MỞ ĐẦU 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2 Mục tiêu của đề tài 3 1.3 Phạm vi nghiên cứu 3 1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3 1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam 5 2.2 Nguồn gen khoai tây dại và tình hình khai khác nguồn gen khoai tây dại 7 2.1 Vai trò của nguồn gen kháng bệnh trên cây khoai tây 7 2.2 Tình hình khai thác nguồn gen kháng bệnh trong chọn tạo giống khoai tây 8 2.3 Cơ sở khoa học của phƣơng pháp dung hợp tế bào trần 10 2.1 Tách tế bào trần 10 2.2 Nuôi cấy tế bào trần 11 2.3 Tái sinh tế bào trần 12 2.4 Dung hợp tế bào trần 13 2.5 Chọn lọc các con lai soma 14 2.4 Bệnh mốc sƣơng trên cây khoai tây 15 2.1 Giới thiệu về bệnh mốc sƣơng 15 2.2 Đặc điểm xâm nhiễm của nấm P.3 Cơ sở phân tử của tính kháng bệnh mốc sƣơng do nấm P. infestans gây ra 18 iii 2.4 Các nghiên cứu về gen kháng bệnh mốc sƣơng trên cây khoai tây 20 2.5 Các phƣơng pháp chọn tạo giống khoai tây 23 2.1 Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp truyền thống 23 2.2 Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp chuyển gen 23 2.3 Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp dung hợp tế bào trần 24 PHẦN 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 30 3.1 Địa điểm nghiên cứu 30 3.2 Thời gian nghiên cứu 30 3.2 Vật liệu nghiên cứu 30 3.1 Vật liệu thực vật 30 3.3 Nội dung nghiên cứu 32 3.1 Nội dung 1: Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng 32 3.2 Nội dung 2: Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp xác định độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR 33 3.3 Nội dung 3: Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma và các đặc tính nông sinh học 33 3.4 Nội dung 4: Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc 34 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 3.1 Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng 34 3.2 Xác định con lai soma bằng đo độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR 38 3.3 Đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử 39 3.4 Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc 43 3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 44 iv PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 4.1 Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng 45 4.2 Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây trồng thu thập đƣợc 48 4.3 Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp 51 4.4 Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp đo độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR 55 4.5 Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử 58 4.6 Nghiên cứu tạo con lai trở lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng 73 4.2 Thảo luận 84 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91 5.2 Kiến nghị 92 Danh mục các công trình công bố 93 Tài liệu tham khảo 94 Phụ lục 104 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BA : 6-benzyl amino purine BC : Backcross CNSH : Công nghệ sinh học CT : Công thức CV : Coefficient of variation DAS – ELISA : Double Antibody Sandwich – Enzyme linked imunosorbent assay DNA : Deoxyribonucleic acid ELISA : Enzyme – linked imunosorbent assay FAO : Food and Agriculture Organization GA3 : Gibberellic Acid IAA : Indole-3-acetic acid JKI : Julius Kuehn Institute KLCTB : Khối lƣợng củ trung bình LSD : Least significant difference MS : Murashige and Skoog NAA : Naphthaleneacetic acid NSLT : Năng suất lý thuyết NSTT : Năng suất thực thu OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction PEG : Polyethylene glycol PVX : Potato virus X PVY : Potato virus Y RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA SAS : Statistical Analysis Systems SH : Somatic hybrid SSR : Simple sequence repeat Tm : Nhiệt độ gắn mồi UV : Ultra violet vi DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1 Năng suất và năng lƣợng của một số cây lƣơng thực ở các nƣớc đang phát triển 5 2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới năm 2013 6 2.3 Tốp 10 quốc gia có sản lƣợng khoai tây lớn nhất thế giới 6 2.4 Diện tích, năng suất và sản lƣợng khoai tây của Việt Nam giai đoạn 2006 - 2013 7 2.5 Tổng kết về kết quả đánh giá tính kháng của các loài khoai tây dại chính đối với một số loại sâu, bệnh hại trên cây khoai tây và chống chịu với các điều kiện bất thuận của môi trƣờng 8 3.1 Các vật liệu đã thu thập, nguồn gốc, độ bội và các tính trạng mong muốn phục vụ cho lai soma 31 3.2 Các mồi sử dụng để chọn lọc con lai 32 3.3 Các cặp mồi phát hiện gen kháng mốc sƣơng 32 4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ macerozym và cellulase trong dung dịch enzym đến hiệu suất tách tế bào trần của các dòng/giống khoai tây thí nghiệm 45 4.2 Ảnh hƣởng của thời gian ủ của mô lá trong dung dịch enzym đến hiệu suất tế bào trần thu đƣợc 47 4.3 Ảnh hƣởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lƣợng tế bào sau dung hợp (Nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum bulbocastanum và Delikat) 48 4.4 Kết quả tái sinh và độ bội của các con lai