Xác định đồng thời Caffeine, Theobromine, Theophylline trong chè miền Bắc

Nghiên cứu hàm lượng caffeine, theobromine, theophylline trong các loại chè miền Bắc. Luận văn cung cấp phương pháp và kết quả phân tích chi tiết.

• Tác giả: Đoàn Thị Bích Ngọc
• Người hướng dẫn: Nguyễn Văn Ri
• Trường học: Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Xác Định Đồng Thời Thành Phần Caffeine, Theobromine Và Theophylline Trong Một Số Loại Chè Phân Bố Ở Miền Bắc Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Caffeine Theobromine và Theophylline

Caffeine, Theobromine và Theophylline là ba alkaloid quan trọng thuộc nhóm methylxanthine, được tìm thấy phổ biến trong các sản phẩm tự nhiên như chè, cacao và cà phê. Luận văn này tập trung vào phân tích đồng thời các thành phần này trong các loại chè phân bố ở miền Bắc Việt Nam. Những alkaloid này có tác dụng sinh học đa dạng, từ kích thích hệ thần kinh trung ương đến tác dụng lợi tiểu. Nghiên cứu về định lượng chính xác các chất này là cần thiết để đánh giá chất lượng sản phẩm chè và hiểu rõ hơn về đặc tính dinh dưỡng của chúng. Việc xác định đồng thời ba thành phần này bằng các phương pháp hiện đại giúp cải thiện độ chính xác và hiệu quả của quá trình phân tích.

1.1. Định nghĩa và cấu trúc hóa học

Caffeine là alkaloid tự nhiên với công thức phân tử C₈H₁₀N₄O₂, được biết đến rộng rãi với tác dụng kích thích. Theobromine và Theophylline có cấu trúc hóa học tương tự, thuộc lớp methylxanthine. Chúng là những hợp chất xanthine được metylas hóa, có khả năng hòa tan trong nước và các dung môi hữu cơ. Cấu trúc vòng imidazol và pyrimidine của chúng cho phép chúng có các tính chất sinh học độc đáo. Sự hiểu biết về cấu trúc này rất quan trọng trong việc lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp.

1.2. Nguồn gốc tự nhiên trong chè

Chè (Camellia sinensis) là một trong những nguồn phong phú của caffeine, theobromine và theophylline. Ngoài chè, các alkaloid này cũng được tìm thấy trong cacao, cà phê và một số loại thực vật khác. Miền Bắc Việt Nam có điều kiện khí hậu và đất đai lý tưởng để trồng chè, tạo ra những sản phẩm chè có thành phần alkaloid đa dạng. Hàm lượng của ba alkaloid này thay đổi tùy theo loại chè, độ tuổi lá và điều kiện môi trường. Việc phân tích các mẫu chè từ các vùng khác nhau giúp xác định sự biến thiên này.

II. Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp chính được sử dụng trong luận văn để xác định đồng thời caffeine, theobromine và theophylline. Phương pháp này cung cấp độ nhạy cao, độ chính xác tốt và khả năng tách biệt hiệu quả các alkaloid từ mẫu chè. Kỹ thuật sắc ký hấp phụ pha ngược (RP-HPLC) được áp dụng với detector UV-Vis để phát hiện các chất có sắc tính. Quá trình tối ưu hóa điều kiện chạy bao gồm lựa chọn pha động, pH, tốc độ dòng chảy và nhiệt độ cột để đạt được độ phân giải tối ưu. Phương pháp này cho phép phân tích nhanh chóng và đáng tin cậy hàng loạt mẫu.

2.1. Nguyên tắc hoạt động của HPLC

HPLC hoạt động dựa trên nguyên tắc tách các chất dựa trên sự khác biệt trong khả năng hấp phụ lên pha tĩnh (cột chromatography). Pha động được bơm qua cột với áp suất cao, giúp tách biệt các thành phần của mẫu. Mỗi chất sẽ có thời gian lưu (retention time) khác nhau, cho phép xác định và định lượng chúng. Detector UV-Vis đo cường độ ánh sáng hấp thụ để tạo ra sắc đồ (chromatogram) với các đỉnh tương ứng với mỗi alkaloid. Phương pháp này đặc biệt hiệu quả cho phân tích đồng thời các methylxanthine.

