Luận án tiến sĩ a chemical genomic approach towards determining the molecular target of anti proliferative compounds

Luận án tiến sĩ nghiên cứu a chemical genomic approach towards determining the molecular target of anti proliferative compounds, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết,

• Tác giả: Erin Eastwood
• Người hướng dẫn: Scott Schaus, Assistant Professor
• Trường học: Boston University
• Chuyên ngành: Chemistry and Pharmacology
• Đề tài: A Chemical Genomic Approach Towards Determining The Molecular Target Of Anti-Proliferative Compounds
• Loại tài liệu: dissertation
• Năm xuất bản: 2007
• Địa điểm: Dartmouth

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Hóa Học Gen Trong Xác Định Mục Tiêu Phân Tử

Xác định mục tiêu phân tử của hợp chất chống tăng sinh là một bước quan trọng trong quá trình phát triển thuốc mới. Số lượng các ứng viên thuốc tiềm năng và protein đã tăng lên đáng kể nhờ những tiến bộ trong lĩnh vực genomics, hóa học tổ hợp và sàng lọc hiệu năng cao tự động. Việc kết hợp hóa học gen và sinh học hệ thống cung cấp một giải pháp thiết thực để sàng lọc số lượng ngày càng tăng của các ứng viên thuốc và quá trình xác nhận. Trong các giai đoạn phát triển thuốc, các sản phẩm tự nhiên và phân tử nhỏ được khảo nghiệm bằng các màn hình định hướng mục tiêu dựa trên kiểu hình. Các phân tử nhỏ được tạo ra bằng cách sử dụng tổng hợp định hướng mục tiêu và tổng hợp định hướng đa dạng. Theo tài liệu, trong tổng hợp định hướng mục tiêu, các hợp chất được thiết kế bằng cách sử dụng lộ trình hồi cứu từ một mục tiêu cụ thể. Một ví dụ như vậy, các dẫn xuất bishydroquinone của sản phẩm tự nhiên, saframycin, đã được tổng hợp và sàng lọc hoạt tính chống tăng sinh đối với u hắc tố A375 và ung thư biểu mô phổi A549. Một nửa số dẫn xuất cho thấy hoạt tính cao hơn saframycin.

1.1. Giới thiệu về Hóa Học Gen và ứng dụng trong dược phẩm

Hóa học gen là một phương pháp mạnh mẽ để xác định mục tiêu phân tử của các hợp chất chống tăng sinh. Phương pháp này sử dụng các thay đổi về biểu hiện gen để suy ra cơ chế tác dụng của thuốc. Hóa học gen đang ngày càng được sử dụng trong quá trình phát triển thuốc mới, đặc biệt là trong việc xác định mục tiêu thuốc và đánh giá hoạt tính sinh học.

1.2. Vai trò của Phân tích hệ thống trong xác định mục tiêu phân tử

Phân tích hệ thống, bao gồm genomics, proteomics và metabolomics, đóng một vai trò quan trọng trong việc giải mã mục tiêu thuốc. Thông qua việc phân tích dữ liệu toàn diện, các nhà nghiên cứu có thể xác định các mạng lưới tương tác protein và các con đường tín hiệu bị ảnh hưởng bởi hợp chất chống tăng sinh, từ đó suy ra mục tiêu phân tử tiềm năng.

1.3. Mối liên hệ giữa Phenotype based screening và Target Identification

Phenotype-based screening là một phương pháp hiệu quả để xác định các hợp chất chống tăng sinh tiềm năng. Tuy nhiên, để hiểu rõ cơ chế tác dụng của các hợp chất này, cần phải xác định mục tiêu phân tử của chúng. Hóa học gen có thể được sử dụng để liên kết kiểu hình quan sát được với các thay đổi trong biểu hiện gen, từ đó giúp xác định mục tiêu thuốc.