tái sinh sau dung hợp ở các mật độ tế bào dung hợp khác nhau (Nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum bulbocastanum và Delikat) 50 4.5 Kết quả dung hợp giữa các dòng khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội bằng phƣơng pháp xung điện 51 4.6 Sự phân chia của các tổ hợp lai sau khi dung hợp trên các điều kiện môi trƣờng khác nhau 52 4.7 Sự phân chia của các tổ hợp lai trên các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau 53 vii 4.8 Ảnh hƣởng của môi trƣờng tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai 54 4.9 Kết quả nuôi cấy tái sinh chồi của các tổ hợp lai sau dung hợp 55 4.10 Kết quả tái sinh và phân tích độ bội thể của các tổ hợp lai sau dung hợp 56 4.11 Kết quả chọn lọc con lai soma bằng phân tích độ bội và chỉ thị phân tử SSR 58 4.12 Đặc điểm hình thái của nấm P. infestans trong quá trình nuôi cấy 59 4.13 Phản ứng của một số giống khoai tây với 2 mẫu mốc sƣơng thu thập từ Hà Nội và Lạng Sơn 59 4.14 Kết quả đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma và dòng bố mẹ bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời 61 4.15 Kết quả đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma và dòng bố mẹ bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ (tuber slice test) 63 4.16 Kết quả đánh giá các con lai soma và các dòng bố mẹ về khả năng kháng bệnh mốc sƣơng trên đồng ruộng và đánh giá sự thành thục của cây 64 4.17 Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học của các dòng/giống khoai tây bố mẹ và con lai soma 68 4.18 Đánh giá các tính trạng trên củ của các con lai soma và các dòng bố mẹ 70 4.19 Kết quả lai lai trở lại giữa các con lai soma với giống khoai tây trồng làm bố 74 4.20 Đánh giá khả năng kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai BC1 ở giai đoạn cây con 75 4.21-A Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học của các con lai BC.21-B Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học của các con lai BC 79 4.22 Kết quả đánh giá năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của cá con lai BC1 80 viii DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 3.1 Các loài khoai tây dại nhị bội đƣợc trồng trong nhà kính để phục vụ thí nghiệm 30 4.1 Hình ảnh tế bào trần của các dòng/giống khoai tây khác nhau với các enzym phù hợp.2 Chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở các tần số và số lần xung khác nhau.3 Các macrocallus tái sinh sau khi dung hợp 51 4.4 Sự phân chia của tổ hợp lai trn3G + Delikat trên các điều kiện môi trƣờng khác nhau sau 4 ngày nuôi cấy 52 4.5 Khả năng tái sinh chồi của tổ hợp lai trn + Rasant sau 12 tuần trên môi trƣờng khác nhau 55 4.6 Hình ảnh độ bội của dòng khoai tây bố mẹ và con lai 56 4.7 Kết quả phân tích SSR với chỉ thị phân tử STIIKA của tổ hợp lai trn 3G + cv.8 Kết quả phân tích SSR với chỉ thị phân tử STM2022 của tổ hợp lai trn 3G + cv.9 Bọc động bào tử và cành bọc động bào tử của nấm mốc sƣơng 59 4.10 So sánh tính độc của 2 nguồn nấm bệnh phân lập từ Hà Nội và Lạng Sơn 60 4.11 Sự biểu hiện vết bệnh trên lá sau 6 ngày lây nhiễm 62 4.12 Sự biểu hiện tính kháng trên đồng ruộng của con lai soma blb2G + Delikat (SH2283/5) 65 4.13- A Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 1/1’ 66 4.13-B Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu blb1 66 4.13-C Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu blb3 67 4.14 Các đặc tính hình thái, sinh trƣởng và đặc điểm ra hoa của các con lai soma (2283/5/1; 2281/10, 2292/4, 2295/1) của tổ hợp lai blb2G (+) Delikat so với các dòng/giống bố mẹ (Delikat, S.15-A Các biến dị về hình thái, kiểu sinh trƣởng của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai 72 4.15- B Các biến dị về dạng lá của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai 72 ix 4.15- C Các biến dị về dạng hoa của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai Delikat (+) trn3G 73 4.15- D Các biến dị về dạng củ của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai Rasant (+) trn3G 73 4.16 Một số tổ hợp lai backcross thành công 74 4.17 Cây con sau gieo hạt 10 ngày 75 4.18 Kết quả phân tích độ bội của các con lai BC1 76 4.
Tổng quan luận án
Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong bốn cây lương thực chính trên thế giới, giữ vai trò quan trọng trong việc đảm bảo an ninh lương thực. Trong quá trình canh tác, bệnh mốc sương do nấm Phytophthora infestans (Mont.) de Bary gây ra là dịch hại nguy hiểm nhất, có thể làm giảm sút nghiêm trọng năng suất và phá hủy toàn bộ ruộng khoai tây trong thời gian từ một đến hai tuần khi gặp điều kiện thời tiết ẩm mát. Ước tính từ Trung tâm Khoai tây Quốc tế (CIP), chi phí sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học để kiểm soát bệnh mốc sương tại Mỹ, châu Âu và các nước đang phát triển tiêu tốn khoảng 1 tỷ USD mỗi năm. Việc lạm dụng hóa chất không chỉ làm gia tăng chi phí sản xuất mà còn gây ô nhiễm môi trường, đồng thời làm phát sinh các chủng nấm kháng thuốc do P. infestans có tính biến dị di truyền và khả năng thích ứng cao.
