Luận án tiến sĩ a chemical genomic approach towards determining the molecular target of anti proliferative compounds

Luận án tiến sĩ nghiên cứu a chemical genomic approach towards determining the molecular target of anti proliferative compounds, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết,

• Tác giả: Erin Eastwood
• Người hướng dẫn: Scott Schaus, Assistant Professor
• Trường học: Boston University
• Chuyên ngành: Chemistry and Pharmacology
• Đề tài: A Chemical Genomic Approach Towards Determining The Molecular Target Of Anti-Proliferative Compounds
• Loại tài liệu: dissertation
• Năm xuất bản: 2007
• Địa điểm: Dartmouth

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH VẼ
• DANH MỤC SƠ ĐỒ
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: Tổng quan về di truyền học hóa học và xác định đích tác dụng của thuốc
• 1.1. Giới thiệu
• 2. CHƯƠNG 2: Ứng dụng hệ gen học hóa học trong việc nghiên cứu đích phân tử của hợp chất kháng tăng sinh borrelidin
• 2.1. Giới thiệu
• 2.2. Kết quả và thảo luận
• 2.3. Kết luận
• 2.4. Phương pháp thực nghiệm
• 3. CHƯƠNG 3: Tiếp cận hệ gen học hóa học hướng tới xác định đích của hợp chất kháng tăng sinh mới PTSB
• 3.1. Giới thiệu
• 3.2. Kết quả và thảo luận
• 3.3. Kết luận
• 3.4. Phương pháp thực nghiệm
• 3.5. Đặc trưng hóa cấu trúc
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• LÝ LỊCH KHOA HỌC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Hóa Học Gen Trong Xác Định Mục Tiêu Phân Tử

Xác định mục tiêu phân tử của hợp chất chống tăng sinh là một bước quan trọng trong quá trình phát triển thuốc mới. Số lượng các ứng viên thuốc tiềm năng và protein đã tăng lên đáng kể nhờ những tiến bộ trong lĩnh vực genomics, hóa học tổ hợp và sàng lọc hiệu năng cao tự động. Việc kết hợp hóa học gen và sinh học hệ thống cung cấp một giải pháp thiết thực để sàng lọc số lượng ngày càng tăng của các ứng viên thuốc và quá trình xác nhận. Trong các giai đoạn phát triển thuốc, các sản phẩm tự nhiên và phân tử nhỏ được khảo nghiệm bằng các màn hình định hướng mục tiêu dựa trên kiểu hình. Các phân tử nhỏ được tạo ra bằng cách sử dụng tổng hợp định hướng mục tiêu và tổng hợp định hướng đa dạng. Theo tài liệu, trong tổng hợp định hướng mục tiêu, các hợp chất được thiết kế bằng cách sử dụng lộ trình hồi cứu từ một mục tiêu cụ thể. Một ví dụ như vậy, các dẫn xuất bishydroquinone của sản phẩm tự nhiên, saframycin, đã được tổng hợp và sàng lọc hoạt tính chống tăng sinh đối với u hắc tố A375 và ung thư biểu mô phổi A549. Một nửa số dẫn xuất cho thấy hoạt tính cao hơn saframycin.

1.1. Giới thiệu về Hóa Học Gen và ứng dụng trong dược phẩm

Hóa học gen là một phương pháp mạnh mẽ để xác định mục tiêu phân tử của các hợp chất chống tăng sinh. Phương pháp này sử dụng các thay đổi về biểu hiện gen để suy ra cơ chế tác dụng của thuốc. Hóa học gen đang ngày càng được sử dụng trong quá trình phát triển thuốc mới, đặc biệt là trong việc xác định mục tiêu thuốc và đánh giá hoạt tính sinh học.

1.2. Vai trò của Phân tích hệ thống trong xác định mục tiêu phân tử

Phân tích hệ thống, bao gồm genomics, proteomics và metabolomics, đóng một vai trò quan trọng trong việc giải mã mục tiêu thuốc. Thông qua việc phân tích dữ liệu toàn diện, các nhà nghiên cứu có thể xác định các mạng lưới tương tác protein và các con đường tín hiệu bị ảnh hưởng bởi hợp chất chống tăng sinh, từ đó suy ra mục tiêu phân tử tiềm năng.

1.3. Mối liên hệ giữa Phenotype based screening và Target Identification

Phenotype-based screening là một phương pháp hiệu quả để xác định các hợp chất chống tăng sinh tiềm năng. Tuy nhiên, để hiểu rõ cơ chế tác dụng của các hợp chất này, cần phải xác định mục tiêu phân tử của chúng. Hóa học gen có thể được sử dụng để liên kết kiểu hình quan sát được với các thay đổi trong biểu hiện gen, từ đó giúp xác định mục tiêu thuốc.

