Luận án tiến sĩ nông nghiệp phân lập tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn phân giải keratin trong chăn nuôi

Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu nông nghiệp phân lập tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn phân giải keratin trong chăn nuôi, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

• Tác giả: Quách Thị Thanh Tâm
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Thị Minh Diệu
• Trường học: Đại học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn phân giải keratin trong chăn nuôi
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Cần Thơ

Tóm tắt

I. Phân lập vi khuẩn

Nghiên cứu tập trung vào phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải keratin từ các mẫu đất, nước và lông gia cầm tại các cơ sở giết mổ ở Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp. Tổng cộng 429 chủng vi khuẩn hiếu khí đã được phân lập, trong đó 115 chủng có khả năng phân giải keratin trên môi trường chứa bột lông gia cầm. Các chủng này được đánh giá qua hoạt tính keratinase trên cơ chất azokeratin. Kết quả cho thấy khả năng phân hủy bột lông gia cầm từ 20,87% đến 84,31% sau một tuần ủ ở 37°C.

1.1. Phân lập từ mẫu đất và nước

Các mẫu đất và nước từ các cơ sở giết mổ được thu thập và phân tích. 225 chủng vi khuẩn phân giải keratin được phân lập từ 126 mẫu đất và nước. Đặc biệt, 89 chủng vi khuẩn chịu nhiệt hiếu khí cũng được phân lập từ 23 mẫu đất và 7 mẫu nước tại các trang trại chăn nuôi gia cầm.

1.2. Đánh giá hoạt tính keratinase

Hoạt tính keratinase của các chủng vi khuẩn được đánh giá qua khả năng phân hủy bột lông gia cầm và heo. Kết quả cho thấy sự đa dạng trong khả năng phân hủy, từ 6,27% đến 63,38% đối với lông heo và từ 7,54% đến 66,66% đối với lông gia cầm.

II. Tuyển chọn vi khuẩn

Từ 429 chủng vi khuẩn phân lập, 26 chủng có khả năng phân hủy keratin hiệu quả nhất được tuyển chọn. Các chủng này được định danh bằng hệ thống phân loại Bergey và giải trình tự gen 16S rRNA. Kết quả cho thấy 73,08% thuộc lớp Bacilli, 3,85% thuộc lớp Betaproteobacteria, 7,69% thuộc lớp Flavobacteria và 15,38% thuộc lớp Gammaproteobacteria.

2.1. Định danh và phân loại

Các chủng vi khuẩn được định danh dựa trên đặc điểm hình thái và giải trình tự gen 16S rRNA. Cây phát sinh loài được xây dựng để xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng.

2.2. Chọn lọc chủng ưu việt

Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110 được chọn làm chủng ưu việt nhờ khả năng phân hủy lông gia cầm và heo hiệu quả nhất. Các chủng này được nghiên cứu sâu hơn về điều kiện nuôi cấy tối ưu.

III. Ứng dụng vi khuẩn

Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn phân giải keratin trong chăn nuôi, cụ thể là sử dụng Bacillus megaterium K79 để ủ lông gia cầm thành bột lông sinh học. Sản phẩm này được bổ sung vào khẩu phần ăn của gà thả vườn với tỷ lệ 2%, 5% và 8%. Kết quả cho thấy tỷ lệ bổ sung 5% giúp gà sinh trưởng tốt, tỷ lệ nuôi sống đạt 100% và các chỉ tiêu thân thịt tương đương với nhóm đối chứng.

3.1. Sản xuất bột lông sinh học

Lông gia cầm được ủ với Bacillus megaterium K79 trong 10 tuần để tạo ra bột lông sinh học. Sản phẩm này đạt tiêu chuẩn an toàn vi sinh và được sử dụng như nguồn bổ sung protein trong khẩu phần ăn của gà.

3.2. Hiệu quả trong chăn nuôi

Thí nghiệm nuôi gà thả vườn cho thấy bột lông sinh học giúp cải thiện tốc độ sinh trưởng và chất lượng thân thịt của gà. Điều này chứng minh tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn phân giải keratin trong việc xử lý chất thải chăn nuôi và tạo ra nguồn thức ăn bổ sung giá trị.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Chăn nuôi và chế biến thực phẩm tại Việt Nam tạo ra khối lượng phế phẩm lông gia súc, gia cầm rất lớn mỗi năm. Theo số liệu thống kê năm 2016, sản lượng thịt trâu đạt 86,6 nghìn tấn, thịt bò 308,6 nghìn tấn, thịt heo 3,7 triệu tấn và thịt gia cầm đạt 961,6 nghìn tấn; cả nước có trên 28.000 điểm giết mổ (Cục Thú y, 2016), phần lớn hoạt động ở quy mô phân tán, nhỏ lẻ. Lông gia súc chiếm khoảng 0,5 - 0,8% khối lượng cơ thể heo, trong khi lông gia cầm chiếm từ 4,6 - 5,2% đến 5 - 7% khối lượng sống của gà (Nguyễn Nhựt Xuân Dung và ctv., 2015; Onifade et al., 1998). Thành phần chính của lông chứa trên 90 - 92% protein dạng keratin với mạng lưới liên kết disulfide (-S-S-) bền vững, khó phân hủy tự nhiên.