Trong lịch sử chọn giống, việc khai thác 11 gen kháng trội (R1 đến R11) từ loài khoai tây dại Solanum demissum chỉ mang lại tính kháng dọc (kháng đặc hiệu chủng), nhanh chóng bị các chủng nấm mới vượt qua sau một thời gian đưa vào sản xuất. Khoảng trống nghiên cứu đặt ra là cần tìm kiếm và chuyển nạp các nguồn gen kháng ngang, kháng phổ rộng và bền vững từ các loài khoai tây dại khác. Các loài khoai tây dại nhị bội có nguồn gốc từ Mexico như Solanum bulbocastanum, Solanum pinnatisectum và Solanum tarnii mang nguồn gen kháng mốc sương rất cao. Tuy nhiên, rào cản bất tương hợp sinh sản giữa các loài hoang dại nhị bội (2n = 2x = 24) và khoai tây trồng tứ bội (2n = 4x = 48) do sự sai khác về mức bội thể và số cân bằng nội nhũ (Endosperm Balance Number - EBN) khiến phương pháp lai hữu tính thông thường không thể thực hiện được. Do đó, dung hợp tế bào trần (lai soma) kết hợp với lai trở lại (backcross) là giải pháp kỹ thuật được lựa chọn nhằm chuyển tính kháng bệnh từ loài hoang dại vào khoai tây trồng.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm ba nội dung:
- Xác định được các thông số để tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội kháng bệnh mốc sương và các giống khoai tây trồng mẫn cảm với bệnh mốc sương.
- Tạo được các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh mốc sương từ loài dại vào khoai tây trồng.
- Tạo được các con lai lại (backcross - BC) giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm tạo được dòng vật liệu di truyền khoai tây mang gen kháng và có đặc điểm nông sinh học phù hợp phục vụ phát triển giống khoai tây kháng bệnh mốc sương ở Việt Nam.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: 03 dòng khoai tây hoang dại nhị bội (2n = 2x = 24) gồm Solanum bulbocastanum (ký hiệu blb2G), Solanum pinnatisectum (ký hiệu pnt2G), Solanum tarnii (ký hiệu trn3G); 05 giống khoai tây trồng tứ bội (2n = 4x = 48) gồm Agave, Atlantic, Delikat, Quarta, Rasant; và các chủng nấm Phytophthora infestans phân lập tại Việt Nam (Hà Nội, Lạng Sơn).
- Phạm vi không gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Sinh học Nông nghiệp (Học viện Nông nghiệp Việt Nam) và Viện Nghiên cứu Chọn tạo Giống Cây trồng (Julius Kuehn Institute - JKI, CHLB Đức).
- Phạm vi thời gian: Các thí nghiệm và đánh giá thực nghiệm được tiến hành trong giai đoạn từ năm 2011 đến năm 2015.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Tổng quan tài liệu trong luận án hệ thống hóa toàn diện các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến sản xuất khoai tây, nguồn gen hoang dại, sinh học nấm mốc sương và công nghệ dung hợp tế bào trần:
- Tình hình sản xuất khoai tây: Trích dẫn số liệu từ FAOSTAT (2014) và Struik & Wiersema (1999), diện tích trồng khoai tây toàn cầu năm 2013 đạt 19.041 nghìn ha với năng suất bình quân 18,9 tấn/ha. Tại Việt Nam, giai đoạn 2006-2013 ghi nhận diện tích dao động từ 23.077 ha đến 37.100 ha, năng suất thực tế đạt 13,6 tấn/ha năm 2013, thấp hơn nhiều so với tiềm năng 15-30 tấn/ha do hạn chế về nguồn giống sạch bệnh và khả năng chống chịu sâu bệnh.
- Nguồn gen khoai tây dại: Hawkes (1990) và Ross (1986) đã tổng kết việc khai thác 6 loài khoai tây dại chủ yếu (S. demissum, S. acaule, S. chacoense, S. spegazzinii, S. stoloniferum, S. vernei) cho các giống khoai tây trồng tại châu Âu để kháng nấm, vi khuẩn (Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora), virus (PVX, PVY, PLRV) và tuyến trùng (Globodera rostochiensis).
- Cơ sở kỹ thuật tế bào trần: Cocking (1960) mở đầu kỹ thuật sử dụng enzym phân giải thành tế bào; Kao và cs. (1975) hoàn thiện phương pháp nuôi cấy giọt huyền phù; Nagata và cs. (1971) phát triển nuôi cấy trong môi trường thạch; Haberlach và cs. (1985) cùng Möllers & Wenzel (1992) thiết lập hệ thống môi trường tạo mô sẹo Cul-medium và tái sinh chồi RJM.
- Tác nhân gây bệnh và cơ sở phân tử tính kháng mốc sương: Erwin & Ribeiro (1996) mô tả chu kỳ sinh sản vô tính và hữu tính của P. infestans. Ngô Thị Xuyên và Lê Hồng Vĩnh (2003, 2005) xác định các mẫu phân lập tại Việt Nam đều thuộc kiểu ghép cặp A1. Về cơ chế phân tử, Flor (1971) đề xuất thuyết tương tác "gen đối gen" (gene-for-gene); Whisson và cs. (2007) xác định phức hợp peptide tín hiệu RXLR-EER của protein Avr3a; Haverkort và cs. (2009) công bố kích thước hệ gen P. infestans đạt 240 Mbp. Đối với nguồn gen kháng từ S. bulbocastanum, van der Vossen và cs. (2003, 2005), Song và cs. (2003), Lokossou và cs. (2009), Wang và cs. (2008) đã lập bản đồ và phân lập các gen kháng không đặc hiệu chủng thuộc nhóm NBS-LRR gồm Rpi-blb1 (trên NST VIII), Rpi-blb2 (trên NST VI) và Rpi-blb3 (trên NST IV).