II. Thách Thức Trong Việc Xác Định Mục Tiêu Phân Tử Của Thuốc

Mặc dù có nhiều phương pháp để xác định mục tiêu phân tử, nhưng vẫn còn nhiều thách thức. Phương pháp sắc ký ái lực đòi hỏi phải cố định hợp chất và chiết xuất phải chứa dạng hoạt động. Các phương pháp bổ sung bao gồm hiển thị biểu hiện nhân bản, hệ thống ba hybrid nấm men và microarray protein. Các phương pháp nhận dạng khác tập trung nhiều hơn vào suy luận và kiểm tra các thay đổi để làm sáng tỏ mục tiêu protein. Monastrol, một chất ức chế kinesin nguyên phân Eg5, một protein vận động cần thiết cho tính hai cực của thoi, đã được xác định bằng cách sử dụng kết hợp hai màn hình dựa trên kiểu hình. Hơn 16.000 phân tử nhỏ đã được sàng lọc trong một thử nghiệm nguyên phân toàn tế bào (Hình 1.7) và được sàng lọc để tăng cường phosphoryl hóa nucleolin. Nucleolin là một protein hạt nhân được phosphoryl hóa khi bước vào quá trình nguyên phân.

2.1. Hạn chế của phương pháp Affinity chromatography

Affinity chromatography là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để xác định mục tiêu thuốc. Tuy nhiên, phương pháp này có một số hạn chế, bao gồm yêu cầu phải gắn hợp chất vào pha tĩnh và chỉ có thể xác định các protein tương tác trực tiếp với hợp chất.

2.2. Khó khăn trong việc ứng dụng Yeast three hybrid systems

Yeast three-hybrid systems là một phương pháp dựa trên di truyền để xác định tương tác thuốc-mục tiêu. Mặc dù phương pháp này có thể xác định các tương tác gián tiếp, nhưng nó có thể bị ảnh hưởng bởi các tương tác không đặc hiệu và đòi hỏi phải có kiến thức về các protein liên quan.

2.3. Độ phức tạp của Phân tích dữ liệu lớn Big Data trong hóa học gen

Hóa học gen tạo ra một lượng lớn dữ liệu, đòi hỏi các công cụ tin sinh học mạnh mẽ để phân tích và diễn giải. Việc xử lý và phân tích dữ liệu genomics, proteomics và metabolomics đòi hỏi chuyên môn cao và cơ sở hạ tầng tính toán mạnh mẽ.

III. Phương Pháp Hóa Học Gen Dựa Trên RNAi và CRISPR

Hóa học gen sử dụng các kỹ thuật như RNAi và CRISPR để làm gián đoạn các gen cụ thể và quan sát ảnh hưởng đến kiểu hình. Phương pháp này có thể giúp xác định mục tiêu phân tử của hợp chất chống tăng sinh bằng cách xác định các gen mà việc ức chế hoặc loại bỏ sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của hợp chất. Việc sàng lọc dựa trên kiểu hình thường đòi hỏi các xét nghiệm sinh hóa bổ sung để điều tra thêm cơ chế tác dụng.

3.1. Sử dụng RNAi để xác định mục tiêu thuốc

RNAi (RNA interference) là một kỹ thuật mạnh mẽ để làm im lặng các gen cụ thể. Bằng cách sử dụng RNAi để ức chế biểu hiện của các gen khác nhau và quan sát ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất chống tăng sinh, các nhà nghiên cứu có thể xác định mục tiêu thuốc tiềm năng.

3.2. Ứng dụng công nghệ CRISPR trong hóa học gen

Công nghệ CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) cho phép chỉnh sửa gen một cách chính xác. Bằng cách sử dụng CRISPR để loại bỏ các gen cụ thể và quan sát ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất chống tăng sinh, các nhà nghiên cứu có thể xác định mục tiêu thuốc và xác định cơ chế tác dụng của thuốc.

3.3. Kết hợp RNAi và CRISPR để tăng độ chính xác trong xác định mục tiêu

Việc kết hợp RNAi và CRISPR có thể tăng độ chính xác trong việc xác định mục tiêu thuốc. RNAi có thể được sử dụng để giảm tạm thời biểu hiện của một gen, trong khi CRISPR có thể được sử dụng để loại bỏ vĩnh viễn gen đó. Bằng cách quan sát ảnh hưởng của cả hai phương pháp đến hoạt tính của hợp chất chống tăng sinh, các nhà nghiên cứu có thể có được bằng chứng mạnh mẽ về mục tiêu thuốc.