Các biện pháp xử lý truyền thống như chôn lấp, đốt gây ô nhiễm đất, nguồn nước ngầm và không khí. Việc xử lý bằng hóa lý (thủy phân nhiệt áp suất cao, acid hoặc kiềm) làm phá hủy các acid amin thiết yếu nhạy cảm với nhiệt (methionine, lysine, histidine, tryptophan), tiêu tốn năng lượng và tạo ra sản phẩm phụ không mong muốn như lanthionine, lysinoalanine. Hướng xử lý sinh học bằng vi sinh vật tiết enzyme keratinase cho phép tái chế nguồn phế phẩm này thành thức ăn bổ sung giàu protein. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam chủ yếu khảo sát sơ bộ ở phía Bắc, chưa có công trình nào nghiên cứu hệ thống từ phân lập, tuyển chọn, định danh, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy đến thử nghiệm chế biến và nuôi dưỡng động vật thực tế tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL).

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học (mã số: 62 42 01 07) của nghiên cứu sinh Quách Thị Thanh Tâm, thực hiện tại Trường Đại học Cần Thơ dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Bùi Thị Minh Diệu và PGS.TS. Nguyễn Nhựt Xuân Dung, giải quyết khoảng trống nghiên cứu này thông qua 3 mục tiêu cụ thể:

1. Tuyển chọn và định danh được một số chủng vi khuẩn từ các cơ sở giết mổ gia súc, gia cầm của vùng ĐBSCL có khả năng phân hủy hiệu quả lông gia súc, gia cầm.
2. Thiết kế được quy trình nuôi cấy thích hợp cho một số chủng vi khuẩn được tuyển chọn có khả năng phân giải keratin mạnh.
3. Ứng dụng chủng vi khuẩn được tuyển chọn để xử lý nguồn chất thải lông gia cầm nhằm tạo thành thức ăn bổ sung protein cho ngành chăn nuôi.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án được xác định rõ:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn hiếu khí và chịu nhiệt bản địa có hoạt tính keratinase; chất thải lông gia cầm (lông gà), lông gia súc (lông heo); sản phẩm bột lông sinh học và đối tượng động vật thử nghiệm là gà ta Gò Công thả vườn.
• Phạm vi không gian: Khảo sát thực trạng và thu thập mẫu môi trường (đất, nước thải, lông) tại các lò giết mổ và trại chăn nuôi thuộc 3 địa phương trọng điểm vùng ĐBSCL gồm thành phố Cần Thơ, tỉnh Vĩnh Long và tỉnh Đồng Tháp. Các thí nghiệm phân lập, sinh học phân tử và phân tích hóa sinh thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học cùng Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng - Trường Đại học Cần Thơ.
• Phạm vi thời gian: Toàn bộ dữ liệu thực nghiệm được triển khai và hoàn thành trong hơn 3 năm nghiên cứu (nghiệm thu năm 2017).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng thuật hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến cấu trúc keratin, cơ chế phân giải của enzyme keratinase và các nhóm vi sinh vật có hoạt tính phân giải keratin:

• Cấu trúc keratin và cơ chế phân giải: Keratin thuộc nhóm protein sợi, chia thành $\alpha$-keratin (chủ yếu ở tóc, móng, sừng động vật có vú, cấu trúc xoắn) và $\beta$-keratin (ở lông, mỏ, móng vuốt chim, bò sát, cấu trúc phiến gấp liên kết chéo qua cầu nối disulfide) (Akhtar and Edwards, 1997; Voet and Voet, 1995). Cơ chế phân giải keratin sinh học bao gồm hai tiến trình phối hợp: tiến trình phân giải sulfit (sulfitolytic) phá vỡ các liên kết disulfide nhờ disulfide reductase hoặc hoạt động khử của màng tế bào, kết hợp với tiến trình phân giải protein (proteolytic) cắt mạch polypeptide của enzyme ngoại bào keratinase (EC 3.4.21/24/99) (Böckle and Müller, 1997; Gupta and Ramnani, 2006).
• Vi sinh vật phân giải keratin trên thế giới:
  • Nấm và xạ khuẩn: Khả năng phân hủy keratin được ghi nhận ở nấm Aspergillus fumigatus, A. flavus (Santos et al., 1996), Chrysosporium keratinophilum (Dozie et al., 1994), Chrysosporium asperatum (Sanghvi et al., 2011). Nhóm xạ khuẩn gồm Streptomyces pactum DSM 40530 (Böckle et al., 1995), Streptomyces albidoflavus SK 1-02 (Chitte et al., 1999; Bressollier et al., 1999), Streptomyces albus (Nayaka et al., 2013), Streptomyces cereus 594 (De Azeredo et al., 2006), S. cereus MA 18 (Panchanathan et al., 2014), Microbispora aerata (Gushterova et al., 2005).
  • Vi khuẩn: Chi Bacillus chiếm ưu thế lớn với các loài Bacillus licheniformis PWD-1 (Williams et al., 1990; Lin et al., 1995), B. subtilis KS1 (Suh and Lee, 2001), B. licheniformis K-508 (Manczinger et al., 2003), B. licheniformis RG1 (Ramnani and Gupta, 2004), B. megaterium SN1, B. thuringiensis SN2, B. pumilus SN3 (Agrahari and Wadhwa, 2010), B. megaterium F7-1 (Geun-Tae Park et al., 2009). Ngoài ra, các chi vi khuẩn khác gồm Chryseobacterium sp. kr6 (Riffel and Brandelli, 2002), Fervidobacterium islandicum AW-1 (Nam et al., 2002; Yong-Jik Lee et al., 2015), Fervidobacterium pennivorans (Friedrich and Antranikian, 1996), Kocuria rosea (Bernal et al., 2006), Microbacterium arborescens kr10 (Thys et al., 2004), Vibrio sp. (Sangali and Brandelli, 2000).
• Nghiên cứu trong nước: Nguyễn Đình Quyến và Trần Thị Lan Phương (2001) phân lập được 7 chủng xạ khuẩn và 15 chủng Bacillus có khả năng phân hủy lông gà từ đất cơ sở giết mổ; Nguyễn Huy Hoàng và ctv. (2010) phân lập các chủng Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Chryseobacterium spp. tại một số vùng đất phía Bắc; Nguyễn Thu Hiền và ctv. (2010, 2013) phân lập vi khuẩn Chryseobacterium phân giải lông vũ.
• Vị trí của luận án: Kế thừa các thành tựu về enzymology và sinh lý vi sinh vật, luận án định vị là công trình đầu tiên tại vùng ĐBSCL tiến hành phân lập quy mô lớn (429 chủng vi khuẩn hiếu khí và chịu nhiệt), xây dựng bộ tiêu chí sàng lọc kép (hoạt tính azokeratinase và tỷ lệ phân hủy bột lông thực tế), định danh đa tầng kết hợp Bergey và giải trình tự gen 16S rRNA, khảo sát toàn diện các yếu tố ảnh hưởng nuôi cấy và trực tiếp tạo ra chế phẩm bột lông sinh học ứng dụng vào khẩu phần ăn của gà ta thả vườn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp phương pháp nghiên cứu định lượng phòng thí nghiệm (in vitro) và thử nghiệm sinh học trên gia cầm (in vivo), dựa trên khung phân tích đa ngành giữa Vi sinh vật học, Sinh học phân tử và Dinh dưỡng vật nuôi.