- Các nghiên cứu dung hợp tế bào trần khoai tây: Mattheij và cs. (1992), Thach và cs. (1993), Helgeson và cs. (1998), Thieme và cs. (1997, 2004, 2007, 2008, 2010), Smyda và cs. (2013, 2016) đã thực hiện dung hợp tế bào trần giữa khoai tây trồng với các loài dại S. circaeifolium, S. bulbocastanum, S. tarnii, S. michoacanum, kết hợp sử dụng đo độ bội thể bằng Flow cytometry và chỉ thị phân tử (SSR, RAPD, AFLP, DArT).
- Nghiên cứu tại Việt Nam: Đào Huy Chiên và Trịnh Văn Mỵ (1990), Phạm Xuân Tùng (1988) khảo nghiệm các dòng kháng nhập nội từ CIP; Nguyễn Thị Phương Thảo và cs. (2009, 2011a, 2011b, 2012), Đỗ Thị Thu Hà và cs. (2012), Đinh Thị Thu Lê và cs. (2012), Vũ Thị Thu Hằng và cs. (2012) bước đầu dung hợp tế bào trần thành công giữa các dòng nhị bội để tạo thể tứ bội kháng virus PVY.
Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là: Mặc dù kỹ thuật dung hợp tế bào trần đã được nghiên cứu trên thế giới, nhưng hiệu quả tách tế bào trần và tái sinh cây từ các loài khoai tây hoang dại nguồn gốc Mexico (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. tarnii) vẫn rất thấp do phụ thuộc chặt chẽ vào kiểu gen và điều kiện thao tác. Tại Việt Nam, chưa có công trình nào nghiên cứu tích hợp quy trình tách, dung hợp xung điện giữa các loài dại mang gen kháng mốc sương này với các giống khoai tây trồng thương mại thích nghi trong nước, cũng như chưa đánh giá sự tồn tại của các gen kháng Rpi-blb và khả năng chuyển giao tính trạng qua thế hệ lai trở lại BC1.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết của đề tài dựa trên:
- Nguyên lý công nghệ tế bào thực vật: Tính toàn năng của tế bào thực vật (totipotency); khả năng phân giải thành tế bào bằng enzym thủy phân cellulase và macerozym để thu nhận tế bào trần; cơ chế tái tạo thành tế bào và phân chia nguyên sinh chất khi được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin) với tỷ lệ thích hợp; và hiện tượng dung hợp màng tế bào dưới tác động của xung điện trường (electrofusion).
- Cơ sở di truyền học phân tử và miễn dịch học thực vật: Thuyết tương tác "gen đối gen", trong đó thụ thể nội bào mang cấu trúc lặp giàu Leucine (NBS-LRR) nhận biết các protein không độc (Avr) của nấm gây bệnh mang mô típ RXLR-EER để kích hoạt phản ứng siêu nhạy (Hypersensitive Reaction - HR), ngăn chặn sự phát triển của sợi nấm; và ứng dụng các chỉ thị phân tử vi vệ tinh (SSR), mồi PCR đặc hiệu gen kháng để chọn lọc cá thể lai mang tổ hợp gen mong muốn.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:
- Phương pháp tách và nuôi cấy tế bào trần: Lá in vitro 3-4 tuần tuổi nuôi cấy trên môi trường MS được xử lý trong dung dịch enzym với 4 công thức nồng độ (E1: 0,2% Macerozym + 0,8% Cellulase; E2: 0,1% Macerozym + 0,6% Cellulase; E3: 0,1% Macerozym + 0,8% Cellulase; E4: 0,1% Macerozym + 1,0% Cellulase) trong các khoảng thời gian ủ khác nhau (14, 15, 16 giờ) theo quy trình Cocking (1960) được cải tiến bởi Thach và cs. (1993) và Thieme và cs. (1997, 2008). Sản phẩm tế bào trần sau dung hợp được nuôi cấy trong môi trường VKMII lỏng ở 25°C trong tối; các microcallus hình thành được chuyển sang môi trường Cul-medium (Haberlach và cs., 1985) đặt ở điều kiện 16 giờ chiếu sáng/ngày, 22°C để tạo macrocallus (kích thước 0,5-1,5 mm); sau đó cấy chuyển sang môi trường RJM (Möllers & Wenzel, 1992) để tái sinh chồi và môi trường MS để tạo cây hoàn chỉnh.
- Phương pháp dung hợp tế bào trần bằng xung điện: Sử dụng máy xung điện Electro Cell Fusion CFA 500 (Krüss GmbH, Hamburg), thử nghiệm các tần số điện trường (tối ưu ở 800 kHz), số lần xung (2 lần xung) và mật độ tế bào (4 x 10^5 đến 5 x 10^5 tế bào/ml).
- Phương pháp xác định con lai soma:
- Đo độ bội thể bằng thiết bị Beckman Coulter Cell Lab Quanta Flow cytometry theo quy trình của Dinu & Thieme (2001) để sàng lọc các cá thể mang mức bội thể lục bội (2n = 6x = 72).