IV. Tiếp Cận Hóa Học Gen Thông Qua Phân Tích Đột Biến Gen

Phân tích đột biến gen là một phương pháp khác để xác định mục tiêu phân tử. Phương pháp này bao gồm việc phân tích các đột biến gen làm thay đổi độ nhạy cảm của tế bào đối với hợp chất chống tăng sinh. Các gen bị đột biến có thể là mục tiêu trực tiếp của hợp chất, hoặc có thể tham gia vào các con đường tín hiệu quan trọng cho hoạt động của hợp chất. Bằng cách xác định các đột biến này, các nhà nghiên cứu có thể xác định mục tiêu thuốc.

4.1. Sử dụng phân tích đột biến gen để xác định cơ chế tác dụng

Phân tích đột biến gen không chỉ giúp xác định mục tiêu thuốc mà còn có thể cung cấp thông tin về cơ chế tác dụng của hợp chất chống tăng sinh. Ví dụ, nếu một đột biến làm cho tế bào kháng với hợp chất, điều đó cho thấy gen bị đột biến đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của hợp chất.

4.2. Ưu điểm của việc phân tích các đột biến tự nhiên và gây ra

Việc phân tích cả đột biến tự nhiên và đột biến gây ra có thể cung cấp thông tin bổ sung về mục tiêu thuốc. Đột biến tự nhiên có thể cho thấy các gen mà việc đột biến sẽ làm thay đổi độ nhạy cảm của tế bào đối với hợp chất, trong khi đột biến gây ra có thể được sử dụng để xác định các gen mà việc đột biến sẽ làm cho tế bào kháng với hợp chất.

4.3. Ứng dụng tin sinh học trong phân tích kết quả đột biến gen

Tin sinh học đóng một vai trò quan trọng trong việc phân tích kết quả phân tích đột biến gen. Các công cụ tin sinh học có thể được sử dụng để xác định các gen bị đột biến, dự đoán ảnh hưởng của các đột biến đến chức năng protein và xác định các con đường tín hiệu liên quan đến mục tiêu thuốc.

V. Nghiên Cứu Borrelidin Ứng Dụng Hóa Học Gen Thực Tiễn

Trong một ứng dụng hóa học gen, một bộ sưu tập đa dạng các hợp chất tổng hợp đã được đánh giá về độc tính dựa trên tế bào. Màn hình hiển thị một tập hợp con các sulfon ức chế sự phát triển của A549, ung thư biểu mô phổi nhỏ ở người. Trong số đó, 4-(1-phenyl-1H-tetrazole-5-sulfonyl)-butyronitrile (PTSB) là hợp chất có hoạt tính mạnh nhất. PTSB đã được chứng minh là làm chậm sự phát triển của cả cerevisiae loại hoang dã và A549. Các thí nghiệm lập hồ sơ phiên mã toàn bộ gen trên cerevisiae cho thấy PTSB liên quan đến phản ứng với stress oxy hóa. Phân tích lập hồ sơ bằng cách sử dụng sinh học hệ thống dự đoán con đường thioredoxin. Các xét nghiệm sinh hóa với thioredoxin (Trx) và thioredoxin reductase (TrxR) đã xác nhận PTSB ức chế TrxR. Cấu trúc của PTSB cho thấy một cơ chế ức chế mới.

5.1. Xác định cơ chế tác dụng của Borrelidin thông qua hóa học gen

Nghiên cứu sử dụng hóa học gen để kiểm tra mục tiêu phân tử của borrelidin, một macrolide có các hoạt tính sinh học được công bố mâu thuẫn. Hồ sơ phiên mã cho thấy sự gia tăng phiên mã các gen liên quan đến sinh tổng hợp axit amin khi điều trị bằng borrelidin. Con đường GCN4 điều chỉnh sự tổng hợp axit amin chung. Sự tích tụ của tRNA không tích điện kích hoạt Gen2p, ngăn chặn sự hình thành phức hợp eIF-2. Điều này mô phỏng quá trình dịch mã của Gen4p, phiên mã quá mức các gen liên quan đến sinh tổng hợp axit amin.

5.2. Vai trò của con đường GCN4p trong tác động của Borrelidin

Các thí nghiệm sử dụng các phiên bản gen bị xóa GCN2 và GCN4 xác định con đường sinh tổng hợp axit amin borrelidin thông qua GCN4p. Hồ sơ cho thấy một cơ chế thay thế quy định dịch mã Gen4p không thông qua Gen2p, được xác nhận bằng phân tích immunoblot với các kháng thể elF2 và elF2 được phosphoryl hóa.

