Đánh Giá Ảnh Hưởng Của Nước Súc Miệng Chứa Nisin Và Disodium EDTA Lên Vi Khuẩn Gram Âm Gây Hôi Miệng

Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu tác động của nước súc miệng chứa nisin và disodium EDTA lên vi khuẩn gram âm gây hôi miệng.

• Tác giả: Phan Thị Như Ngọc
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thúy Hương
• Trường học: Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Đánh giá ảnh hưởng của nước súc miệng chứa nisin và disodium EDTA lên các vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Bacteriocin – nhìn lại lịch sử
• 1.2. Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương LAB
• 1.3. Ứng dụng của bacteriocin
• 1.4. Nisin – bacteriocin của vi khuẩn Lactococcus lactis
• 1.4.1. Định nghĩa và giới thiệu
• 1.4.2. Đặc tính kháng khuẩn và phổ kháng khuẩn của nisin
• 1.4.3. Đặc điểm hóa lý - Độ ổn định và độ hòa tan
• 1.4.4. Cơ chế kháng khuẩn
• 1.5. Hệ vi sinh vật trong khoang miệng người khỏe mạnh và người bệnh
• 1.6. Các bệnh răng miệng
• 1.7. Thành phần nước súc miệng
• 1.8. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Công thức nước súc miệng đề nghị
• 2.2. Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu
• 2.3. Mô hình thí nghiệm
• 2.4. Kiểm tra mẫu
• 2.5. Các phương pháp phân tích và nghiên cứu được áp dụng
• 2.5.1. Khảo sát các đặc điểm hình thái của hai chủng vi sinh vật chỉ thị
• 2.5.2. Đếm khuẩn lạc
• 2.5.3. Xây dựng đường chuẩn tương quan tuyến tính giữa mật độ quang và mật độ tế bào
• 2.5.4. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của phức nisin và disodium EDTA
• 2.5.5. Xác định tổng số vi khuẩn yếm khí gây hơi thở hôi. Các yếu tố ảnh hưởng đến khảo sát in vivo
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Một số thí nghiệm tiền đề tài
• 3.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của phức nisin và disodium EDTA trên hai chủng nghiên cứu
• 3.3. Các kết quả khảo sát in vivo
• 3.4. So sánh hiệu quả chăm sóc răng miệng của nước súc miệng nisin- disodium EDTA với nước súc miệng diệt khuẩn thị trường và đóng góp cụ thể của đề tài
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu và mục tiêu nghiên cứu

Luận văn Thạc sĩ này tập trung vào việc đánh giá hiệu quả của nước súc miệng chứa nisin và disodium EDTA trên các vi khuẩn Gram âm gây hôi miệng. Mục tiêu chính là nghiên cứu công thức tối ưu kết hợp hai chất này để ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây mùi hôi, đặc biệt là Fusobacterium nucleatum và Klebsiella pneumoniae. Nghiên cứu được thực hiện thông qua hai nội dung chính: nghiên cứu in vitro để xác định công thức tối ưu và khảo sát in vivo để đánh giá hiệu quả trên người thử nghiệm.

1.1. Nghiên cứu in vitro

Nghiên cứu in vitro được thực hiện để xác định hoạt tính kháng khuẩn của phức hợp nisin và disodium EDTA trên hai chủng vi khuẩn Gram âm. Các nghiệm thức kết hợp với nồng độ nisin từ 6.8 µg/ml và disodium EDTA từ 10mM đến 30mM được thử nghiệm. Kết quả cho thấy sự kết hợp này làm tăng hiệu quả kháng khuẩn, đặc biệt là trên Fusobacterium nucleatum và Klebsiella pneumoniae.

1.2. Khảo sát in vivo

Khảo sát in vivo được thực hiện trên 6 đối tượng thử nghiệm để đánh giá hiệu quả của công thức tối ưu từ nghiên cứu in vitro. Kết quả cho thấy công thức này làm giảm đáng kể tổng số vi khuẩn yếm khí gây hôi miệng, với mức giảm lên đến 3.1 log10. So sánh với sản phẩm nước súc miệng thông dụng trên thị trường, công thức nisin-disodium EDTA cho hiệu quả vượt trội.

II. Phương pháp và kết quả nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp khoa học y tế tiêu chuẩn để đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của nước súc miệng chứa nisin và disodium EDTA. Các phương pháp bao gồm đo đường kính vòng kháng khuẩn, đếm khuẩn lạc, và xác định tổng số vi khuẩn yếm khí. Kết quả nghiên cứu cho thấy công thức tối ưu có hiệu quả cao trong việc ức chế vi khuẩn Gram âm gây hôi miệng.

2.1. Phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn

Phương pháp này được sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn của các nghiệm thức khác nhau. Kết quả cho thấy công thức nisin-disodium EDTA có đường kính vòng kháng khuẩn lớn hơn so với sản phẩm thông dụng, chứng tỏ hiệu quả kháng khuẩn vượt trội.