Nội dung nghiên cứu	Nguồn mẫu / Dữ liệu	Phương pháp, công cụ và kỹ thuật phân tích
Nội dung 1: Khảo sát hiện trạng chất thải	42 cơ sở giết mổ gia súc, gia cầm tại Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp	Điều tra khảo sát bằng phiếu phỏng vấn chuẩn hóa; thống kê mô tả công suất giết mổ và phương thức xử lý chất thải lông.
Nội dung 2: Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn	198 mẫu (đất, nước thải, lông gia súc, lông gia cầm) thu từ lò mổ và trại chăn nuôi	- Cấy phân lập trên môi trường chọn lọc chứa bột lông là nguồn C và N duy nhất (MT1, MT3) và môi trường tăng sinh (MT2, MT4). - Kiểm tra chịu nhiệt ở 45°C, 50°C, 55°C. - Định lượng hoạt tính keratinase bằng phản ứng quang phổ với cơ chất azokeratin (đo mật độ quang OD). - Xác định tỷ lệ phân hủy khối lượng bột lông sau 1 tuần nuôi lắc ở 37°C hoặc 45 - 55°C. - Phân loại hình thái, nhuộm Gram, thử nghiệm hóa sinh theo khóa phân loại Bergey (35 nhóm). - Tách chiết DNA bằng CTAB, kiểm tra độ tinh sạch OD260/OD280, khuếch đại gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR, điện di gel agarose, giải trình tự nucleotide và phân tích cây phát sinh loài (BLAST, NCBI).
Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng nuôi cấy	2 chủng vi khuẩn phân giải mạnh nhất (B. megaterium K79 và B. parabrevis Kr110)	Thí nghiệm nhân tố khảo sát: - Nhiệt độ (30°C, 35°C, 40°C) và pH (6,0; 7,0; 8,0; 9,0). - Nồng độ dịch vi khuẩn đưa vào (2%, 5%, 10%). - Nguồn dinh dưỡng carbon (glucose, maltose, sucrose, lactose, fructose, galactose, tinh bột, rỉ đường...) và nitơ bổ sung (peptone, yeast extract, casein, beef extract, urea, muối ammonium...). - Đánh giá mật số vi khuẩn (CFU/mL), tỷ lệ hao hụt lông và hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Bradford/Lowry); theo dõi phân hủy sợi lông nguyên từ 1 đến 10 tuần.
Nội dung 4: Chế biến bột lông và nuôi dưỡng gia cầm	Chủng B. megaterium K79, lông gia cầm ủ 10 tuần, đàn gà ta Gò Công (5 - 14 tuần tuổi)	- Kiểm tra an toàn vi sinh vật: định lượng Salmonella, Coliforms, E. coli theo TCVN 7136:2002 và Thông tư 14/2011/TT-BNNPTNT. - Phân tích hóa học thành phần bột lông sinh học: vật chất khô, protein thô, mỡ thô, xơ thô, khoáng tổng số, giá trị năng lượng ME và thành phần acid amin. - Thí nghiệm nuôi gà bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn với các mức bổ sung bột lông sinh học (0% - đối chứng, 2%, 5%, 8%); theo dõi tăng trọng, lượng thức ăn tiêu thụ, hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR), tỷ lệ nuôi sống và giải phẫu đánh giá tỷ lệ thân thịt.

Dữ liệu định lượng từ các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phân tích phương sai (ANOVA), so sánh trung bình nghiệm thức theo phép thử Duncan hoặc Tukey; số liệu tỷ lệ phần trăm được chuyển đổi dạng góc arcsin trước khi phân tích thống kê.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương này nêu rõ bối cảnh thực tiễn của ngành chăn nuôi tại Việt Nam và vùng ĐBSCL, nhấn mạnh vấn đề ô nhiễm môi trường do chất thải lông keratin từ các điểm giết mổ gia súc, gia cầm. Tác giả chỉ ra nhược điểm của các phương pháp xử lý vật lý, hóa học hiện hành và sự cấp thiết của việc nghiên cứu phân giải sinh học. Chương 1 xác lập 3 mục tiêu cụ thể, 4 nội dung nghiên cứu chính cùng 7 luận điểm đóng góp mới về mặt lý luận và ứng dụng thực tiễn của đề tài.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả trình bày tổng hợp 9 nội dung chuyên đề:

• Đặc tính hóa học và cấu trúc không gian bậc hai của $\alpha$-keratin và $\beta$-keratin;
• Bản chất enzyme keratinase và cơ chế xúc tác phân cắt cầu nối disulfide kết hợp thủy phân chuỗi peptide;
• Tổng quan các chủng vi sinh vật phân giải keratin (nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn) trên thế giới và trong nước;
• Động học và các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng, sinh tổng hợp keratinase (nguồn carbon, nitơ, nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy);
• Cơ sở sinh lý dinh dưỡng gia cầm: nhu cầu protein thô, cân đối 10 acid amin thiết yếu (đặc biệt là methionine và lysine), nhu cầu năng lượng trao đổi (ME), vai trò của chất xơ;
• Tiềm năng dinh dưỡng và hệ số tiêu hóa của bột lông vũ sau xử lý sinh học so với các nguồn thức ăn truyền thống.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 trình bày chi tiết sơ đồ khối quy trình nghiên cứu, danh mục hóa chất, môi trường dinh dưỡng (MT1, MT2, MT3, MT4), thiết bị và quy trình thực hiện cho 12 thí nghiệm tương ứng với 4 nội dung:

• Quy trình điều tra 42 cơ sở giết mổ tại Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp;
• Phương pháp phân lập từ 198 mẫu môi trường;
• Kỹ thuật xác định hoạt tính enzyme trên azokeratin và tỷ lệ hao hụt cơ chất lông;
• Khóa định danh Bergey kết hợp kỹ thuật PCR khuếch đại gen 16S rRNA và giải trình tự phân tử;
• Phương pháp bố trí thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho 2 chủng vi khuẩn đại diện;
• Quy trình ủ lông gia cầm 10 tuần bằng chủng Bacillus megaterium K79, phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật gây hại, phân tích thành phần dưỡng chất và thiết kế khẩu phần nuôi thử nghiệm gà ta Gò Công từ 5 đến 14 tuần tuổi.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 cung cấp hệ thống số liệu thực nghiệm chi tiết qua 4 nội dung nghiên cứu:

1. Hiện trạng chất thải lông tại ĐBSCL: Khảo sát tại 3 địa phương cho thấy các cơ sở giết mổ gia súc, gia cầm có công suất dao động lớn nhưng hầu hết đều chưa có hệ thống xử lý lông chuyên biệt; chất thải lông chủ yếu bị thải trực tiếp ra bãi rác, chôn lấp tạm thời hoặc đốt thủ công, gây quá tải môi trường.
2. Kết quả phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn:
   • Phân lập thành công 429 chủng vi khuẩn hiếu khí bản địa có khả năng phân giải keratin:
     • 115 chủng phân giải lông gia cầm (phân lập từ 42 mẫu đất, nước, lông gia cầm), làm giảm khối lượng bột lông gà từ 20,87% đến 84,31% sau 1 tuần nuôi lắc ở 37°C.
     • 225 chủng phân giải lông gia súc (phân lập từ 126 mẫu), làm giảm khối lượng bột lông heo từ 6,27% đến 63,38% sau 1 tuần nuôi lắc ở 37°C.
     • 89 chủng chịu nhiệt (phân lập từ 30 mẫu), làm giảm khối lượng bột lông gia cầm từ 7,54% đến 66,66% ở 45°C; trong đó có 18 chủng hoạt động ở 50°C và 7 chủng hoạt động ở 55°C.
   • Tuyển chọn 26 chủng vi khuẩn có hoạt lực phân giải keratin mạnh nhất để định danh sinh hóa theo Bergey và giải trình tự gen 16S rRNA:
     • Phân loại học: Lớp Bacilli chiếm ưu thế lớn nhất (73,08%), tiếp theo là lớp Gammaproteobacteria (15,38%), lớp Flavobacteriia (7,69%) và lớp Betaproteobacteria (3,85%).
     • Cây phát sinh loài xác lập mối tương quan di truyền tin cậy giữa các chủng bản địa và dữ liệu GenBank (NCBI).
     • Hai chủng đạt hiệu suất phân giải cao nhất được lựa chọn nghiên cứu chuyên sâu là Bacillus megaterium K79 (phân hủy lông gia cầm mạnh nhất) và Brevibacillus parabrevis Kr110 (phân hủy lông gia súc mạnh nhất).

Thông số nuôi cấy	Chủng Bacillus megaterium K79 (Lông gia cầm)	Chủng Brevibacillus parabrevis Kr110 (Lông heo)
Nhiệt độ tối ưu	35°C	35°C
pH tối ưu	8,0	8,0
Nồng độ dịch vi khuẩn đưa vào	10%	10%
Nguồn dinh dưỡng tối ưu	Bột lông gia cầm là nguồn C và N duy nhất	Bột lông heo là nguồn C và N duy nhất
Phân hủy sợi lông nguyên (10 tuần)	100%	38,5%

3. Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu: Cả hai chủng K79 và Kr110 đều phát triển và phân hủy cơ chất tốt nhất ở 35°C, pH 8,0 với tỷ lệ tiếp giống 10%. Việc bổ sung các nguồn đường đơn hoặc nguồn nitơ ngoại lai không làm tăng hiệu suất phân giải so với việc sử dụng trực tiếp cơ chất lông vũ làm nguồn carbon và nitơ duy nhất. Sau 10 tuần ủ, chủng K79 phân hủy hoàn toàn 100% sợi lông gà nguyên, trong khi chủng Kr110 phân hủy 38,5% sợi lông heo nguyên vẹn.
4. Ứng dụng sản xuất bột lông sinh học và thử nghiệm nuôi gà:
   • Chủng Bacillus megaterium K79 được khẳng định tính an toàn sinh học.
   • Bột lông sinh học thu được sau 10 tuần ủ đạt tiêu chuẩn an toàn vi sinh: không phát hiện Salmonella, mật số Coliforms và E. coli nằm trong giới hạn cho phép theo TCVN 7136:2002 và Thông tư 14/2011/TT-BNNPTNT.
   • Bột lông sinh học chứa hàm lượng protein thô cao, giàu acid amin và có tỷ lệ tiêu hóa protein vượt trội so với bột lông thủy phân nhiệt cơ học thông thường.
   • Thử nghiệm nuôi dưỡng gà ta Gò Công thả vườn từ 5 đến 14 tuần tuổi với các mức bổ sung 2%, 5%, 8% bột lông sinh học cho thấy: nghiệm thức bổ sung 5% bột lông sinh học cho kết quả tối ưu nhất, gà đạt tốc độ tăng trọng tốt, tỷ lệ nuôi sống đạt 100%, các chỉ tiêu thân thịt (tỷ lệ thịt xẻ, thịt đùi, thịt ức) tương đương với nghiệm thức đối chứng sử dụng thức ăn thương mại.

Chương 5: Kết luận và đề nghị

Chương cuối cùng tổng hợp các kết luận khoa học rút ra từ 4 nội dung nghiên cứu, khẳng định tiềm năng ứng dụng thực tiễn của tập đoàn vi khuẩn bản địa và đề xuất các hướng nghiên cứu mở rộng trong tương lai.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Tính hệ thống và bao quát tại địa bàn nghiên cứu: Đây là công trình nghiên cứu hệ thống đầu tiên tại khu vực ĐBSCL về vi khuẩn phân giải keratin từ phế phẩm lông gia súc, gia cầm, bao gồm đầy đủ các khâu từ điều tra hiện trạng, phân lập, sàng lọc, tuyển chọn, định danh, khảo sát điều kiện nuôi cấy đến thử nghiệm ứng dụng thực tế trên gia cầm.
2. Quy trình phân lập và sàng lọc hiệu quả: Ứng dụng thành công quy trình phân lập dựa trên đặc tính trao đổi chất đặc biệt của vi khuẩn trên môi trường chọn lọc chứa bột lông là nguồn carbon và nitơ duy nhất, kết hợp đánh giá song song hoạt tính azokeratinase và tỷ lệ hao hụt cơ chất thực tế.
3. Bổ sung nguồn gen vi sinh vật hữu ích: Phân lập được 429 chủng vi khuẩn bản địa; tuyển chọn và định danh chính xác 26 chủng có hoạt lực mạnh, bổ sung vào bộ giống vi sinh vật hữu ích của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ.
4. Xác lập thông số tối ưu cho 2 chủng vi khuẩn vượt trội: Xác định được các điều kiện sinh trưởng và phân hủy tối ưu cho chủng Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110 ở điều kiện nhiệt độ 35°C, pH 8,0 và tỷ lệ cấy giống 10%.
5. Hoàn thiện quy trình công nghệ ủ lông sinh học: Xây dựng quy trình ủ lông gia cầm bằng chủng Bacillus megaterium K79 trong 10 tuần, đạt tỷ lệ phân hủy 100% sợi lông nguyên, tạo ra sản phẩm bột lông sinh học đạt tiêu chuẩn an toàn vi sinh vật.
6. Giá trị ứng dụng trong chăn nuôi gia cầm: Chứng minh hiệu quả thực tế của việc sử dụng bột lông sinh học thay thế một phần nguồn đạm trong khẩu phần ăn của gà ta thả vườn ở mức bổ sung 5%, giúp đàn gà tăng trưởng tốt, tỷ lệ sống đạt 100% và chất lượng thân thịt tương đương đối chứng.
7. Cung cấp tư liệu khoa học và đào tạo: Cung cấp nguồn dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác phục vụ công tác giảng dạy, biên soạn giáo trình chuyên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học và Chăn nuôi.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất bột lông sinh học ở quy mô bán công nghiệp và công nghiệp nhằm đáp ứng nhu cầu thực tế của các nhà máy sản xuất thức ăn chăn nuôi.
• Tiếp tục nghiên cứu các giải pháp kỹ thuật (như tiền xử lý cơ học, phối hợp tổ hợp vi sinh vật hoặc enzyme) nhằm rút ngắn thời gian nuôi ủ phân hủy lông nguyên vẹn xuống dưới 10 tuần.
• Mở rộng khảo sát và ứng dụng chủng Brevibacillus parabrevis Kr110 trong xử lý lông heo và các cơ chất keratin khó phân hủy khác tại các lò mổ gia súc tập trung.
• Triển khai mô hình xử lý chất thải lông tại chỗ bằng chế phẩm vi sinh vật bản địa cho các cơ sở giết mổ quy mô vừa và nhỏ tại ĐBSCL.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Thời gian ủ phân hủy sợi lông nguyên còn tương đối dài (10 tuần đối với lông gà để đạt 100%; chủng Kr110 trên lông heo mới đạt 38,5% sau 10 tuần).
  • Thử nghiệm nuôi dưỡng in vivo mới dừng lại ở quy mô thử nghiệm trên giống gà ta Gò Công thả vườn, chưa tiến hành thử nghiệm trên gà thịt công nghiệp quy mô trang trại lớn hoặc các loài thủy sản, gia súc khác.
  • Luận án tập trung chủ yếu vào nhóm vi khuẩn hiếu khí và chịu nhiệt, chưa đánh giá sâu hoạt tính của các nhóm vi sinh vật kỵ khí hoặc xạ khuẩn trong cùng mẫu môi trường.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Tinh sạch và nghiên cứu cấu trúc, đặc tính phân tử của enzyme keratinase ngoại bào sinh ra từ hai chủng B. megaterium K79 và B. parabrevis Kr110.
  • Tối ưu hóa môi trường lên men bán rắn để tăng mật số vi khuẩn và rút ngắn chu kỳ phân hủy lông.
  • Khảo sát mở rộng khả năng bổ sung bột lông sinh học vào khẩu phần ăn của các đối tượng vật nuôi khác (như cá tra, tôm, heo thịt).