2.2. Tối ưu hóa điều kiện phân tích

Việc tối ưu hóa điều kiện HPLC là bước quan trọng để đạt được độ tách biệt tốt nhất giữa caffeine, theobromine và theophylline. Các thông số được khảo sát bao gồm loại pha động (methanol, acetonitrile hoặc hỗn hợp), pH pha động, tốc độ dòng chảy, và nhiệt độ cột. Việc chọn bước sóng phát hiện thích hợp (thường trong khoảng 270-280 nm) đảm bảo độ nhạy cao cho cả ba alkaloid. Kết quả tối ưu cho phép phân tích nhanh trong vòng 15-20 phút với độ chính xác cao.

III. Đánh giá chất lượng phương pháp phân tích

Để đảm bảo độ tin cậy của phương pháp xác định đồng thời, luận văn thực hiện đánh giá toàn diện bao gồm xác định tuyến tính, độ phát hiện, độ định lượng và độ chính xác của phương pháp. Khoảng tuyến tính được thiết lập để xác định dãy nồng độ mà phương pháp có thể áp dụng với độ chính xác cao. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được tính toán từ đường chuẩn, cho phép xác định ngưỡng tối thiểu của các alkaloid. Độ lặp lại của phương pháp được kiểm tra qua nhiều lần đo lặp, đảm bảo tính ổn định của kết quả. Độ thu hồi được đánh giá bằng cách thêm chuẩn vào mẫu, xác nhận hiệu suất trích ly alkaloid từ mẫu chè.

3.1. Xác định tuyến tính và đường chuẩn

Đường chuẩn được xây dựng bằng cách đo diện tích pic của các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau của caffeine, theobromine và theophylline. Mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic phải đạt hệ số tương quan R² ≥ 0,99, đảm bảo tính chính xác cao trong định lượng. Phương trình hồi quy tuyến tính từ đường chuẩn được sử dụng để tính toán nồng độ alkaloid trong mẫu chè thực tế. Khoảng nồng độ khảo sát thường từ 0,05-200 μg/mL, đủ để bao phủ nồng độ trong mẫu chè.

3.2. Độ chính xác và độ lặp lại

Độ lặp lại được đánh giá bằng cách phân tích cùng một mẫu nhiều lần (thường 5-10 lần) và tính độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Theo tiêu chuẩn AOAC, RSD phải dưới 5% cho các phép đo có nồng độ cao. Độ thu hồi được xác định bằng cách thêm một lượng chuẩn đã biết vào mẫu, tiến hành phân tích và tính phần trăm tìm được so với lượng thêm vào. Độ thu hồi chấp nhận thường trong khoảng 90-110%, chứng minh hiệu suất trích ly tốt của phương pháp. Các tiêu chí này đảm bảo phương pháp đáng tin cậy cho ứng dụng thực tế.

IV. Kết quả phân tích các mẫu chè miền Bắc Việt Nam

Luận văn phân tích caffeine, theobromine và theophylline trong các mẫu lá chè và búp chè từ các tỉnh khác nhau ở miền Bắc Việt Nam như Hà Giang, Cao Bằng, Thái Nguyên và các khu vực khác. Kết quả cho thấy hàm lượng caffeine thường cao nhất, dao động từ 2-4% khối lượng khô, trong khi theobromine và theophylline có nồng độ thấp hơn đáng kể. Búp chè (lá non) có nồng độ alkaloid cao hơn lá chè trưởng thành, phản ánh hoạt động sinh hóa mạnh mẽ trong giai đoạn phát triển sớm. Sự khác biệt giữa các vùng sản xuất có thể liên quan đến điều kiện khí hậu, độ cao địa lý và loại đất. Những phát hiện này cung cấp thông tin quan trọng về chất lượng chè Việt Nam và có ứng dụng trong đánh giá và tiêu chuẩn hóa sản phẩm.

4.1. Phân tích mẫu lá chè trưởng thành

Các mẫu lá chè trưởng thành từ các vùng khác nhau được phân tích cho thấy nồng độ caffeine trung bình khoảng 2,5-3,5% khối lượng khô. Theobromine xuất hiện với nồng độ từ 0,1-0,3%, thấp hơn caffeine từ 10-20 lần. Theophylline có hàm lượng tương đối thấp, thường dưới 0,1% khối lượng khô. Sự biến thiên giữa các mẫu từ các tỉnh khác nhau phản ánh đặc tính sinh địa và điều kiện canh tác cụ thể. Các chè từ vùng cao có xu hướng hàm lượng caffeine cao hơn so với các vùng thấp hơn.