- Phân tích đa hình DNA bằng 5 cặp chỉ thị phân tử SSR (STM2022, STM1106, STM3023, STM1104, STIIKA) theo Song Ye-Su và cs. (2005) để khẳng định thể dị hợp tử mang phân đoạn DNA của cả hai dòng bố mẹ.
- Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh mốc sương:
- Phân lập và nhân nuôi nguồn nấm P. infestans thu thập từ Hà Nội và Lạng Sơn.
- Đánh giá lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời (Detached Leaflet Assay) theo thang điểm bệnh sau 6 ngày lây nhiễm (Darsow và cs., 2004).
- Đánh giá lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ (Tuber slice test) theo Hammann và cs. (2009).
- Đánh giá tính kháng và độ thành thục trên đồng ruộng (Field test).
- Nhận diện sự có mặt của các gen kháng bằng phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu: mồi Blb1 (sản phẩm 820 bp) và mồi 1/1' (sản phẩm 213 bp) cho gen Rpi-blb1; mồi Blb3 (sản phẩm 618 bp) cho gen Rpi-blb3; mồi Blb2F/R cho gen Rpi-blb2 (Wang và cs., 2008; Lokossou và cs., 2010).
- Phương pháp lai trở lại và đánh giá nông sinh học: Thụ phấn giữa các con lai soma lục bội với các giống khoai tây trồng tứ bội để thu hạt lai BC1; gieo hạt, đánh giá độ bội, khả năng kháng bệnh cây con và các chỉ tiêu nông học (chiều cao cây, số thân/cây, dạng lá, dạng hoa, năng suất củ, khối lượng củ trung bình, dạng củ, màu sắc vỏ và ruột củ).
- Xử lý số liệu: Dữ liệu thực nghiệm được tính toán và phân tích phương sai bằng phần mềm thống kê SAS, so sánh trung bình nghiệm thức theo kiểm định LSD ở mức ý nghĩa p < 0,05 và xác định hệ số biến động CV(%).
Nội dung chính theo từng chương
Phần 1: Mở đầu
Phần này trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ thiệt hại do bệnh mốc sương P. infestans trên khoai tây, hạn chế của biện pháp phòng trừ hóa học và tính kém bền vững của các gen kháng dọc R1-R11. Tác giả xác lập 3 mục tiêu cụ thể, giới hạn phạm vi nghiên cứu trên 3 loài dại nhị bội và 5 giống trồng tứ bội trong giai đoạn 2011-2015, nêu rõ các đóng góp mới về quy trình công nghệ, hệ thống vật liệu lai soma lục bội và các dòng lai trở lại BC1 mang gen kháng mốc sương.
Phần 2: Tổng quan tài liệu
Nội dung chương tổng quan gồm 5 mục lớn:
- Mục 2.1: Phân tích tình hình sản xuất khoai tây thế giới và Việt Nam, nhấn mạnh tiềm năng năng suất chưa được khai thác tại Đồng bằng sông Hồng và sự thiếu hụt nguồn giống sạch bệnh trong nước (chỉ đáp ứng 20-25% nhu cầu).
- Mục 2.2: Đánh giá giá trị nguồn gen của chi Petota, tổng hợp các loài hoang dại mang gen kháng sâu bệnh và chống chịu phi sinh học theo phân loại của Hawkes (1990).
- Mục 2.3: Trình bày cơ sở khoa học của công nghệ tế bào trần thực vật, bao gồm các khâu tách cơ học/enzym, cơ chế nuôi cấy lỏng/thạch/giọt, tái sinh mô sẹo (microcallus sang macrocallus), kỹ thuật dung hợp tự phát và kích thích (hóa chất PEG so với xung điện), các phương pháp chọn lọc con lai soma.
- Mục 2.4: Tổng thuật về sinh học nấm P. infestans, các hình thức sinh sản vô tính/hữu tính, các chủng mating type A1/A2, cơ chế xâm nhiễm qua ống mầm và vòi hút, phân loại các protein hiệu ứng (RXLR trong tế bào chất và enzym thủy phân trong gian bào), cơ sở phân tử của tính kháng MAMP/PAMPs và tương tác gen-đối-gen với các gen kháng Rpi-blb1, Rpi-blb2, Rpi-blb3, Rpi-mcd1, Rpi-ber, Rpi-vnt1.
- Mục 2.5: So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp chọn giống khoai tây truyền thống (chu kỳ dài trên 10 năm, phân ly phức tạp ở thể tứ bội), chuyển gen (hạn chế về gen đa gen và rào cản GMO) và dung hợp tế bào trần (bảo toàn hệ gen nhân và tế bào chất, vượt qua rào cản bất thụ lai xa).
Phần 3: Phương pháp nghiên cứu
Chương này mô tả chi tiết địa điểm, thời gian, nguồn gốc vật liệu thực vật từ Ngân hàng gen IPK (Đức) và các công ty giống (Norika, Europlant). Chương xây dựng 4 nội dung nghiên cứu với 17 thí nghiệm thực nghiệm cụ thể:
- Nội dung 1 (Thí nghiệm 1-8): Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzym, thời gian ủ, tần số xung điện, mật độ tế bào và môi trường nuôi cấy (VKMII, Cul-medium, RJM) đến hiệu suất tách, dung hợp và tái sinh chồi.
- Nội dung 2 (Thí nghiệm 9-10): Quy trình xác định thể lai soma bằng đo Flow cytometry và 5 cặp mồi SSR (STM 2022, STM 1106, STM 3023, STM 1104, STIIKA).