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn cao:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học, Khoa học Môi trường và Chăn nuôi - Dinh dưỡng vật nuôi: tham khảo phương pháp phân lập vi khuẩn trên cơ chất chọn lọc, quy trình đo hoạt tính azokeratinase, kỹ thuật định danh vi khuẩn theo Bergey kết hợp giải trình tự 16S rRNA và thiết kế khẩu phần dinh dưỡng thử nghiệm in vivo.
• Giảng viên và cán bộ nghiên cứu: sử dụng làm tài liệu giảng dạy cho các học phần Vi sinh vật ứng dụng, Công nghệ enzyme, Xử lý sinh học chất thải nông nghiệp và Dinh dưỡng gia cầm.
• Doanh nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi và nhà quản lý môi trường: tham khảo quy trình kỹ thuật ủ bột lông sinh học an toàn làm nguồn đạm thay thế, đồng thời áp dụng giải pháp vi sinh xử lý ô nhiễm chất thải keratin tại các cơ sở giết mổ gia súc, gia cầm vùng ĐBSCL.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phân lập được bao nhiêu chủng vi khuẩn phân giải keratin và tỷ lệ phân bố theo nguồn mẫu như thế nào?
Luận án đã phân lập được tổng cộng 429 chủng vi khuẩn hiếu khí bản địa có khả năng phân giải keratin từ 198 mẫu môi trường tại Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp. Trong đó gồm: 115 chủng phân giải lông gia cầm (từ 42 mẫu đất, nước, lông gia cầm), 225 chủng phân giải lông gia súc (từ 126 mẫu đất, nước, lông heo) và 89 chủng vi khuẩn chịu nhiệt (từ 30 mẫu đất và nước thải cơ sở giết mổ, trại chăn nuôi gia cầm).

2. Hai chủng vi khuẩn nào có hoạt tính phân giải keratin mạnh nhất và kết quả định danh loài của chúng là gì?
Qua quá trình tuyển chọn từ 26 chủng vi khuẩn mạnh nhất, luận án đã xác định được 2 chủng vi khuẩn bản địa có hiệu lực phân hủy vượt trội: chủng Bacillus megaterium K79 (phân hủy lông gia cầm mạnh nhất) và chủng Brevibacillus parabrevis Kr110 (phân hủy lông gia súc mạnh nhất). Cả hai chủng đều được định danh chính xác bằng đặc điểm sinh hóa theo hệ thống Bergey kết hợp giải trình tự gen 16S rRNA.

3. Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho hai chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110 là gì?
Kết quả khảo sát đa yếu tố cho thấy cả hai chủng K79 và Kr110 đạt sinh trưởng, mật số tế bào và hiệu suất phân hủy bột lông cao nhất trong môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 35°C, pH 8,0, nồng độ dịch tiếp giống vi khuẩn đưa vào là 10%, và sử dụng chính bột lông làm nguồn cơ chất dinh dưỡng carbon và nitơ duy nhất mà không cần bổ sung đường đơn hay nguồn nitơ ngoại lai.

4. Hiệu suất phân hủy sợi lông nguyên vẹn của hai chủng K79 và Kr110 sau 10 tuần ủ đạt mức bao nhiêu?
Khi tiến hành nuôi ủ sợi lông nguyên vẹn trong thời gian 10 tuần, chủng Bacillus megaterium K79 đạt hiệu suất phân hủy hoàn toàn 100% sợi lông gia cầm nguyên; trong khi chủng Brevibacillus parabrevis Kr110 đạt tỷ lệ phân hủy 38,5% sợi lông heo nguyên vẹn.