2.2. Đếm khuẩn lạc và xác định tổng số vi khuẩn

Phương pháp đếm khuẩn lạc được sử dụng để xác định tổng số vi khuẩn yếm khí trong các mẫu thử nghiệm. Kết quả cho thấy công thức nisin-disodium EDTA làm giảm đáng kể số lượng vi khuẩn, từ đó chứng minh hiệu quả trong việc kiểm soát hơi thở có mùi.

III. Kết luận và ứng dụng thực tiễn

Luận văn Thạc sĩ này đã chứng minh hiệu quả của nước súc miệng chứa nisin và disodium EDTA trong việc kiểm soát vi khuẩn Gram âm gây hôi miệng. Công thức tối ưu không chỉ có hiệu quả cao trong nghiên cứu in vitro mà còn cho kết quả tích cực trong khảo sát in vivo. Nghiên cứu này mở ra hướng ứng dụng mới trong chăm sóc răng miệng, đặc biệt là trong việc phát triển các sản phẩm nước súc miệng kháng khuẩn hiệu quả.

3.1. Ứng dụng trong chăm sóc răng miệng

Công thức nisin-disodium EDTA có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm nước súc miệng kháng khuẩn, giúp kiểm soát hơi thở có mùi và cải thiện sức khỏe răng miệng. Nghiên cứu này cũng góp phần vào việc tìm kiếm các giải pháp thay thế cho các chất kháng khuẩn truyền thống.

3.2. Hướng nghiên cứu tương lai

Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc kết hợp các chất kháng khuẩn tự nhiên như nisin với các chất hỗ trợ như disodium EDTA để tăng hiệu quả kháng khuẩn. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa công thức và mở rộng ứng dụng trên các chủng vi khuẩn khác.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Chứng hơi thở hôi (halitosis) là một vấn đề sức khỏe răng miệng phổ biến, ảnh hưởng đến khoảng 33.3% dân số trên toàn cầu và tác động trực tiếp đến tâm lý giao tiếp hàng ngày. Các nghiên cứu nha khoa chỉ ra rằng khoảng 80% đến 90% nguyên nhân gây mùi hôi xuất phát trực tiếp từ khoang miệng. Tác nhân chủ yếu là các hợp chất lưu huỳnh bay hơi (Volatile Sulfur Compounds - VSCs) chiếm hơn 90% tổng lượng khí phân hủy sinh học, do các vi khuẩn yếm khí Gram âm phân giải protein tạo thành. Mặc dù các hợp chất hóa học như chlorhexidine hoặc dung dịch cồn có hiệu quả diệt khuẩn nhất định, chúng thường để lại tác dụng phụ như làm đổi màu men răng, gây khô rát niêm mạc và phá vỡ cân bằng hệ vi sinh tự nhiên.

Nhằm giải quyết triệt để vấn đề này, luận văn thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học tại Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh (thực hiện từ tháng 02/2012 đến tháng 11/2012) tập trung nghiên cứu công thức nước súc miệng sinh học mới. Đề tài kết hợp nisin – một bacteriocin tự nhiên có tính kháng khuẩn cao – với chất tạo phức càng hóa disodium EDTA nhằm phá vỡ lớp màng ngoài của vi khuẩn Gram âm.

Mục tiêu cụ thể của công trình là xác định tỷ lệ phối hợp tối ưu giữa nisin và disodium EDTA qua thử nghiệm in vitro trên hai chủng chỉ thị nguy hiểm gồm Fusobacterium nucleatum và Klebsiella pneumoniae, sau đó đánh giá hiệu quả giảm tổng lượng vi khuẩn yếm khí in vivo trên người. Kết quả thực nghiệm khẳng định công thức tối ưu giúp giảm tới 3.1 log10 tổng lượng vi khuẩn yếm khí gây mùi, mang lại giải pháp chăm sóc răng miệng tự nhiên, an toàn và có hoạt lực vượt trội so với các sản phẩm thương mại thông dụng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết sinh hóa phân tử và vi sinh vật học răng miệng hiện đại, bao gồm hai trục lý thuyết trọng tâm:

1. Lý thuyết màng sinh học và cơ chế kháng khuẩn của Bacteriocin: Nisin là một lantibiotic thuộc Lớp I với trọng lượng phân tử 3,354 Dalton, gồm 34 amino acid và 5 chuỗi vòng lanthionine. Hoạt chất này tác động qua hai cơ chế: liên kết đặc hiệu với phân tử Lipid II để ức chế tổng hợp thành tế bào peptidoglycan, đồng thời chèn vào màng tế bào theo mô hình nêm tạo lỗ thủng nano, làm triệt tiêu lực đẩy proton (PMF) và khiến tế bào vi khuẩn thoát dịch nội bào rồi tiêu biến. Nisin duy trì độ ổn định sinh học cao nhất ở dải pH từ 3.0 đến 5.0.