- Nội dung 3 (Thí nghiệm 11-16): Quy trình phân lập nấm bệnh, đánh giá tính kháng bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá tách rời, lát cắt củ, ngoài đồng ruộng, phát hiện gen kháng Rpi-blb bằng mồi PCR đặc hiệu và khảo sát các tính trạng nông sinh học.
- Nội dung 4 (Thí nghiệm 17): Quy trình lai trở lại (backcross) với cây bố là giống khoai tây trồng và chọn lọc dòng BC1.
| STT | Tên mồi | Trình tự mồi (Forward - Reverse) | Mục đích sử dụng |
|---|---|---|---|
| 1 | STM 2022 | F: GCGTCAGCGATTTCAGTACTA / R: TTCAGTCAACTCCTGTTGCG |
Chọn lọc con lai soma bằng chỉ thị SSR |
| 2 | STM 1106 | F: TCCAGCTGATTGGTTAGGTTG / R: ATGCGAATCTACTCGTCATGG |
Chọn lọc con lai soma bằng chỉ thị SSR |
| 3 | STM 3023 | F: AAGCTGTTACTTGATTGCTGCA / R: GTTCTGGCATTTCCATCTAGAGA |
Chọn lọc con lai soma bằng chỉ thị SSR |
| 4 | STM 1104 | F: TGATTCTCTTGCCTACTGTAATCG / R: CAAAGTGGTGTGAAGCTGTGA |
Chọn lọc con lai soma bằng chỉ thị SSR |
| 5 | STIIKA | F: TTCGTTGCTTACCTACTA / R: CCCAAGATTACCACATTC |
Chọn lọc con lai soma bằng chỉ thị SSR |
| 6 | blb1 | F: AACCTGTATGGCAGTGGCATG / R: GTCAGAAAAGGGCACTCGTG |
Phát hiện gen Rpi-blb1 (kích thước 820 bp, Tm 66°C) |
| 7 | 1/1' | F: CACGAGTGCCCTTTTCTGAC / R: ACAATTGAATTTTTAGACTT |
Phát hiện gen Rpi-blb1 (kích thước 213 bp, Tm 57°C) |
| 8 | blb3 | F: TGTCGCTGAAAGAGTAGGCC / R: TATGGAGTGGCTTCTTGAAC |
Phát hiện gen Rpi-blb3 (kích thước 618 bp, Tm 62°C) |
Phần 4: Kết quả và thảo luận
Chương kết quả và thảo luận trình bày chi tiết các dữ liệu thu được:
- Kết quả tách tế bào trần: Nồng độ enzym và thời gian ủ tối ưu phụ thuộc vào kiểu gen; thời gian ủ mô lá trong dung dịch enzym thích hợp dao động từ 14 đến 16 giờ cho mật độ và sức sống tế bào trần cao nhất.
- Kết quả dung hợp xung điện: Tần số xung điện 800 kHz với 2 lần xung ở mật độ 4 x 10^5 đến 5 x 10^5 tế bào/ml đạt hiệu quả kết hợp tối ưu giữa các dòng dại và giống trồng.
- Kết quả tạo mô sẹo và tái sinh cây: Từ 7 tổ hợp dung hợp, nghiên cứu đã tạo ra tổng số 1.612 callus trên môi trường Cul-medium và tái sinh được 188 cây hoàn chỉnh trên môi trường RJM.
- Phân tích mức bội thể và chỉ thị SSR: Đo Flow cytometry và phân tích 5 chỉ thị SSR đã xác định được 69 dòng lai soma liên loài đích thực ở mức lục bội (2n = 6x = 72) kết hợp hệ gen của loài dại nhị bội và giống trồng tứ bội.
- Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương: Đánh giá bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời, lát cắt củ và ngoài đồng ruộng cho thấy các con lai soma thuộc tổ hợp S. bulbocastanum (+) Delikat (gồm các dòng 2295/2, 2292/4, 2181/10 và 2283/5 hay SH2283/5) biểu hiện tính kháng mốc sương rất cao. Ngược lại, các tổ hợp lai soma từ S. pinnatisectum và S. tarnii không thể hiện tính kháng rõ rệt trong các thử nghiệm này.
- Phân tích gen kháng bằng PCR: Phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu đã xác nhận sự hiện diện đồng thời của hai gen kháng Rpi-blb1 (khuếch đại đoạn 820 bp với mồi blb1 và đoạn 213 bp với mồi 1/1') và Rpi-blb3 (khuếch đại đoạn 618 bp với mồi blb3) trên các con lai soma của tổ hợp S. bulbocastanum (+) Delikat.