II. Thách Thức Trong Việc Xác Định Mục Tiêu Phân Tử Của Thuốc

Mặc dù có nhiều phương pháp để xác định mục tiêu phân tử, nhưng vẫn còn nhiều thách thức. Phương pháp sắc ký ái lực đòi hỏi phải cố định hợp chất và chiết xuất phải chứa dạng hoạt động. Các phương pháp bổ sung bao gồm hiển thị biểu hiện nhân bản, hệ thống ba hybrid nấm men và microarray protein. Các phương pháp nhận dạng khác tập trung nhiều hơn vào suy luận và kiểm tra các thay đổi để làm sáng tỏ mục tiêu protein. Monastrol, một chất ức chế kinesin nguyên phân Eg5, một protein vận động cần thiết cho tính hai cực của thoi, đã được xác định bằng cách sử dụng kết hợp hai màn hình dựa trên kiểu hình. Hơn 16.000 phân tử nhỏ đã được sàng lọc trong một thử nghiệm nguyên phân toàn tế bào (Hình 1.7) và được sàng lọc để tăng cường phosphoryl hóa nucleolin. Nucleolin là một protein hạt nhân được phosphoryl hóa khi bước vào quá trình nguyên phân.

2.1. Hạn chế của phương pháp Affinity chromatography

Affinity chromatography là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để xác định mục tiêu thuốc. Tuy nhiên, phương pháp này có một số hạn chế, bao gồm yêu cầu phải gắn hợp chất vào pha tĩnh và chỉ có thể xác định các protein tương tác trực tiếp với hợp chất.

2.2. Khó khăn trong việc ứng dụng Yeast three hybrid systems

Yeast three-hybrid systems là một phương pháp dựa trên di truyền để xác định tương tác thuốc-mục tiêu. Mặc dù phương pháp này có thể xác định các tương tác gián tiếp, nhưng nó có thể bị ảnh hưởng bởi các tương tác không đặc hiệu và đòi hỏi phải có kiến thức về các protein liên quan.

2.3. Độ phức tạp của Phân tích dữ liệu lớn Big Data trong hóa học gen

Hóa học gen tạo ra một lượng lớn dữ liệu, đòi hỏi các công cụ tin sinh học mạnh mẽ để phân tích và diễn giải. Việc xử lý và phân tích dữ liệu genomics, proteomics và metabolomics đòi hỏi chuyên môn cao và cơ sở hạ tầng tính toán mạnh mẽ.

III. Phương Pháp Hóa Học Gen Dựa Trên RNAi và CRISPR

Hóa học gen sử dụng các kỹ thuật như RNAi và CRISPR để làm gián đoạn các gen cụ thể và quan sát ảnh hưởng đến kiểu hình. Phương pháp này có thể giúp xác định mục tiêu phân tử của hợp chất chống tăng sinh bằng cách xác định các gen mà việc ức chế hoặc loại bỏ sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của hợp chất. Việc sàng lọc dựa trên kiểu hình thường đòi hỏi các xét nghiệm sinh hóa bổ sung để điều tra thêm cơ chế tác dụng.

3.1. Sử dụng RNAi để xác định mục tiêu thuốc

RNAi (RNA interference) là một kỹ thuật mạnh mẽ để làm im lặng các gen cụ thể. Bằng cách sử dụng RNAi để ức chế biểu hiện của các gen khác nhau và quan sát ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất chống tăng sinh, các nhà nghiên cứu có thể xác định mục tiêu thuốc tiềm năng.

3.2. Ứng dụng công nghệ CRISPR trong hóa học gen

Công nghệ CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) cho phép chỉnh sửa gen một cách chính xác. Bằng cách sử dụng CRISPR để loại bỏ các gen cụ thể và quan sát ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất chống tăng sinh, các nhà nghiên cứu có thể xác định mục tiêu thuốc và xác định cơ chế tác dụng của thuốc.

3.3. Kết hợp RNAi và CRISPR để tăng độ chính xác trong xác định mục tiêu

Việc kết hợp RNAi và CRISPR có thể tăng độ chính xác trong việc xác định mục tiêu thuốc. RNAi có thể được sử dụng để giảm tạm thời biểu hiện của một gen, trong khi CRISPR có thể được sử dụng để loại bỏ vĩnh viễn gen đó. Bằng cách quan sát ảnh hưởng của cả hai phương pháp đến hoạt tính của hợp chất chống tăng sinh, các nhà nghiên cứu có thể có được bằng chứng mạnh mẽ về mục tiêu thuốc.