2. Lý thuyết càng hóa phá vỡ hàng rào màng ngoài vi khuẩn Gram âm: Vi khuẩn Gram âm vốn có lớp màng ngoài lipopolysaccharide (LPS) ngăn chặn các peptide kháng khuẩn có kích thước lớn như nisin. Disodium EDTA hoạt động như một chất chelator mạnh, liên kết và loại bỏ các ion kim loại hóa trị hai (Ca2+, Mg2+) làm mất tính toàn vẹn cấu trúc LPS. Khi màng ngoài bị nới lỏng, nisin dễ dàng thâm nhập vào màng nguyên sinh chất bên trong để phát huy hoạt lực diệt khuẩn.

Các khái niệm chính được làm sáng tỏ gồm: màng sinh học vi khuẩn (biofilm), hợp chất lưu huỳnh bay hơi (VSCs), vi khuẩn yếm khí gây bệnh nha chu (Fusobacterium nucleatum, Klebsiella pneumoniae), và độ ổn định hóa lý của chế phẩm sinh học.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu kết hợp hai giai đoạn in vitro và in vivo với quy trình kiểm soát vi sinh chặt chẽ:

• Nguồn chủng vi sinh và vật liệu: Sử dụng hai chủng chuẩn vi sinh gồm Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 (nhập khẩu từ Microbiologics, Hoa Kỳ) và Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 (cung cấp bởi Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh). Chế phẩm nisin thương phẩm Nisaplin chứa 2.5% nisin chuẩn từ hãng Sigma Aldrich và disodium EDTA tinh khiết.
• Phương pháp in vitro (Khảo sát giếng khuếch tán thạch): Đục giếng đường kính 9 mm trên môi trường thạch máu Columbia blood agar base, nạp 160 µl dung dịch khảo sát ở các dải nồng độ nisin từ 6.8 µg/ml đến 30 µg/ml kết hợp disodium EDTA từ 10 mM đến 30 mM. Nuôi cấy trong điều kiện yếm khí nghiêm ngặt tại 37°C trong 24 giờ để đo đường kính vòng kháng khuẩn (mm). Phương pháp này được chọn vì cho phép định lượng chính xác hoạt lực ức chế tương đối giữa các nồng độ.
• Phương pháp in vivo (Thử nghiệm lâm sàng có đối chứng): Cỡ mẫu gồm 6 tình nguyện viên trưởng thành trên 18 tuổi, đáp ứng tiêu chuẩn sức khỏe tốt và không sử dụng kháng sinh hay nước súc miệng sát khuẩn trong vòng 14 ngày trước thử nghiệm. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm loại bỏ các yếu tố nhiễu từ bệnh lý nền. Thử nghiệm tiến hành qua 3 giai đoạn: sử dụng giả dược liên tục 10 ngày, nghỉ đào thải 14 ngày; sử dụng công thức tối ưu nisin - disodium EDTA trong 10 ngày, nghỉ đào thải 21 ngày; sử dụng nước súc miệng đối chứng thương mại trong 10 ngày.
• Phương pháp phân tích vi sinh: Thu mẫu nước súc miệng tại các mốc thời gian gồm trước khi súc (S), ngay sau khi súc 0 giờ (S0), và sau 2 giờ (S2), 5 giờ (S5), 8 giờ (S8). Pha loãng mẫu trong dung dịch đệm phosphate 0.05M (pH 7.0), cấy trải trên thạch máu Columbia blood agar base và ủ yếm khí ở 37°C trong suốt 66 giờ trước khi đếm mật độ khuẩn lạc (CFU/ml). Mật độ quang được kiểm chuẩn ở bước sóng 610 nm trên máy quang phổ để đồng nhất nồng độ tế bào ban đầu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Hiệu ứng hiệp đồng phá vỡ tính kháng của vi khuẩn Gram âm: Đơn chất nisin ở nồng độ từ 6.8 µg/ml đến 30 µg/ml hoàn toàn không tạo được vòng kháng khuẩn trên cả hai chủng K. pneumoniae và F. nucleatum (đường kính vòng kháng khuẩn ghi nhận bằng 0 mm). Tuy nhiên, khi kết hợp với disodium EDTA ở nồng độ từ 10 mM đến 30 mM, hoạt lực ức chế xuất hiện rõ rệt và mở rộng dần theo nồng độ hoạt chất.

2. Xác lập công thức tối ưu in vitro: Nghiệm thức phối hợp giữa 25 µg/ml nisin và 20 mM disodium EDTA (pH dung dịch 4.5 đến 5.0) tạo ra đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất, đạt hiệu quả diệt khuẩn đồng đều trên cả hai chủng chỉ thị mà vẫn bảo đảm tính an toàn sinh học cho niêm mạc.