- Kết quả lai trở lại BC1: Lai giữa các con lai soma lục bội với các giống khoai tây trồng tứ bội làm bố đã thu được 11 tổ hợp lai BC1. Trong đó, từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat đã chọn lọc được 4 dòng con lai BC1 (ký hiệu 13.11) mang gen kháng bệnh mốc sương, đồng thời biểu hiện các đặc tính nông sinh học và chất lượng củ thương phẩm phù hợp với điều kiện sản xuất.
| Chỉ tiêu nghiên cứu thực nghiệm | Kết quả thu được |
|---|---|
| Số tổ hợp dung hợp tế bào trần thực hiện | 7 tổ hợp lai |
| Tổng số callus hình thành trên môi trường Cul-medium | 1.612 callus |
| Tổng số dòng cây tái sinh hoàn chỉnh trên môi trường RJM | 188 dòng chồi/cây |
| Số con lai soma lục bội (2n = 6x = 72) được xác nhận | 69 con lai soma |
| Tổ hợp lai soma mang gen kháng mốc sương Rpi-blb1 và Rpi-blb3 | Solanum bulbocastanum (+) Delikat (dòng 2295/2, 2292/4, 2181/10, 2283/5) |
| Tổng số tổ hợp lai trở lại (backcross) thành công | 11 tổ hợp lai BC1 |
| Số dòng BC1 chọn lọc mang tính kháng và nông sinh học quý | 4 dòng thuộc tổ hợp blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat (dòng 13.11) |
Phần 5: Kết luận và kiến nghị
Chương cuối tóm tắt các kết luận cốt lõi về thông số kỹ thuật dung hợp xung điện, số lượng thể lai soma lục bội thu nhận, sự hiện diện của gen kháng Rpi-blb1, Rpi-blb3 và 4 dòng lai BC1 triển vọng. Kiến nghị tập trung vào việc tiếp tục nhân giống vô tính và khảo nghiệm diện rộng các dòng lai BC1 tại các vùng sinh thái khoai tây của Việt Nam.
Kết quả và những đóng góp mới
Luận án đã đạt được các kết quả và đóng góp mới về mặt khoa học cũng như thực tiễn:
- Đóng góp về mặt phương pháp và quy trình công nghệ:
- Đã xác định được hệ thống thông số kỹ thuật chuẩn hóa để tách, dung hợp tế bào trần bằng xung điện và tái sinh cây giữa các loài khoai tây dại nhị bội (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. tarnii) với các giống khoai tây trồng tứ bội (Agave, Atlantic, Delikat, Quarta, Rasant).
- Bộ thông số bao gồm: thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzym từ 14 đến 16 giờ; thông số xung điện ở tần số 800 kHz với 2 lần xung; mật độ tế bào dung hợp tối ưu từ 4 x 10^5 đến 5 x 10^5 tế bào/ml; hệ thống môi trường nuôi cấy gồm môi trường VKMII lỏng cho sản phẩm sau dung hợp, môi trường Cul-medium để tạo mô sẹo (macrocallus) và môi trường RJM để tái sinh chồi hoàn chỉnh.
- Đóng góp về vật liệu di truyền và chọn tạo giống:
- Đã tạo ra 1.612 callus từ 7 tổ hợp dung hợp, tái sinh được 188 cây và sử dụng kết hợp phương pháp đo Flow cytometry cùng 5 chỉ thị SSR để xác nhận 69 con lai soma lục bội (2n = 6x = 72).
- Đã chứng minh các con lai soma của tổ hợp giữa loài hoang dại Solanum bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (các dòng 2295/2, 2292/4, 2181/10 và 2283/5) mang hai gen kháng bệnh mốc sương quan trọng là Rpi-blb1 và Rpi-blb3, biểu hiện khả năng kháng bệnh mốc sương cao trên lá, củ và ngoài đồng ruộng.
- Đã thực hiện thành công 11 tổ hợp lai trở lại (backcross) giữa các thể lai soma với khoai tây trồng và chọn lọc được 4 dòng con lai BC1 từ tổ hợp blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat (dòng 13.11) vừa duy trì được gen kháng bệnh mốc sương vừa mang các đặc tính nông sinh học quý, tạo nguồn vật liệu khởi đầu trực tiếp cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh tại Việt Nam.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu được ghi nhận từ văn bản gồm:
- Mặc dù đã tạo được các con lai soma lục bội từ 3 loài khoai tây dại, tính kháng bệnh mốc sương chỉ biểu hiện rõ rệt và ổn định ở các tổ hợp lai có nguồn gốc từ Solanum bulbocastanum, trong khi các tổ hợp lai từ S. pinnatisectum và S. tarnii chưa thể hiện tính kháng rõ rệt trong các phép thử lây nhiễm nhân tạo.
- Quần thể con lai soma lục bội và các thế hệ lai trở lại còn biểu hiện sự phân ly di truyền lớn về các tính trạng hình thái và nông sinh học (dạng củ, độ sâu của mắt củ, thời gian sinh trưởng), đòi hỏi thêm các chu kỳ chọn lọc tiếp theo.
Hướng nghiên cứu tiếp theo:
- Tiếp tục nhân nhanh và duy trì nguồn gen 4 dòng con lai BC1 triển vọng (13.11) bằng phương pháp nhân giống in vitro.
- Đưa các dòng con lai BC1 vào khảo nghiệm đồng ruộng nhiều vụ tại các vùng sinh thái trồng khoai tây trọng điểm ở miền Bắc và Tây Nguyên (Đà Lạt) để đánh giá tính ổn định của năng suất, phẩm chất củ và độ bền vững của tính kháng mốc sương dưới áp lực bệnh tự nhiên.
- Thực hiện các phép lai trở lại tiếp theo (BC2, BC3) hoặc tự thụ để ổn định bộ gen thương phẩm, phục vụ công nhận giống khoai tây mới.