IV. Tiếp Cận Hóa Học Gen Thông Qua Phân Tích Đột Biến Gen

Phân tích đột biến gen là một phương pháp khác để xác định mục tiêu phân tử. Phương pháp này bao gồm việc phân tích các đột biến gen làm thay đổi độ nhạy cảm của tế bào đối với hợp chất chống tăng sinh. Các gen bị đột biến có thể là mục tiêu trực tiếp của hợp chất, hoặc có thể tham gia vào các con đường tín hiệu quan trọng cho hoạt động của hợp chất. Bằng cách xác định các đột biến này, các nhà nghiên cứu có thể xác định mục tiêu thuốc.

4.1. Sử dụng phân tích đột biến gen để xác định cơ chế tác dụng

Phân tích đột biến gen không chỉ giúp xác định mục tiêu thuốc mà còn có thể cung cấp thông tin về cơ chế tác dụng của hợp chất chống tăng sinh. Ví dụ, nếu một đột biến làm cho tế bào kháng với hợp chất, điều đó cho thấy gen bị đột biến đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của hợp chất.

4.2. Ưu điểm của việc phân tích các đột biến tự nhiên và gây ra

Việc phân tích cả đột biến tự nhiên và đột biến gây ra có thể cung cấp thông tin bổ sung về mục tiêu thuốc. Đột biến tự nhiên có thể cho thấy các gen mà việc đột biến sẽ làm thay đổi độ nhạy cảm của tế bào đối với hợp chất, trong khi đột biến gây ra có thể được sử dụng để xác định các gen mà việc đột biến sẽ làm cho tế bào kháng với hợp chất.

4.3. Ứng dụng tin sinh học trong phân tích kết quả đột biến gen

Tin sinh học đóng một vai trò quan trọng trong việc phân tích kết quả phân tích đột biến gen. Các công cụ tin sinh học có thể được sử dụng để xác định các gen bị đột biến, dự đoán ảnh hưởng của các đột biến đến chức năng protein và xác định các con đường tín hiệu liên quan đến mục tiêu thuốc.

V. Nghiên Cứu Borrelidin Ứng Dụng Hóa Học Gen Thực Tiễn

Trong một ứng dụng hóa học gen, một bộ sưu tập đa dạng các hợp chất tổng hợp đã được đánh giá về độc tính dựa trên tế bào. Màn hình hiển thị một tập hợp con các sulfon ức chế sự phát triển của A549, ung thư biểu mô phổi nhỏ ở người. Trong số đó, 4-(1-phenyl-1H-tetrazole-5-sulfonyl)-butyronitrile (PTSB) là hợp chất có hoạt tính mạnh nhất. PTSB đã được chứng minh là làm chậm sự phát triển của cả cerevisiae loại hoang dã và A549. Các thí nghiệm lập hồ sơ phiên mã toàn bộ gen trên cerevisiae cho thấy PTSB liên quan đến phản ứng với stress oxy hóa. Phân tích lập hồ sơ bằng cách sử dụng sinh học hệ thống dự đoán con đường thioredoxin. Các xét nghiệm sinh hóa với thioredoxin (Trx) và thioredoxin reductase (TrxR) đã xác nhận PTSB ức chế TrxR. Cấu trúc của PTSB cho thấy một cơ chế ức chế mới.

5.1. Xác định cơ chế tác dụng của Borrelidin thông qua hóa học gen

Nghiên cứu sử dụng hóa học gen để kiểm tra mục tiêu phân tử của borrelidin, một macrolide có các hoạt tính sinh học được công bố mâu thuẫn. Hồ sơ phiên mã cho thấy sự gia tăng phiên mã các gen liên quan đến sinh tổng hợp axit amin khi điều trị bằng borrelidin. Con đường GCN4 điều chỉnh sự tổng hợp axit amin chung. Sự tích tụ của tRNA không tích điện kích hoạt Gen2p, ngăn chặn sự hình thành phức hợp eIF-2. Điều này mô phỏng quá trình dịch mã của Gen4p, phiên mã quá mức các gen liên quan đến sinh tổng hợp axit amin.