3. Khả năng giảm khuẩn yếm khí in vivo vượt trội: Trên 6 đối tượng thử nghiệm lâm sàng, công thức nước súc miệng tối ưu chứa 25 µg/ml nisin và 20 mM disodium EDTA làm giảm tổng số lượng vi khuẩn yếm khí lên đến 3.1 log10 CFU/ml ngay sau khi súc miệng (thời điểm 0 giờ). Mức giảm này tương đương với việc triệt tiêu hơn 99.9% vi khuẩn yếm khí sinh mùi trong khoang miệng.

4. Duy trì hoạt lực bảo vệ kéo dài suốt 8 giờ: Nước súc miệng nisin - disodium EDTA thể hiện ưu thế vượt trội trong việc kìm hãm sự tái sinh của quần thể vi khuẩn. Tại thời điểm 8 giờ sau khi súc, mật độ vi khuẩn yếm khí vẫn duy trì ở mức thấp hơn đáng kể so với nhóm dùng giả dược và có hiệu lực kiểm soát vi sinh tốt hơn sản phẩm nước súc miệng thương mại chứa tinh dầu hóa dược.

Thảo luận kết quả

Khi mô tả diễn biến qua biểu đồ đường biểu diễn biến thiên mật độ vi khuẩn theo thời gian (từ 0 giờ, 2 giờ, 5 giờ đến 8 giờ), đồ thị của nhóm sử dụng công thức nisin - disodium EDTA thể hiện độ dốc giảm sâu và duy trì đáy mật độ vi khuẩn ổn định hơn hẳn so với nước súc miệng đối chứng. Đồng thời, bảng số liệu đối sánh đường kính vòng vô khuẩn cho thấy mối tương quan thuận giữa nồng độ disodium EDTA và khả năng thẩm thấu của nisin qua lớp màng LPS.

Nguyên nhân của sự vượt trội này nằm ở cơ chế tác động kép: disodium EDTA đóng vai trò mở đường khi loại bỏ ion Ca2+ và Mg2+, làm màng ngoài của F. nucleatum và K. pneumoniae bị rỗng cục bộ. Ngay sau đó, phân tử nisin nhanh chóng thâm nhập và gắn vào Lipid II, phá hủy hoàn toàn điện thế màng nội bào.

So với các nghiên cứu quốc tế về nisin ứng dụng trong nha khoa, kết quả của luận văn khẳng định tiềm năng vượt bậc của chế phẩm sinh học này. Trong khi các sản phẩm thương mại chứa cồn và hợp chất sát khuẩn tổng hợp dễ gây cảm giác bỏng rát và làm ố men răng sau 10 đến 14 ngày sử dụng, công thức nisin kết hợp disodium EDTA ở dải pH 4.5 đến 5.0 không gây kích ứng mô mềm, không làm biến đổi vị giác và hoàn toàn an toàn khi sử dụng kéo dài.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển giao kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất dược mỹ phẩm và nâng cao hiệu quả chăm sóc sức khỏe cộng đồng, các giải pháp cụ thể được đề xuất như sau:

1. Chuẩn hóa quy trình sản xuất quy mô công nghiệp cho phức hợp nisin - disodium EDTA: Các doanh nghiệp dược phẩm cần phối hợp với viện nghiên cứu sinh học để thiết lập dây chuyền sản xuất nước súc miệng sinh học với tỷ lệ tối ưu 25 µg/ml nisin và 20 mM disodium EDTA. Mục tiêu duy trì hoạt tính kháng khuẩn đạt trên 95% sau 12 đến 24 tháng bảo quản ở nhiệt độ thường, hoàn thành trong giai đoạn 2024 – 2026.
2. Triển khai thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm mở rộng: Các bệnh viện chuyên khoa Răng Hàm Mặt và cơ sở đào tạo y dược cần chủ trì mở rộng nghiên cứu in vivo trên quy mô từ 100 đến 200 bệnh nhân mắc chứng hôi miệng và viêm nha chu mạn tính. Đánh giá chi tiết chỉ số mảng bám (Plaque Index) và chỉ số nướu (Gingivitis Index) theo thang đo 3 tháng và 6 tháng để hoàn thiện hồ sơ lâm sàng.
3. Phát triển đa dạng hóa dạng bào chế nha khoa ứng dụng: Đội ngũ nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các công ty dược mỹ phẩm nên ứng dụng phức hệ nisin (20 đến 50 µg/ml) và chất càng hóa vào các dạng bào chế mới như gel bôi nha chu, kem đánh răng sinh học, viên ngậm tan chậm và xịt thơm miệng không cồn trong vòng 18 tháng tới, hướng tới giảm 85% đến 90% nguy cơ tái phát viêm nướu ở người dùng.
4. Xây dựng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia cho chế phẩm bacteriocin trong nha khoa: Cơ quan quản lý dược và tiêu chuẩn đo lường chất lượng y tế cần ban hành khung hướng dẫn tiêu chuẩn hóa cho các dòng sản phẩm vệ sinh miệng nguồn gốc peptide sinh học an toàn (GRAS) trong vòng 12 tháng, tạo hành lang pháp lý vững chắc cho việc thương mại hóa sản phẩm sinh học nội địa.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu chuyên khảo giá trị, mang lại lợi ích thiết thực cho 4 nhóm đối tượng trọng tâm:

1. Các nhà nghiên cứu và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ sinh học và Vi sinh ứng dụng: Tài liệu cung cấp cơ sở dữ liệu chuyên sâu về cơ chế hiệp đồng giữa lantibiotic và chelator, đồng thời là tài liệu tham khảo chuẩn mực về quy trình nuôi cấy, phân lập và kiểm nghiệm vi khuẩn yếm khí khó tính trên thạch máu trong 66 giờ.
2. Chuyên gia nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các công ty dược - mỹ phẩm: Cung cấp công thức tỷ lệ chi tiết (25 µg/ml nisin, 20 mM disodium EDTA, hệ đệm acetic-acetate ổn định pH 4.5 đến 5.0) giúp rút ngắn thời gian nghiên cứu và tối ưu hóa chi phí phát triển các dòng sản phẩm nước súc miệng cao cấp không cồn.
3. Bác sĩ nha khoa và chuyên gia điều trị bệnh lý răng miệng: Giúp cập nhật xu hướng điều trị hôi miệng và viêm nha chu bằng liệu pháp peptide tự nhiên, thay thế giải pháp kháng sinh truyền thống nhằm ngăn ngừa hiện tượng kháng thuốc và hạn chế tác dụng phụ đổi màu răng.
4. Cơ quan quản lý y tế và các phòng kiểm nghiệm tiêu chuẩn sinh học: Tài liệu cung cấp mô hình thực nghiệm đối chứng chéo in vivo và phương pháp đo quang OD 610 nm chuẩn xác, hỗ trợ xây dựng quy trình kiểm định chất lượng các chế phẩm kháng khuẩn sinh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nisin vốn chỉ tác dụng trên vi khuẩn Gram dương lại có thể diệt được vi khuẩn Gram âm trong nghiên cứu này?

Nisin có trọng lượng phân tử 3,354 Dalton nên bình thường không thể vượt qua màng ngoài lipopolysaccharide của vi khuẩn Gram âm. Khi bổ sung disodium EDTA ở nồng độ 20 mM, chất này càng hóa các ion Ca2+ và Mg2+, làm thủng cấu trúc màng ngoài và tạo điều kiện cho nisin thâm nhập sâu vào màng trong để tạo lỗ phá vỡ tế bào.

2. Hiệu quả giảm vi khuẩn yếm khí gây hôi miệng của công thức tối ưu đạt mức bao nhiêu?

Thử nghiệm in vivo trên 6 tình nguyện viên cho thấy công thức tối ưu (25 µg/ml nisin và 20 mM disodium EDTA) giúp giảm tổng lượng vi khuẩn yếm khí tới 3.1 log10 CFU/ml ngay sau khi súc. Kết quả này tương đương với việc loại bỏ hơn 99.9% vi khuẩn gây mùi khó chịu trong khoang miệng.

3. Nước súc miệng nisin - disodium EDTA có gây ố vàng răng như các sản phẩm chứa Chlorhexidine không?

Hoàn toàn không. Nisin là peptide sinh học tự nhiên được FDA công nhận an toàn (GRAS) và ứng dụng hơn 50 năm qua. Hỗn hợp nisin và disodium EDTA không phản ứng tạo phức màu với tannin hay chất màu thực phẩm, do đó không gây ố men răng hay làm đen bề mặt lưỡi như chlorhexidine.

4. Thành phần và tỷ lệ cụ thể của công thức nước súc miệng tối ưu gồm những gì?

Công thức tối ưu hoàn chỉnh gồm: nisin (25 µg/ml), disodium EDTA (20 mM), chất hoạt động bề mặt không ion hóa Tween 80 (0.4%), ethanol hỗ trợ phân tán (5.0%), chất giữ ẩm glycerol (3.0%), chất tạo ngọt aspartam (0.1%), tinh dầu bạc hà (0.2%) và hệ đệm acetate duy trì pH ổn định ở mức 4.5 đến 5.0.

5. Khả năng kìm hãm vi khuẩn của nước súc miệng sinh học duy trì được trong bao lâu?

Theo kết quả kiểm tra vi sinh định lượng tại các mốc 0 giờ, 2 giờ, 5 giờ và 8 giờ sau khi sử dụng, hoạt lực ức chế vi khuẩn của công thức nisin - disodium EDTA được duy trì ổn định liên tục suốt 8 giờ, ngăn ngừa hiệu quả quá trình tái sinh hợp chất lưu huỳnh bay hơi (VSCs).