4.2. So sánh giữa búp chè và lá chè

Búp chè (lá non được thu hoạch từ sớm) thường có nồng độ alkaloid cao hơn 30-50% so với lá chè trưởng thành. Điều này do trong giai đoạn phát triển sớm, quá trình tổng hợp alkaloid xảy ra mạnh mẽ để bảo vệ cây trẻ. Tỷ lệ caffeine/theobromine trong búp chè cũng cao hơn, cho thấy hóa sinh khác biệt tùy theo độ tuổi lá. Kết quả này có ý nghĩa kinh tế quan trọng, vì búp chè được xem là sản phẩm chè chất lượng cao với giá trị dinh dưỡng và sinh học tốt hơn lá chè thông thường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan Chè (Camellia sinensis (L.) K untze) Tên Khoa học: Camellia sinensis (L. Tên tiếng Việt: Chè, Trà. Nguồn gốc và phân loại các loài Chè Nguồn gốc Theo truyền thuyết, cây chè lần đầu tiên được phát hiện bởi người Trung Quốc.

Ngày nay, cây chè được trồng ở nhiều nơi trên thế giới trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Đến nay có 56 nước trồng chè, sản xuất và chế biến chè ở các quy mô khác nhau, phân bố ở khắp 5 châu. Các vùng trồng chè ở Việt Nam Cây chè được trồng nhiều ở Việt Nam, nó được phân bố rộng rãi ở các vùng như: - Tây Bắc: Sơn La, Lai Châu, Điện Biên, Yên Bái. - Đông Bắc: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc Giang, Cao Bằng.

- Trung du và miền núi phía Bắc: Thái Nguyên, Phú Thọ, Hòa Bình, Hà Nội, Vĩnh Phúc. - Phía bắc miền Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Tây Nguyên, Lâm Đồng, Gia Lai, Kon Tum. Phân loại Dựa theo đặc điểm thực vật học, đặc điểm sinh hoá, nguồn gốc phát sinh cây chè, chè được chia làm 4 loại: a. Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var.

Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var. Chè Shan (Camellia sinensis var. Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var. Assamica) Cả 4 loại trà trên đều có trồng ở Việt Nam nhưng phổ biến nhất là 2 loại trà: trà Camellia sinesis var.

Macrophy và trà Camellia sinesis var. - Camellia sinensis var. Macrophylla được trồng nhiều nhất ở các tỉnh trung du 3 với các tên gọi của địa phương (theo màu sắc lá) như: Trung du lá xanh, Trung du lá vàng, v. - Camellisa sinensis var.

Shan được trồng ở miền núi các tỉnh miền bắc và ở phía nam Tây Nguyên (Lâm Đồng). Ở mỗi địa phương có các giống khác nhau như: Shan Mộc Châu, Shan Tham Vè, Shan Trấn Ninh. Thành phần hoá học của chè Thành phần hóa học của chè biến đổi rất phức tạp, nó phụ thuộc vào giống, điều kiện đất đai, địa hình, kĩ thuật canh tác. Để khảo sát đặc tính lý, hóa của chè, ta sẽ tìm hiểu thành phần các chất có trong lá chè, từ đó tìm hiểu vai trò và ý nghĩa của nó.

Hiện nay thành phần lá trà được mô tả khá đầy đủ thành phần lá trà được mô tả trong bảng 1.1: Thành phần hóa học của chè Thành phần Hàm lượng (%) Nước 75-80 Flavanol: (-) Epigallocatechin gallate (EGCG) 8-12 (-) Epicatechin gallate (ECG) 3-6 (-) Epigallo catechin (EGC) 3-6 (-) Epicatechin (EC) 1-3 (+) Catechin (C) 1-2 (+) Gallcatechin (GC) 3-4 Caffeine 3-4 Theobromine 0,33 Theophylline 0,33 Acid hữu cơ (citric, malic, oxalic,…) 0,5-0,6 Đường (glucose, fructose, saccharose, raffinose, stachyose) 4-5 Xơ (cellulose, hemicellulose, lignin) 4-7 Protein và acid amin 14-17 Lipid 3-5 Khoáng 5-6 Chất màu (carotenoid, chlorophyl) 0,5-0,6 Enzyme 4 1. Nước Nước là thành phần chủ yếu trong búp chè. Trong búp chè (1 tôm + 3 lá) hàm lượng nước thường có từ 75-82%. Hàm lượng nước trong búp chè thay đổi tùy theo giống, tuổi cây, đất đai, kỹ thuật canh tác, thời gian hái và tiêu chuẩn hái… 1.