5.2. Vai trò của con đường GCN4p trong tác động của Borrelidin

Các thí nghiệm sử dụng các phiên bản gen bị xóa GCN2 và GCN4 xác định con đường sinh tổng hợp axit amin borrelidin thông qua GCN4p. Hồ sơ cho thấy một cơ chế thay thế quy định dịch mã Gen4p không thông qua Gen2p, được xác nhận bằng phân tích immunoblot với các kháng thể elF2 và elF2 được phosphoryl hóa.

5.3. Kết quả phân tích hệ thống và dự đoán mục tiêu protein

Hồ sơ phiên mã cho thấy sự gia tăng phiên mã các gen liên quan đến sinh tổng hợp axit amin khi điều trị bằng borrelidin. Con đường GCN4 điều chỉnh sự tổng hợp axit amin chung. Các thí nghiệm sử dụng các phiên bản gen bị xóa GCN2 và GCN4 xác định con đường sinh tổng hợp axit amin borrelidin thông qua GCN4p. Hồ sơ cho thấy một cơ chế thay thế quy định dịch mã Gen4p không thông qua Gen2p, được xác nhận bằng phân tích immunoblot với các kháng thể elF2 và elF2 được phosphoryl hóa.

VI. Triển Vọng Phát Triển và Ứng Dụng của Hóa Học Gen

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc áp dụng hóa học gen vào giai đoạn xác nhận của quá trình khám phá thuốc. Việc tích hợp hóa học gen với các phương pháp khác, như proteomics và metabolomics, có thể cung cấp một cái nhìn toàn diện hơn về cơ chế tác dụng của hợp chất chống tăng sinh. Hơn nữa, sự phát triển của các công cụ tin sinh học tiên tiến sẽ giúp phân tích và diễn giải dữ liệu hóa học gen một cách hiệu quả hơn, từ đó đẩy nhanh quá trình khám phá và phát triển thuốc mới.

6.1. Tích hợp Hóa Học Gen với Proteomics và Metabolomics

Việc tích hợp hóa học gen với proteomics và metabolomics cho phép các nhà nghiên cứu có được một cái nhìn toàn diện hơn về tác động của hợp chất chống tăng sinh lên tế bào. Proteomics có thể xác định những thay đổi về biểu hiện protein, trong khi metabolomics có thể xác định những thay đổi về chuyển hóa. Bằng cách kết hợp dữ liệu từ các phương pháp này, các nhà nghiên cứu có thể hiểu rõ hơn về cơ chế tác dụng của hợp chất và xác định mục tiêu thuốc tiềm năng.

6.2. Tầm quan trọng của Tin Sinh Học trong phân tích dữ liệu hóa học gen

Tin sinh học đóng một vai trò quan trọng trong việc phân tích và diễn giải dữ liệu hóa học gen. Các công cụ tin sinh học có thể được sử dụng để xác định các gen và protein bị ảnh hưởng bởi hợp chất chống tăng sinh, dự đoán các tương tác thuốc-mục tiêu và xác định các con đường tín hiệu liên quan đến hoạt động của thuốc.

6.3. Ứng dụng tiềm năng của Hóa Học Gen trong phát triển thuốc ung thư

Hóa học gen có tiềm năng lớn trong việc phát triển thuốc ung thư mới. Bằng cách xác định mục tiêu phân tử của các hợp chất chống tăng sinh, các nhà nghiên cứu có thể phát triển các thuốc có tác dụng chọn lọc hơn và ít tác dụng phụ hơn. Hóa học gen cũng có thể được sử dụng để xác định các dấu ấn sinh học để dự đoán phản ứng của bệnh nhân với thuốc và phát triển các chiến lược điều trị cá nhân hóa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BOSTON UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL OF ARTS AND SCIENCES Dissertation A CHEMICAL GENOMIC APPROACH TOWARDS DETERMINING THE MOLECULAR TARGET OF ANTI-PROLIFERATIVE COMPOUNDS by ERIN L., University of Massachusetts Dartmouth, 1999 Submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy 2007 UMI Number: 3246602 Copyright 2006 by Eastwood, Erin L. All rights reserved. INFORMATION TO USERS The quality of this reproduction is dependent upon the quality of the copy submitted. Broken or indistinct print, colored or poor quality illustrations and photographs, print bleed-through, substandard margins, and improper alignment can adversely affect reproduction.