Giá trị tham khảo
Luận án cung cấp nguồn tư liệu học thuật và thực tiễn hữu ích cho các nhóm đối tượng:
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Di truyền và Chọn giống cây trồng, Công nghệ sinh học thực vật: Tham khảo quy trình chi tiết về kỹ thuật tách, nuôi cấy, dung hợp tế bào trần bằng xung điện và tái sinh cây in vitro ở các đối tượng khó tái sinh thuộc chi Solanum.
- Các nhà nghiên cứu bệnh học thực vật và di truyền phân tử: Sử dụng bộ mồi SSR (STM2022, STM1106, STM3023, STM1104, STIIKA) để thẩm định thể lai soma; áp dụng các cặp mồi đặc hiệu blb1, 1/1', blb3 trong chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) đối với các gen kháng Rpi-blb; tham khảo các quy trình chuẩn về lây nhiễm nhân tạo nấm P. infestans trên lá đơn tách rời và lát cắt củ.
- Các cơ quan nghiên cứu và quản lý chọn tạo giống cây trồng: Tiếp nhận và khai thác nguồn vật liệu tiền chọn giống (các thể lai soma lục bội và các dòng BC1 mã hiệu 13.11) phục vụ công tác phát triển giống khoai tây kháng bệnh mốc sương tại Việt Nam.
Câu hỏi thường gặp
1. Những loài khoai tây hoang dại nào đã được sử dụng trong luận án để làm nguồn cho gen kháng bệnh mốc sương? Luận án sử dụng 3 dòng khoai tây dại nhị bội (2n = 2x = 24) thu thập từ Ngân hàng Gen Khoai tây Quốc tế tại Viện Leibniz (IPK, CHLB Đức) gồm: Solanum bulbocastanum (ký hiệu blb2G), Solanum pinnatisectum (ký hiệu pnt2G) và Solanum tarnii (ký hiệu trn3G).
2. Các gen kháng bệnh mốc sương cụ thể nào đã được phát hiện trong các con lai soma và bằng phương pháp nào? Hai gen kháng mốc sương không đặc hiệu chủng là Rpi-blb1 và Rpi-blb3 (nguồn gốc từ S. bulbocastanum) đã được phát hiện trong các con lai soma thuộc tổ hợp S. bulbocastanum (+) Delikat (các dòng 2295/2, 2292/4, 2181/10 và 2283/5) thông qua phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Blb1 (sản phẩm 820 bp), 1/1' (sản phẩm 213 bp) và cặp mồi blb3 (sản phẩm 618 bp).
3. Các thông số tối ưu cho quy trình tách và dung hợp tế bào trần bằng xung điện trong nghiên cứu là gì? Các thông số kỹ thuật được xác định gồm: thời gian ủ mô lá trong dung dịch enzym từ 14 đến 16 giờ; dung hợp tế bào trần bằng xung điện trên máy CFA 500 ở tần số 800 kHz với 2 lần xung; mật độ tế bào trần khi xung điện duy trì từ 4 x 10^5 đến 5 x 10^5 tế bào/ml; môi trường nuôi cấy lỏng VKMII, môi trường tạo mô sẹo Cul-medium và môi trường tái sinh chồi RJM.
4. Phương pháp nào được sử dụng để khẳng định các dòng tái sinh là con lai soma đích thực? Tác giả kết hợp hai phương pháp: (1) Đo hàm lượng DNA nhân bằng máy Beckman Coulter Cell Lab Quanta Flow cytometry để xác định mức bội thể lục bội (2n = 6x = 72, là sự kết hợp giữa 2x của loài dại và 4x của giống trồng); (2) Phân tích chỉ thị phân tử vi vệ tinh (SSR) với 5 cặp mồi (STM2022, STM1106, STM3023, STM1104, STIIKA) để chứng minh sự có mặt của các băng DNA đặc trưng từ cả hai dòng bố mẹ trên cùng một cá thể lai.
5. Kết quả lai trở lại (backcross) đã chọn lọc được những dòng triển vọng nào cho sản xuất tại Việt Nam? Từ 11 tổ hợp lai trở lại thành công, nghiên cứu đã chọn lọc được 4 dòng con lai BC1 từ tổ hợp blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat (mã hiệu chung 13.11). Các dòng này mang các gen kháng Rpi-blb1, Rpi-blb3, có khả năng kháng bệnh mốc sương và mang các đặc tính nông sinh học, hình thái củ phù hợp để phát triển giống khoai tây tại Việt Nam.
Kết luận
Luận án của nghiên cứu sinh Hoàng Thị Giang đã xây dựng thành công quy trình công nghệ tách, dung hợp tế bào trần bằng xung điện và nuôi cấy tái sinh giữa các loài khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội. Đề tài đã tạo ra 69 con lai soma lục bội (2n = 6x = 72), trong đó các dòng lai từ tổ hợp Solanum bulbocastanum (+) Delikat mang các gen kháng giá trị Rpi-blb1 và Rpi-blb3, thể hiện khả năng kháng cao với nấm Phytophthora infestans. Thông qua lai trở lại với giống Delikat, 4 dòng con lai BC1 (13.11) mang đặc tính kháng mốc sương và tính trạng nông sinh học tốt đã được chọn lọc thành công, tạo nguồn vật liệu di truyền khởi đầu quan trọng cho công tác chọn giống khoai tây kháng bệnh tại Việt Nam.