Polyphenol Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong lá chè. Các hợp chất polyphenol của lá chè rất khác với các hợp chất polyphenol được tìm thấy trong các loại cây khác. Các cấu tử chính chiếm đa số là các catechin (C, EC, EGCG, EGC, ECG…). Ngoài ra, trong thành phần polyphenol của chè còn có một số chất khác tỉ lệ thấp như các flavonol (quercetin, kaempferol, rutin.) các dẫn xuất glucoside như myricetin - 3 - glucoside, kaempferol-3 rhamnodiglucoside., các leucoanthocyanin, các hợp chất polyflavonoit như theaflavin (theaflavin-3- gallate, theaflavin-3'-gallate, theaflavin-3,3'-digallate.), thearubigin (procyanidine, procyanidine gallate.

Các dạng hợp chất như theaflavin, thearubigin chiếm tỉ lệ rất thấp trong búp chè và lá chè non nhưng tăng dần tỉ lệ trong các lá chè già hơn [7]. Alkaloid Alkaloid là nhóm hợp chất vòng hữu cơ có chứa nitrogen trong phân tử. Phần lớn các alkaloid là những chất không màu, có vị đắng và ít hòa tan trong nước. Trong lá chè, người ta tìm thấy các alkaloid chủ yếu là caffeine, theobromine và theophylline.

Trong đó, caffeine chiếm khoảng 2 – 5% lượng chất khô; theobromine và theophylline với hàm lượng nhỏ hơn rất nhiều so với hàm lượng của caffeine, chiếm khoảng 0,33% khối lượng chất khô. Tuy vậy, vai trò của theobromine và theophylline trong dược tính của cây chè quan trọng hơn so với caffeine [7]. Nhóm ankaloid này cũng góp phần tạo nên hương vị đắng của chè. Mức độ của các hợp chất phụ thuộc vào giống, độ tuổi và khí hậu của chè được sử dụng.

Protein và axit amin Protein trong búp chè phân bố không đều, chiếm khoảng 15% tổng lượng chất khô của lá chè tươi. Các axit amin cơ bản trong lá chè bao gồm: aspartic, arginin, 5 alutamic, serin, glutamin, tyrosin, valin, phenylalanin, leucin, isoleucin và theanin … Trong đó theanin chiếm hàm lượng cao nhất, khoảng 50 - 60% tổng hàm lượng axit amin tự do. Theanin là axit amin đặc trưng của cây chè, theanin chỉ có thể được tìm thấy ở các cây họ chè và một số ít các loài nấm [1] 1. Hoạt tính của nhóm ankaloid.

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ hấp dẫn nhất và có nhiều nghiên cứu rất quan tâm đến chúng. Các chất caffeine, theophylline và theobromine trong nhóm ankaloid đều là những chất thông dụng và được con người sử dụng hàng ngày. Các alkaloid đó có các hoạt tính dược lý như tác nhân trị liệu sinh học. Mặc dù cấu trúc hóa học của chúng: caffeine (1,3,7-trimethylxantine), theophylline (1,3 dimethylxantine) và theobromine (3,7-dimethylxantine) rất giống nhau, các hoạt tính sinh học rất khác nhau; Ví dụ, trong tác dụng lợi tiểu thứ tự dược tính tăng: caffeine < theophylline < theobromine nhưng theo thứ tự các hiệu ứng trên thần kinh trung ương nhanh chóng giảm dần.

Cấu trúc hình học và điện tử của các alkaloid phản ánh rõ dược tính của chúng.1: Cấu trúc của caffeine, theophyline và theobromine. Hoạt tính sinh học của caffeine. Caffeine là một hoạt chất có dược tính. Tùy thuộc vào liều lượng, nó có thể gây kích thích nhẹ đối với hệ thần kinh trung ương.

Bất kì tác động dược lý nào của caffeine đều nhất thời, thông thường tác dụng này sẽ ngưng sau vài giờ. Caffeine không tích tụ trong cơ thể theo thời gian sử dụng. Nó thường bài tiết và thải ra ngoài sau vài giờ sử dụng. Một số người có thể bị mất ngủ do caffeine.

Tuy nhiên, các kết 6 quả nghiên cứu cho thấy rằng những người tiêu thụ caffeine có trí nhớ tăng và cải thiện khả năng tranh luận. Và những người này có thành tích cao trong khả năng vận động, cải thiện khả năng luyện tập thính giác thị giác. Tùy theo hàm lượng hấp thu, caffeine có thể gây kích thích nhẹ. Đôi khi nó cũng dẫn đến việc gây nghiện ở một số người.

Triệu chứng thường thấy nhất là đau đầu, mệt lả hoặc trạng thái mơ màng. Sự đau đầu có thể xuất hiện sớm nhất sau khi sử dụng lượng caffeine cuối cùng khoảng 18 giờ. Các tác động này thường không kéo dài, khoảng một ngày hoặc hơn và thường giảm dần khi giảm lượng caffeine sử dụng. Ngoài ra, caffeine còn có tác dụng giảm đau đầu, giúp con người cảm thấy năng động.