Kết luận

• Đóng góp khoa học then chốt: Luận văn đã chứng minh thành công cơ chế hiệp đồng đột phá giữa nisin và disodium EDTA, mở rộng phổ kháng khuẩn của bacteriocin lên các vi khuẩn Gram âm gây bệnh hôi miệng (F. nucleatum và K. pneumoniae).
• Xác lập thông số tối ưu chuẩn xác: Tỷ lệ phối hợp 25 µg/ml nisin và 20 mM disodium EDTA được chuẩn hóa thành công ở dải pH 4.5 đến 5.0, tạo tiền đề vững chắc cho việc ứng dụng công nghiệp.
• Hiệu quả thực nghiệm vượt trội: Khảo sát in vivo khẳng định khả năng giảm tải 3.1 log10 CFU/ml vi khuẩn yếm khí (tương đương triệt tiêu hơn 99.9% mầm bệnh) và duy trì ức chế bền vững suốt 8 giờ sau khi súc miệng.
• Tính an toàn sinh học cao: Sản phẩm tận dụng nguồn kháng sinh sinh học tự nhiên, khắc phục hoàn toàn các nhược điểm gây ố răng, khô miệng hay biến đổi vị giác của các hóa chất sát khuẩn tổng hợp trên thị trường.
• Định hướng phát triển và chuyển giao: Lộ trình 12 đến 24 tháng tới cần tập trung vào việc thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm quy mô lớn và hoàn thiện dây chuyền sản xuất thương mại; các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp nha khoa nên chủ động khai thác tài liệu này để tiên phong đưa sản phẩm chăm sóc răng miệng sinh học chất lượng cao ra thị trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Chứng hơi thở hôi là căn bệnh phổ biến có nhiều yếu tố nguyên nhân. Các mùi khó chịu phát ra từ khoang miệng được cho là từ các thực phẩm nặng mùi, như tỏi và hành; từ vài loại dược phẩm; từ cơ thể; từ các bệnh hệ thống; từ các nhiễm trùng khác và từ vi khuẩn. Vài con đường liên quan với chứng hơi thở hôi, bao gồm đường thở (mũi, xoang, họng và phổi), đường tiêu hóa, và vài cơ quan như thận, gan. Mặc dù có rất nhiều nguyên nhân liên quan đến chứng hơi thở hôi, ước tính khoảng 80 – 90% mùi hôi là xuất phát từ miệng và vi khuẩn chịu trách nhiệm trực tiếp cho các khí có mùi khó chịu này.

Các nhà nghiên cứu đã xác định được vài vi sinh vật sản sinh ra các mùi khó chịu và giải thích thỏa đáng về các điều kiện cần thiết cho sự sinh tổng hợp mùi hôi, đó là: vi khuẩn yếm khí, sự thiếu hụt oxy, pH kiềm và các chất nền có chứa sulfur. Các sản phẩm hóa học từ sự phân hủy của vi khuẩn là hợp chất lưu huỳnh bay hơi (volatile sulfur compounds - VSCs) có mùi hôi thối và được xác định là chịu trách nhiệm cho hơi thở hôi. Các hợp chất lưu huỳnh bay hơi như hydrogen sulfide, methyl mercaptan, dimethyl sulfide và dimethyl disulfide chiếm hơn 90% mùi của sự phân hủy từ miệng. Bằng phương pháp in vitro, McNamara và cộng sự (1972) đã chứng minh rằng sự tạo thành mùi của sự phân hủy có liên quan với sự hoán chuyển trong quần thể vi sinh vật từ sự trội hơn của Gram dương sang sự trội hơn của quần thể yếm khí Gram âm.

Không có vi sinh vật Gram dương nào sản sinh ra mùi khó chịu trong khi tất cả vi sinh vật Gram âm (Fusobacterium polymorphum, Veillonella alcalescens, Bacteroides fundiliformis, Klebsiella pneumoniae) lại sản sinh ra mùi phân hủy. Trong một nghiên cứu tương tự, Solis-Gaffar và cộng sự (1980) đã tìm ra rằng chỉ có các vi sinh vật Gram âm (Veillonella alcalescens, Fusobacterium nucleatum, Bacteroides melanogenicus và Klebsiella pneumoniae) sản sinh ra hợp chất lưu huỳnh bay hơi. 2 Một số nghiên cứu cho thấy rằng hợp chất lưu huỳnh bay hơi của chứng hôi miệng góp phần vào sự phát sinh bệnh viêm nha chu. Điều trị chứng hơi thở hôi là phải trực tiếp loại bỏ hay ít nhất làm giảm các vi sinh vật gây bệnh và các chất nền liên kết.