5. Khi ứng dụng bột lông sinh học vào khẩu phần ăn của gà ta Gò Công thả vườn, mức bổ sung nào cho hiệu quả tốt nhất và kết quả đạt được ra sao?
Mức bổ sung 5% bột lông sinh học (chế biến từ lông gà ủ bằng chủng K79 trong 10 tuần) vào khẩu phần thức ăn mang lại hiệu quả cao nhất: đàn gà tăng trưởng tốt, tỷ lệ nuôi sống đạt 100%, các chỉ tiêu sinh trưởng và chất lượng thân thịt (tỷ lệ thịt xẻ, thịt đùi, thịt ức) đạt mức tương đương so với nghiệm thức đối chứng sử dụng thức ăn thương mại, đồng thời đảm bảo an toàn vệ sinh thú y (không nhiễm Salmonella, mật số Coliforms và E. coli đạt chuẩn).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Quách Thị Thanh Tâm đã giải quyết trọn vẹn vấn đề phân lập, tuyển chọn, định danh và ứng dụng các chủng vi khuẩn bản địa phân giải keratin tại vùng ĐBSCL. Công trình đã xác định được hai chủng vi khuẩn ưu việt là Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110, thiết lập các thông số môi trường nuôi cấy tối ưu (35°C, pH 8,0, tỷ lệ cấy giống 10%) và chứng minh hiệu quả phân hủy hoàn toàn sợi lông gia cầm sau 10 tuần ủ. Sản phẩm bột lông sinh học tạo ra đạt tiêu chuẩn an toàn vi sinh và được ứng dụng thành công ở mức 5% trong khẩu phần nuôi dưỡng gà ta Gò Công thả vườn. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và giải pháp công nghệ sinh học thiết thực, vừa xử lý triệt để ô nhiễm chất thải lông tại các cơ sở giết mổ, vừa tạo ra nguồn thức ăn bổ sung protein có giá trị dinh dưỡng cao cho ngành chăn nuôi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ QUÁCH TH TH NH T M PH N LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN PH N GIẢI KER TIN TRONG CHĂN NUÔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 CHUYÊN ĐỀ NGHIÊN CỨU SINH HÂN CẦN THƠ, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ QUÁCH TH TH NH T M PH N LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN PH N GIẢI KER TIN TRONG CHĂN NUÔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 CHUYÊN ĐỀ NGHIÊN CỨU SINH NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHO HỌC TS B I TH MINH DI U PGS TS NGUYỄN NH T U N DUNG CẦN THƠ - 2017 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨ VI T NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án này đƣợc hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chƣa đƣợc dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác. Cần Thơ, ngày tháng năm 2017 Nghiên cứu sinh thực hiện Quách Th Thanh T mKER TIN TỪ CHẤT NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHO HỌC 1 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHO HỌC 2SÖC - GI CẦ TS B I TH MINH DI UM PGS.TS NGUYỄN NH T U N DUNG i LỜI CÁM ƠN Với tất cả lòng biết ơn s u sắc, tôi xin ch n thành cám ơn TS i Th Minh iệu và PGS. Nguy n Nhựt Xu n ung đã tận tình hƣớng dẫn và giúp tôi hoàn thành luận án này ô là ngƣời truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và thổi lên ngọn lửa đam mê khoa học, khơi dậy trong tôi sự nỗ lực, tự tin, cố gắng không ngừng và không nản lòng trƣớc những khó khăn trong suốt tiến trình thực hiện luận án tiến sĩ Xin cám ơn Cô đã dành nhiều thời gian, công sức và luôn giúp tôi có đƣợc ngh lực và đ nh hƣớng đúng đắn trong học tập và nghiên cứu Tiến trình hơn 3 năm thực hiện các thí nghiệm trong luận án, tôi đã luôn đƣợc sự quan t m, hỗ trợ của an lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển ông nghệ Sinh học-trƣờng Đại học ần Thơ, quý Thầy ô Viện Nghiên cứu và Phát triển ông nghệ Sinh học, quý Thầy ô Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Đại học ần Thơ, đã giúp tôi có thêm nhiều ngh lực để hoàn thành nội dung nghiên cứu Xin cám ơn: án bộ phòng Thí nghiệm chuyên s u, phòng thí nghiệm Sinh học ph n tử Viện Nghiên cứu và Phát triển ông nghệ sinh học-Trƣờng Đại học ần Thơ đã hỗ trợ tôi thực hiện nội dung nghiên cứu ạn Kim Ngọc, các bạn Nghiên cứu sinh, học viên ao học và các em Sinh viên đã đồng hành c ng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu; đã chia s những khó khăn và khuyến khích, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu uối c ng, xin đƣợc gởi lời biết ơn đến Trƣờng ao đ ng ộng Đồng Vĩnh Long đã sắp xếp công việc và tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi hoàn thành kế hoạch học tập toàn khóa trong chƣơng trình đào tạo tiến sĩ h n thành cám ơn ii TÓM LƢỢC L ng gi s gia cầm là phế phẩm đượ t o r với khối lượng lớn từ hăn nu i và giết mổ gi s gia cầm. Với thành phần chính là keratin (90%), lông khó phân hủy và gây ảnh hưởng xấu đến m i trường.