In the unlikely event that the author did not send a complete manuscript and there are missing pages, these will be noted. Also, if unauthorized copyright material had to be removed, a note will indicate the deletion. ® UMI UMI Microform 3246602 Copyright 2007 by ProQuest Information and Learning Company. All rights reserved.

This microform edition is protected against unauthorized copying under Title 17, United States Code. ProQuest Information and Learning Company 300 North Zeeb Road P. Box 1346 Ann Arbor, MI 48106-1346 © Copyright by ERIN L. EASTWOOD 2006 Approved by First Reader Soe Scott E.

Assistant Professor of Chemistry and Pharmacology Second Reader ⁄⁄⁄⁄ zZ⁄Z Mark W. Associate Professor of Chemistry and Biomedical Engineering ACKNOWLEDGEMENTS I would like to thank the Boston University Department of Chemistry and the Center for Chemical Methodology and Library Development for this opportunity and for providing financial support. Elliott, and Dr. Pinghua Liu, thank you for serving on my committee and for your guidance.

I would like to thank my research advisor, Dr. Schaus, for giving me the chance and the confidence to grow as a scientist. Thank you for your support over the last five years. I would also like to thank the past and present Schaus group members including Josh Giguere, John Westbrook, Nolan McDougal, Melissa Dominguez, Sha Lou, Stacy Rodgen, Whitney Trevellini, Christiane Bode, Amal Ting, Jen Goss, Josh Bishop, Phil Moquist, Allison Wensley, Elise Birkett, Laura Kliman, Andrew Wojtovich, and Valerie Curtis for providing laughs as well as support in and outside the lab.

You made me smile on my worst days. I could not have asked for a better group of people to work with. I wish you all the best. I would like to thank our collaborators; Sarah Chobot and Mike Hamil! from the Elhott lab in the BU Chemistry Department for their help with the thioredoxin assays; Melissa Landon and Dr.

Sandor Vajda from the BU Bioinformatics Department for the GOLD studies; the Gardner and Collins labs at the Center for BioDynamics and iv Department of Biomedical Engineering at BU for the predictions of the target of PTSB using the MNI; and Dr. John Tullai from the Cooper lab in the Department of Biology at BU for his help with the western blot analysis. I would like to thank the office staff in the chemistry department for all of their hard work. A special thank you goes to Katinka Csigi for her help in my job search as well as her suggestions on my presentations and résumé.

You are a wonderful lady. I am very thankful to the CMLD faculty and staff, especially Paul Ferrari and Aruna Jain. Aaron Beeler, Dayle Acquilano, and Chris Singleton, thank you for the help with my library synthesis and data analysis. To my friends and family, I am so lucky to have such a strong support system.

Stacy, Christiane, Melissa, Jen, and Allison, I am grateful to have such a great set of friends that are also my colleagues. SuzAnn, we have been through a lot together. I do not know how I would have made it through those first years without you. Thank you for being the sister that I never had.

My family has always been an important part of my life. I would not be who I am without their love and support. Mom and Dad, words can not explain how much you both mean to me. I love you both very much.

Thank you for letting me find my own way and making me believe in myself. The support of my family extends beyond my parents. I am lucky to have a wonderful extended family, including my aunts, uncles, cousins, and grandparents who have encouraged and supported me over the years. I love you all very much.

You have showed me what really matters in life. Matt, thank you for being so supportive, and understanding about my work schedule. It really made me happy to share my free time with you. I have found the chemical reaction that I was looking for, and I look forward to what the future may hold.

vi A CHEMICAL GENOMIC APPROACH TOWARDS DETERMINING THE MOLECULAR TARGET OF ANTI-PROLIFERATIVE COMPOUNDS (Order No. EASTWOOD Boston University Graduate School of Arts and Sciences, 2007 Major Professor: Scott E. Schaus, Assistant Professor of Chemistry and Pharmacology ABSTRACT Drug target identification is a time consuming stage of the drug discovery process. Chemical genomics offers a solution to this hurdle.

In chemical genomics, a target specific chemical ligand is applied on a genomic scale. This technique was used to identify the molecular target of anti-proliferative agents using changes in mRNA transcript levels upon treatment. Whole-genome transcription profiling experiments employed the eukaryotic model organism Saccharomyces cerevisiae for small-molecule perturbation experiments in addition to traditional genetics. Chemical genomics was used to examine the molecular target of borrelidin, a macrolide with conflicting published biological activities.

