành 4 lớp dựa trên cấu trúc, cơ chế hoạt động, di truyền và đặc điểm hóa sinh (xem phần 1. Cotter và cộng sự (2005) phân thành 2 lớp chính, mỗi lớp lại chia thành các phân lớp phụ (xem phần 1. Bacteriocin lớp I chứa lanthionine hay β-methyllanthionine gọi là lantibiotic. Chúng phải trải qua quá trình chỉnh sửa sau dịch mã để sản sinh ra các peptide có kích thước nhỏ hơn 5 kDa.
Các lantibiotic nhóm A như nisin, epidermin và subtilin là các peptide có hình dạng đinh ốc, thon dài, linh động với hoạt tính tạo lỗ, trong khi các lantibiotic nhóm B, mà ví dụ tiêu biểu là mersacidin, thì nhỏ và đặc với các thành phần đặc trưng nhắm vào màng vi khuẩn. Các lantibiotic nhóm B hoạt động bằng cách can thiệp vào phản ứng enzyme của tế bào, như tổng hợp thành tế bào. Các bacteriocin không chứa lanthionine (non-lanthionine bacteriocin) được xếp vào lớp II. Các peptide này bền nhiệt và không trải qua chỉnh sửa sau dịch mã.
Bacteriocin lớp II chủ yếu hoạt động bằng cách gây ra sự thấm của màng và tiếp theo là rò rỉ các phân tử của vi khuẩn mục tiêu. 5 Lớp phụ IIa là lớp phụ lớn nhất. Chúng hoạt động chống lại Listeria và có một trình tự đầu N bảo tồn kết hợp không đặc trưng lên bề mặt đích. Giống như các lantibiotic nhóm A, bacteriocin lớp phụ IIa tạo các lỗ trong màng nguyên sinh chất.
Các ví dụ tiêu biểu là pediocin và các bacteriocin tương tự pediocin (pediocin-like bacteriocin), sakacin A, và leucocin A. Bacteriocin lớp IIb như lacticin F và lactococcin G tạo các lỗ và có hai protein khác nhau. Trong trường hợp của lacticin 3147, thì một protein đóng vai trò khử cực màng, trong khi protein còn lại thì có vai trò tạo lỗ. Acidocin 1B, được xếp vào nhóm phụ IIc.
Các bacteriocin không tương tự pediocin (non-pediocin like bacteriocin) được xếp vào nhóm phụ IId. Cách phân loại của Klaenhammer (1993) Lớp I – bacteriocin chỉnh sửa sau dịch mã (post-translationally modified bacteriocin) ví dụ lantibiotic Các lantibiotic được chia thành dạng thẳng (nhóm A) và dạng cầu (nhóm B). Lớp II – các bacteriocin nhỏ (<10 kDa), bền nhiệt hoạt động theo cơ chế màng Lớp IIa: các peptide kháng Listeria Lớp IIb: các peptide hai thành phần Lớp IIc: các peptide hoạt hóa thiol (thiol-activated peptide) Lớp III – các bacteriocin lớn (>30 kDa), không bền nhiệt Lớp IV – các bacteriocin phức hợp bao gồm các bán lipid hay bán carbohydrate cơ bản kết hợp với protein. Gần đây, Kemperman và cộng sự (2003) đã đề nghị ghi nhận một lớp mới (lớp V) bao gồm các peptide kháng khuẩn dạng vòng thắt từ đầu đến cuối, tổng hợp ribosom, không chỉnh sửa sau dịch mã (ribosomally synthesized, non-modified head-to-tail ligated cyclic antibacterial peptide) [40].
Cách phân loại của Cotter (2005) 6 Nhóm Đặc tính I – Lantibiotic Ia Nhỏ (19-38 amino acids), thon dài, là các peptide mang điện dương, tạo lỗ Ib Peptide cầu, gây cản trở các enzyme chủ yếu II – Bacteriocin không chứa lanthionine IIa Peptide tương tự pediocin (Pediocin-like peptide) IIb Bacteriocin 2 peptide, yêu cầu cả 2 peptide để thể hiện hoạt tính IIc Peptide vòng, đầu N và đầu C là các liên kết đồng hóa trị IId Peptide không tương tự pediocin (non-pediocin like peptide) đơn [37] 1. Ứng dụng của bacteriocin Các ứng dụng được khảo sát cho đến nay của bacteriocin là trong ba lĩnh vực: thực phẩm, y học và chăm sóc răng miệng. Bacteriocin chủ yếu được ứng dụng trong thực phẩm là nisin.