Sử dụng vi huẩn để phân hủy nguồn chất thải này đ ng là hướng đi mới, vừa có thể giải quyết vấn đề ô nhiễm m i trường l i vừa tận dụng sản phẩm để bổ sung vào thứ ăn hăn nu i ho làm ph n n sinh h Luận án bao gồm 4 nội dung với 12 thí nghiệm nhằm phân lập, tuyển ch n, định danh và khảo sát á điều kiện nuôi cấy phù hợp của các hủng vi khuẩn có khả năng ph n hủy hất thải l ng gi s gi ầm hiệu quả cao, từ đ ứng ụng ủ lông gia cầm với chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 thành bột lông sinh h c dùng nuôi gà thả vườn. Tổng cộng có 429 chủng vi khuẩn hiếu khí bản địa phân hủy chất thải l ng được phân lập. Trong đ 115 hủng vi huẩn phân giải er tin được phân lập trên m i trường với bột lông gia cầm đượ ùng như nguồn carbon và nitơ uy nhất từ 42 mẫu (đất, nước và lông gia cầm) thu ở á ơ sở giết mổ gi ầm thuộc thành phố Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp; 225 hủng vi huẩn ng đượ ph n lập từ 126 mẫu (đất, nướ và l ng heo ở á ơ sở giết mổ gi s Đ c biệt 89 chủng vi khuẩn hịu nhiệt hiếu h hả năng ph n hủy l ng gi ầm ng được phân lập từ 23 mẫu đất và 7 mẫu nước thu t i ơ sở giết mổ và tr i hăn nu i gi ầm ở Vĩnh Long và Đồng Tháp Các hủng vi huẩn phân lập đượ đều thể hiện ho t t nh er tin se trên ơ hất azokeratin. Kết quả ph n t h hả năng ph n hủy ột l ng ho thấy 115 hủng vi huẩn ph n hủy ột l ng gi ầm đ làm giảm hối lượng ột l ng gi ầm từ 20,87% đến 84,31% s u một tuần lắ ủ ở 37o ; 225 hủng vi huẩn ph n hủy l ng heo đ làm giảm hối lượng ột l ng heo từ 6,27% đến 63,38% và 89 hủng vi huẩn hịu nhiệt ng làm giảm hối lượng ột l ng gi ầm từ 7,54% đến 66,66% Trong 429 hủng vi huẩn này, 26 hủng vi huẩn hả năng ph n hủy l ng gi s , gi ầm hiệu quả nhất đượ tuyển h n và định nh theo hệ thống ph n lo i ergey ết hợp với giải tr nh t đo n gen 16S rRN y phát sinh loài đượ v từ á tr nh t đo n gen 16S rRN ủ 26 hủng vi huẩn đượ tuyển h n đ thể hiện mối liên hệ i truyền gi h ng Ngoài r , ết quả n ho thấy phần lớn vi huẩn đượ tuyển h n thuộ lớp Bacilli (73,08% , á hủng vi huẩn n l i thuộ lớp et proteo teri (3,85% , lớp l vo teri (7,69% và lớp mm proteo teri (15,38% iii hủng vi huẩn illus meg terium K79 ph n hủy l ng gi ầm tốt nhất và hủng vi huẩn revi illus p r revis Kr110 ph n hủy l ng gi s tốt nhất đượ tuyển h n để tiếp tụ nghiên ứu về m i trường nu i ấy Kết quả nghiên ứu ho thấy hả năng ph n hủy ột l ng gi ầm ủ illus megaterium K79 và hả năng ph n hủy ột l ng heo ủ revi illus p r revis Kr110 ùng đ t hiệu quả o nhất trong m i trường nu i ấy nhiệt độ 35o và p 8,0 với nồng độ ị h vi huẩn đư vào 10% và h ột l ng là nguồn inh ư ng hứ r on và nitơ Thời gi n nu i ủ sợi l ng gi ầm nguyên với illus meg terium K79 trong 10 tuần ho ết quả ph n hủy là 100% và thời gi n nu i ủ sợi l ng heo nguyên với revi illus p r revis Kr110 trong 10 tuần ho hiệu suất ph n hủy là 38,5% Trong th nghiệm nu i gà, hủng vi huẩn illus meg terium K79 đượ ứng ụng để ủ l ng gi ầm trong 10 tuần đ t o đượ ột l ng sinh h đ t mứ n toàn vi sinh và đượ ùng như nguồn th liệu ung ấp đ m trong hẩu phần với mứ 2%, 5%, 8% ùng nu i ư ng gà thả vườn thành ng Với mứ ổ sung 5% ột l ng sinh h vào hẩu phần đ gi p gà sinh trưởng tốt, t lệ nu i sống o (100% với á h tiêu sinh trưởng và á h tiêu th n thịt tốt đ t tương đương với nghiệm thứ đối hứng T m l i, vi huẩn ph n giải er tin ản đị trong nghiên ứu này có tiềm năng ứng ụng th tế nhờ đáp ứng tốt 3 yêu ầu qu n tr ng: gi p xử lý nguồn nhiễm m i trường từ phế phẩm l ng gi s , gi ầm; gi p tái hế iến nguồn phế phẩm này thành thứ ăn ổ sung protein với giá trị inh ư ng và hả năng tiêu h o cho vật nu i; t o m i trường th n thiện Từ khoá: Bacillus megaterium, Brevibacillus parabrevis Kr110, bột lông sinh học, ch tiêu th n th t tốt, gà thả vƣờn, t l ph n hủy lông iv ABSTRACT Feather and cattle hair were the waste generated in large quantity from livestock and slaughterhouses.

Because their main component is keratin (90%), they are difficultly degraded and become a serious environmental pollutants. Using bacteria to decompose these wastes was a new solution to solve the environmental pollution and used the product as animal supplement feed or bio-fertilizer. This dissertation was carried out on 4 contents with 12 experiments to isolate, screen, identify and survey the suitable culture conditions of two selected keratinolytic bacteria isolates that showing the most effective capacity in feather and pig hair degradation and apply one of them for production biological feather meal as feed supplementation for raising backyard chicken. A total of 429 indigenous aerobic keratinolytic bacteria were isolated.

Specifically, 115 keratinolytic bacterial strains were isolated on agar medium with feather powder used as the sole carbon and nitrogen source from 42 samples (soil, waste water and poultry feather) collecting from the poultry slaughterhouse in Can Tho city, Vinh Long and Dong Thap; 225 keratinolytic bacterial strains were also isolated from 126 samples (soil, waste water and pig hair) collecting from the cattle slaughterhouses. Especially 89 thermophilic keratinolytic strains were isolated from 23 samples of soil, 7 waste water samples collecting from the poultry processing plants and farm in Vinh Long and Dong Thap. All isolated bacteria showed keratinase activity on azokeratin. Results of feather degrading capacity analysis showing 115 strains isolated on feather powder media reduced the feather powder from 20,87% to 84,31% after shaking incubation for a week at 37°C; 225 pig hair strains revealed decomposed capacity from 6,27% to 63,38% in pig hair powder decomposition; and 89 thermophilic strains also reduced feather powder in rating from 7.

Among these 429 keratinolytic bacteria strains, 26 isolates having the most effective degrading capacity were chosen and i entifie uil ing on ergey’s m nu l om ining 16S rRN gene sequen ing Phylogenetic tree deducing from the 16S rRNA partial gene sequences of 26 selected strains showed a genetic link between them. In addition, the identification results noticed that most belonged to Bacilli class (73,08%) and the rest strains as members of Betaproteobacteria class (3,85%), Flavobacteria class (7,69%) and Gammaproteobacteria class (15,38%).