The initial transcription profiles showed an increase in the transcript ratios of genes involved in amino acid biosynthesis upon treatment with borrelidin. In yeast, the GCN4 pathway regulates general amino acid control. The accumulation of uncharged tRNA activates Gen2p which vil prevents the formation of the eIF-2 complex. In turn, this simulates the translation of Gen4p, which results in the transcription of over 30 genes involved in amino acid biosynthesis.

Experiments using GCN2 and GCN4 gene deletions determined that borrelidin targets the amino acid biosynthetic pathway through GCN4p. The profiling data indicates that an alternative mechanism exists for the translational regulation of Gen4p other than through Gen2p, which was confirmed using immunoblot analysis with elF2 « and phosphorylated elF2 o antibodies. In the second application of chemical genomics, a diverse collection of synthetic compounds was evaluated in a cell-based toxicity assay. The screen revealed a subset of cyclic sulfones that inhibited growth of A549, human small lung carcinoma, cells.

Within this subset, 4-(1-phenyl-1H-tetrazole-5-sulfonyl)-butyronitrile (PTSB) was the most active compound. PTSB was shown to inhibit growth of both wild-type S. Whole-genome transcription profiling experiments in S. cerevisiae indicated that PTSB is involved in the cellular response to oxidative stress.

Analysis of the profiling data using systems biology predicted the thioredoxin pathway as the target. Biochemical assays with thioredoxin (Trx) and thioredoxin reductase (TrxR) validated that PTSB inhibits TrxR. The structure of PTSB suggests a novel mechanism of inhibition. This research illustrates the significance of applying chemical genomics to the target validation stage of drug discovery.