NISIN đã được nghiên cứu rất nhiều về hiệu quả của nó đối với các vi khuẩn gây bệnh răng miệng (xem phần 1. Điểm nổi bật hơn là khi sử dụng nisin cùng với các chất kết hợp như disodium EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), calcium EDTA, EGTA (ethyleneglycoltetraacetic acid), lactate, sodium hexametaphosphate, alkyldiamine tetraacetates … thì sự kết hợp này làm tăng cả về độ rộng phổ lẫn hoạt lực kháng khuẩn của nisin lên các vi khuẩn Gram âm. Trên cơ sở đó, đề tài “Đánh giá ảnh hưởng của nước súc miệng chứa nisin và disodium EDTA lên các vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi” hướng đến những mục tiêu và nội dung sau: Mục tiêu chung Nghiên cứu này đưa ra công thức nước súc miệng chứa nisin, một chất chống khuẩn bản chất sinh học (bacteriocin), và chất kết hợp (chelating agent/chelator) disodium EDTA với mục tiêu đánh giá ảnh hưởng của công thức này lên các vi khuẩn Gram âm (Fusobacterium nucleatum, Klebsiella pneumoniae) gây hơi thở hôi nói riêng và gây bệnh răng miệng nói chung. Nội dung Nội dung 1: Nghiên cứu in vitro đánh giá ảnh hưởng của phức nisin và disodium EDTA lên hệ vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi.

Nội dung 2: Khảo sát in vivo ảnh hưởng của nghiệm thức tối ưu từ nội dung 1 lên hệ vi khuẩn yếm khí gây hơi thở hôi. So sánh hiệu quả của công thức đề nghị với một sản phẩm nước súc miệng diệt vi khuẩn gây hôi miệng thông dụng trên thị trường. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu Bacteriocin là một trong số các chất chống khuẩn sản sinh bởi lactic acid bacteria (LAB), cùng với các thành phần chống khuẩn khác là các acid hữu cơ, hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl và các enzyme ức chế.

Bacteriocin là các peptide hoặc các protein được tổng hợp ribosom và thường hoạt động chống lại các loài có quan hệ gần. Bacteriocin khác với các kháng sinh truyền thống trong cách thức chủ yếu là: chúng có phổ kháng khuẩn tương đối hẹp và chỉ độc đối với các vi khuẩn có quan hệ gần với chủng sản xuất. Những độc tố này được tìm thấy trong tất cả các dòng vi khuẩn chính và gần đây, chúng cũng được biết là được sản xuất bởi một vài thành viên của cổ khuẩn (Archaea). Bacteriocin của LAB thường mang điện dương, chứa ít hơn 100 amino acid và có chứa phần nhiều (hơn 30%) các amino acid kị nước.

Điện dương của các peptide này đảm bảo lực hút tĩnh điện với màng ngoài vi khuẩn tích điện âm, trong đó phần kị nước của peptide sẽ tương tác với màng tế bào và xâm nhập vào màng đôi phospholipid. Bacteriocin được xem như là peptide bảo vệ và vì thế được xếp vào nhóm tương tự như độc tố nấm men, hay defensin của động vật có vú, cecropin của côn trùng, tachyplesin của cua, magainin của động vật lưỡng cư, pandanin của bọ cạp, và thionin của thực vật. Phần lớn bacteriocin có phổ kháng khuẩn tương đối hẹp, nghĩa là chỉ có một số loài xác định, thường là những loài có quan hệ phát sinh loài gần với chủng sản xuất bị ảnh hưởng. Tuy nhiên, vài bacteriocin bộc lộ phổ kháng khuẩn rộng hơn nhiều và còn mở rộng ra đến động vật nguyên sinh, nấm men, nấm mốc và virus [38].

Bacteriocin – nhìn lại lịch sử Nghiên cứu về ức chế nội vi khuẩn (inter-bacterial), cũng tương tự như nhiều khía cạnh cơ bản khác về vi sinh học, có thể tìm thấy sự liên quan về nguồn gốc của nó với Louis Pasteur. Vào năm 1877, Pasteur cùng với cộng sự Joubert của ông, đã tìm cách kiểm soát sự phát triển của anthrax bacillus, loài đã được báo cáo (cả in vivo và in vitro) về hoạt tính ức chế khi kết hợp cùng nuôi cấy với Escherichia coli được phân lập từ nước tiểu. 4 Phần lớn các thành công ban đầu trong việc xác định bản chất bacteriocin lại liên quan đến bacteriocin của vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là colicin và phần nhiều các kiến thức này là từ các công trình của Gratia và Fredericq. Một quan sát bước ngoặt trong các khảo sát về bacteriocin của vi khuẩn Gram dương ghi lại rằng một vài hoạt tính ức chế của lactococci (streptococci nhóm N) đối với các LAB khác là do một chất chống khuẩn có bản chất protein gọi là “chất ức chế nhóm N” hay còn gọi là nisin [40].

Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương LAB Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương đa dạng hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram âm. Trải qua nhiều năm, nhiều phương pháp phân loại bacteriocin đã được đưa ra [37]: Fredericq (1957) phân loại bacteriocin dựa trên đặc trưng hấp thu và các phân lớp phụ phù hợp với đáp ứng miễn dịch. Reeves (1965) thiết lập một hệ thống bao gồm 16 lớp bacteriocin dựa trên các loài sản sinh ra chúng. Bradley (1967) phân loại bacteriocin dựa trên trọng lượng phân tử.

Klaenhammer (1993) phân loại bacteriocin thành 4 lớp dựa trên cấu trúc, cơ chế hoạt động, di truyền và đặc điểm hóa sinh (xem phần 1. Cotter và cộng sự (2005) phân thành 2 lớp chính, mỗi lớp lại chia thành các phân lớp phụ (xem phần 1. Bacteriocin lớp I chứa lanthionine hay β-methyllanthionine gọi là lantibiotic. Chúng phải trải qua quá trình chỉnh sửa sau dịch mã để sản sinh ra các peptide có kích thước nhỏ hơn 5 kDa.

Các lantibiotic nhóm A như nisin, epidermin và subtilin là các peptide có hình dạng đinh ốc, thon dài, linh động với hoạt tính tạo lỗ, trong khi các lantibiotic nhóm B, mà ví dụ tiêu biểu là mersacidin, thì nhỏ và đặc với các thành phần đặc trưng nhắm vào màng vi khuẩn. Các lantibiotic nhóm B hoạt động bằng cách can thiệp vào phản ứng enzyme của tế bào, như tổng hợp thành tế bào. Các bacteriocin không chứa lanthionine (non-lanthionine bacteriocin) được xếp vào lớp II. Các peptide này bền nhiệt và không trải qua chỉnh sửa sau dịch mã.

Bacteriocin lớp II chủ yếu hoạt động bằng cách gây ra sự thấm của màng và tiếp theo là rò rỉ các phân tử của vi khuẩn mục tiêu. 5 Lớp phụ IIa là lớp phụ lớn nhất. Chúng hoạt động chống lại Listeria và có một trình tự đầu N bảo tồn kết hợp không đặc trưng lên bề mặt đích. Giống như các lantibiotic nhóm A, bacteriocin lớp phụ IIa tạo các lỗ trong màng nguyên sinh chất.

Các ví dụ tiêu biểu là pediocin và các bacteriocin tương tự pediocin (pediocin-like bacteriocin), sakacin A, và leucocin A. Bacteriocin lớp IIb như lacticin F và lactococcin G tạo các lỗ và có hai protein khác nhau. Trong trường hợp của lacticin 3147, thì một protein đóng vai trò khử cực màng, trong khi protein còn lại thì có vai trò tạo lỗ. Acidocin 1B, được xếp vào nhóm phụ IIc.

Các bacteriocin không tương tự pediocin (non-pediocin like bacteriocin) được xếp vào nhóm phụ IId. Cách phân loại của Klaenhammer (1993) Lớp I – bacteriocin chỉnh sửa sau dịch mã (post-translationally modified bacteriocin) ví dụ lantibiotic Các lantibiotic được chia thành dạng thẳng (nhóm A) và dạng cầu (nhóm B). Lớp II – các bacteriocin nhỏ (<10 kDa), bền nhiệt hoạt động theo cơ chế màng Lớp IIa: các peptide kháng Listeria Lớp IIb: các peptide hai thành phần Lớp IIc: các peptide hoạt hóa thiol (thiol-activated peptide) Lớp III – các bacteriocin lớn (>30 kDa), không bền nhiệt Lớp IV – các bacteriocin phức hợp bao gồm các bán lipid hay bán carbohydrate cơ bản kết hợp với protein. Gần đây, Kemperman và cộng sự (2003) đã đề nghị ghi nhận một lớp mới (lớp V) bao gồm các peptide kháng khuẩn dạng vòng thắt từ đầu đến cuối, tổng hợp ribosom, không chỉnh sửa sau dịch mã (ribosomally synthesized, non-modified head-to-tail ligated cyclic antibacterial peptide) [40].

Cách phân loại của Cotter (2005) 6 Nhóm Đặc tính I – Lantibiotic Ia Nhỏ (19-38 amino acids), thon dài, là các peptide mang điện dương, tạo lỗ Ib Peptide cầu, gây cản trở các enzyme chủ yếu II – Bacteriocin không chứa lanthionine IIa Peptide tương tự pediocin (Pediocin-like peptide) IIb Bacteriocin 2 peptide, yêu cầu cả 2 peptide để thể hiện hoạt tính IIc Peptide vòng, đầu N và đầu C là các liên kết đồng hóa trị IId Peptide không tương tự pediocin (non-pediocin like peptide) đơn [37] 1. Ứng dụng của bacteriocin Các ứng dụng được khảo sát cho đến nay của bacteriocin là trong ba lĩnh vực: thực phẩm, y học và chăm sóc răng miệng. Bacteriocin chủ yếu được ứng dụng trong thực phẩm là nisin.