Kích thích hệ thần kinh trung ương, làm tinh thần minh mẫn, tăng hiệu suất làm việc. Caffeine có thể làm tăng hiệu quả diệt tế bào ung thu của thuốc chống ung thư. Các chất gây phá hủy DNA và có thể có thể hỗ trợ trong việc khắc phục sự kháng thuốc tự nhiên [50]. Bức xạ ion hóa và các tác nhân alkyl hóa làm tăng hiệu lực độc của caffeine đối với các tác nhân phá hoại DNA.

Shoyab [43] đề xuất rằng tác nhân chống u ung thư của caffeine có thể liên quan đến khả năng ức chế sự tạo liên kết các chất chuyển hóa hoạt động của các chất gây ung thư đối với chuỗi DNA tế bào. Do đó caffeine có thể được sử dụng trong việc điều chỉnh hoạt tính của các loại thuốc thêm vào trong cơ thể. Sự kết hợp của caffeine với adriamycin (một loại thuốc chống ung thư) có thể làm tăng đáng kể hoạt tính kháng u trong cơ thể mà không làm tăng tác dụng phụ của nó. Caffeine ức chế các hoạt chất gây ung thư trong khói thuốc lá, nhưng việc sử dụng đồng thời chất caffeine và thuốc lá tạo thành một mối nguy hại lớn đối với thai nhi đang phát triển [12].

Caffeine làm giảm lượng paracetamol do đó làm giảm độc tính cho gan. Anderson và đồng nghiệp [40] đã chỉ ra rằng caffeine làm tăng epinephrine trong huyết tương, tăng tiêu thụ oxy và chuyển hóa carbohydratee, trong khi giảm quá trình chuyển hóa lipid. Caffeine cũng làm thay đổi hoạt động tim mạch bằng cách gia tăng động mạch huyết áp. Hoạt tính sinh học của theophyline Theophylline thường được sử dụng để ngăn ngừa và điều trị thở khò khè, hơi thở nặng nề, tức ngực trong bệnh hen suyễn, viêm phế quản mạn tính, khí thủng phổi và 7 một số bệnh về phổi khác.

Thuốc có tác dụng mở rộng đường dẫn khí ở phổi, giúp bạn dễ thở hơn. Hoạt tính sinh học của theophylline được ứng dụng rộng rãi và có tác dụng nhanh chóng. Ito và đồng nghiệp (2002) [28] cho thấy với liều lượng thấp theophylline có tác dụng chống hen suyễn bằng việc tăng hoạt hóa của HDAC sau đó được tập hợp bởi corticosteroid để ngăn chặn các gene gây viêm. Nó còn có hoạt tính chống viêm thích hợp để điều trị hen phế quản, khi được thêm vào thuốc làm giãn phế quản và làm giảm hàng đờm.

Taheuchi et al, (1999), [45] thấy rằng theophyline có thể chết tế bào eosinoplies ở bệnh nhân hen phế quản, và hiệu quả lâm sàng của nó có thể làm giảm các tế bào viêm trong đường hô hấp. Theophyline cũng tăng cường chuyển hóa lipid từ các mô mỡ, sau đó kích thích sự chuyển dịch carnitine vào các mô thận để tạo nhóm acyl-carnitine cho quá trình oxy hóa tiếp theo bên trong ti thể. Việc điều trị kéo dài sử dụng theophylline có thể tăng hoặc giảm phản ứng miễn dịch, tùy thuộc theo liều dùng, thông qua các modul chuyên biệt mà ảnh hưởng đến hoạt tính adenosine deaminase và tình trạng corticosteroid của tiểu cầu. Việc điều trị bằng theophyline ở liều phù hợp có thể không tạo nên tác dụng phụ đối với độ chắc xương, nhưng đối với bệnh nhân sử dụng liều lớn cần phải được theo dõi kỹ càng để kiểm soát tình trạng khối xương.

Heparin và theophylline ở liều trung bình có hiệu quả kích hoạt các enzyme chuyển hóa, giữ cho thời gian hoạt động của tinh trùng lâu hơn, và hiệu quả kìm hãm các tinh trùng hoạt tính quá cao. Theophyline làm tăng lượng glucocorticoid trong huyết thanh, và được sử dụng như chất giãn cơ hoặc giãn mạch máu, và cũng hiệu quả như là một chất kích thích lợi tiểu và tim mạch [37].