vin TABLE OF CONTENTS ACKNOWLEDGEMENTS iv ABSTRACT VI TABLE OF CONTENTS 1X LIST OF TABLES LIST OF FIGURES XI LIST OF SCHEMES XV LIST OF ABBREVIATIONS xvi CHAPTER 1: An introduction to chemical genetics and drug target identification CHAPTER 2: The application of chemical genomics to examine the molecular target of an anti-proliferative compound, borrelidin 14 Introduction 14 Results and Discussion 18 Conclusions 32 Experimental Methods 35 CHAPTER 3: A chemical genomics approach towards the target identification of a novel anti-proliferative compound, PTSB 53 Introduction 53 Results and Discussion 55 Conclusions 82 Experimental Methods 84 Characterization 109 REFERENCES 122 CURRICULUM VITAE 134 ix LIST OF TABLES Table 2.1: Published and experimental ICs values for borrelidin 16 Table 2.2: Fold-change of several over-expressed genes upon treatment with borrelidin 20 Table 2.3: Fold-change of several repressed genes upon treatment with borrelidin 22 Table 2. Fold changes of the transcript ratios for genes involved in amino acid biosynthesis in the drug sensitive (at 30, 60, and 90 minutes), gcn4A, and gcn2A strains upon treatment with borrelidin 50 Table 3.1: ICso values of lead compounds in growth inhibition assays in A549 and HeLa-S3 cell lines 57 Table 3.2: The top five gene ontology predictions for PTSB using the MNI algorithm 67 Table 3.3: Glso values for gene deletion and heterozygous strains of Trx and TrxR in yeast 68 LIST OF FIGURES Figure 1.1: Chemical structures of saframycin A, bishydroquinone derivatives of saframycin A, FK506, rapamycin, and cyclosporin A Figure 1.2: Drug target identification methods Figure 1.3: An overview of chemical genetics Figure 1.4: A chemical genomic approach towards drug target identification using whole-genome transcription profiling experiments 12 Figure 2.1: The chemical structures of borrelidin, 3-amino-1,2,4- triazole (3AT), and several anti-cancer agents 15 Figure 2.2: Color display plot of the expression ratios of genes involved in amino acid biosynthesis in the wild-type, gcn4A, and gcn2A strains as a result of treatment with 100 uM borrelidin 23 Figure 2.3: Color display plot of the expression ratios of genes involved in amino acid biosynthesis in the wild-type, gcen4A, and gen2A strains as a result of treatment with 100 uM borrelidin and 100 mM 3-aminotriazole (3AT), and wt treated with borrelidin and threonine 27 Figure 2.4: Color display plot of the expression ratios of genes involved in amino acid biosynthesis in the wild-type, gcen4A, gcen2A, gcn1A, and gcn20A strains as a result of treatment with 100 uM borrelidin 29 Figure 2.5: Phosphorylation of eIF2o in the presence of borrelidin and 3ATin wild-type and gcn2A yeast strains 31 Figure 2.6: Borrelidin growth inhibition of BY4741 37 Figure 2.7: Borrelidin growth inhibition of BY4743 38 XI Figure 2.8: Borrelidin growth inhibition of CCY333, the drug sensitive strain 39 Figure 2.9: Borrelidin growth inhibition of erg6A strain 40 Figure 2.10: Borrelidin growth inhibition of CDC28::cdc28 heterozygous strain 41 Figure 2.11: Borrelidin growth inhibition of the gcn4A strain 42 Figure 2.12: Borrelidin growth inhibition of gen2A strain 43 Figure 2.13: Borrelidin growth inhibition of the GCD1::gcd1 heterozygous strain 44 Figure 2.14: Borrelidin growth inhibition of hom3A strain 45 Figure 2.15: Growth of CCY333, DS’strain, in the presence of 400 nM borrelidin at various concentrations of threonine 47 Figure 3.1: Representative members from a diverse library 56 Figure 3.2: Representative members of the cyclic sulfone library 60 Figure 3.3: Color display plot of expression ratios of genes involved in oxidative stress, ribosome biogenesis, and rRNA processing upon treatment with PTSB 62 Figure 3.4: (A) DTNB assay for Trx/TrxR activity. (B) DTNB assay for TrxR activity 69 Figure 3.5: DTNB assay for thioredoxin/thioredoxin reductase activity in the presence of 0, 5, and 50 uM PTSB 70 Figure 3.6: DTNB assay for thioredoxin reductase activity in the presence of 0, 12.5, and 25 uM PTSB 72 Figure 3.7: Apparent K,, versus [I] for PTSB 73 Figure 3.8: High throughput screen for thioredoxin reductase activity 74 xil Figure 3.9: Known inhibitors of the Trx/TrxR system 76 Figure 3.10: Docking of AADP” and PTSB in the NADPH binding domain of TrxR from E.11: DTNB assay for thiorexoxin reductase activity in the presence of 12.54M PTSB varying the concentration of NADPH from 50 uM and 200 uM 81 Figure 3. DTNB assay for thioredoxin reductase activity in the presence of 0, 12.5, 25 and 50 uM PTSB 89 Figure 3.

Apparent K,, versus [I] for PTSB 90 Figure 3. Percent growth inhibition of A549 by PTSB 94 Figure 3. Percent growth inhibition of HeLa-S3 cells by PTSB 95 Figure 3. Percent growth inhibition of A549 by 4-[1-(2-Bromo-4-fluoro- phenyl)-1H-tetrazole-5-sulfonyl]-butyronitrile 96 Figure 3.

Percent growth inhibition of HeLa-S3 cells by 4-[1-(2-Bromo- 4-fluoro-phenyl)-1H-tetrazole-5-sulfonyl]-butyronitrile 97 Figure 3. Percent growth inhibition of A549 by 4-[1-(4-Bromo-phenyl)- 1H-tetrazole-5-sulfonyl]-butyronitrile 98 Figure 3. Percent growth inhibition of HeLa-S3 cells by 4-[1-(4-Bromo- phenyl)-1H-tetrazole-5-sulfonyl]-butyronitrile 99 Figure 3. Percent growth inhibition of A549 by 3-(benzothiazole-2- sulfonylmethyl)-benzonitrile 100 Figure 3.

Percent growth inhibition of HeLa-S3 cells by 3- (benzothiazole-2-sulfonylmethyl)-benzonitrile 101 Figure 3. Percent growth inhibition of A549 cells by 4-(1-Phenyl-1H- tetrazole-5-sulfonylmethyl)-benzonitrile 102 Xili Figure 3.