5.3. Kết quả phân tích hệ thống và dự đoán mục tiêu protein

Hồ sơ phiên mã cho thấy sự gia tăng phiên mã các gen liên quan đến sinh tổng hợp axit amin khi điều trị bằng borrelidin. Con đường GCN4 điều chỉnh sự tổng hợp axit amin chung. Các thí nghiệm sử dụng các phiên bản gen bị xóa GCN2 và GCN4 xác định con đường sinh tổng hợp axit amin borrelidin thông qua GCN4p. Hồ sơ cho thấy một cơ chế thay thế quy định dịch mã Gen4p không thông qua Gen2p, được xác nhận bằng phân tích immunoblot với các kháng thể elF2 và elF2 được phosphoryl hóa.

VI. Triển Vọng Phát Triển và Ứng Dụng của Hóa Học Gen

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc áp dụng hóa học gen vào giai đoạn xác nhận của quá trình khám phá thuốc. Việc tích hợp hóa học gen với các phương pháp khác, như proteomics và metabolomics, có thể cung cấp một cái nhìn toàn diện hơn về cơ chế tác dụng của hợp chất chống tăng sinh. Hơn nữa, sự phát triển của các công cụ tin sinh học tiên tiến sẽ giúp phân tích và diễn giải dữ liệu hóa học gen một cách hiệu quả hơn, từ đó đẩy nhanh quá trình khám phá và phát triển thuốc mới.

6.1. Tích hợp Hóa Học Gen với Proteomics và Metabolomics

Việc tích hợp hóa học gen với proteomics và metabolomics cho phép các nhà nghiên cứu có được một cái nhìn toàn diện hơn về tác động của hợp chất chống tăng sinh lên tế bào. Proteomics có thể xác định những thay đổi về biểu hiện protein, trong khi metabolomics có thể xác định những thay đổi về chuyển hóa. Bằng cách kết hợp dữ liệu từ các phương pháp này, các nhà nghiên cứu có thể hiểu rõ hơn về cơ chế tác dụng của hợp chất và xác định mục tiêu thuốc tiềm năng.

6.2. Tầm quan trọng của Tin Sinh Học trong phân tích dữ liệu hóa học gen

Tin sinh học đóng một vai trò quan trọng trong việc phân tích và diễn giải dữ liệu hóa học gen. Các công cụ tin sinh học có thể được sử dụng để xác định các gen và protein bị ảnh hưởng bởi hợp chất chống tăng sinh, dự đoán các tương tác thuốc-mục tiêu và xác định các con đường tín hiệu liên quan đến hoạt động của thuốc.

6.3. Ứng dụng tiềm năng của Hóa Học Gen trong phát triển thuốc ung thư

Hóa học gen có tiềm năng lớn trong việc phát triển thuốc ung thư mới. Bằng cách xác định mục tiêu phân tử của các hợp chất chống tăng sinh, các nhà nghiên cứu có thể phát triển các thuốc có tác dụng chọn lọc hơn và ít tác dụng phụ hơn. Hóa học gen cũng có thể được sử dụng để xác định các dấu ấn sinh học để dự đoán phản ứng của bệnh nhân với thuốc và phát triển các chiến lược điều trị cá nhân hóa.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Xác định và kiểm chứng đích phân tử của thuốc (drug target validation) là một trong những giai đoạn đòi hỏi nhiều thời gian trong quy trình nghiên cứu và phát triển thuốc. Sự phát triển của các phương pháp tổng hợp tổ hợp và kỹ thuật sàng lọc thông lượng cao đã tạo ra số lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học, tuy nhiên việc xác định cơ chế tác động nội bào của các phân tử nhỏ vẫn gặp nhiều rào cản kỹ thuật. Tiếp cận di truyền hệ gen hóa học (chemical genomics) sử dụng các phối tử hóa học đặc hiệu kết hợp với phân tích biến đổi mức độ phiên mã mRNA trên quy mô toàn hệ gen cung cấp giải pháp cho vấn đề này. Luận án tiến sĩ của tác giả Erin L. Eastwood tập trung giải quyết khoảng trống nghiên cứu về đích phân tử thực sự của hợp chất tự nhiên borrelidin vốn có các báo cáo mâu thuẫn trong y văn, đồng thời xác định đích tác động của nhóm hợp chất ức chế tăng sinh tổng hợp mới chứa dị vòng tetrazole sulfone (tiêu biểu là PTSB).

Mục tiêu và câu hỏi nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể như sau:

1. Xác định đích phân tử và con đường truyền tín hiệu nội bào của borrelidin trên sinh vật mô hình Saccharomyces cerevisiae, phân giải các mâu thuẫn giữa giả thuyết ức chế kinase phụ thuộc cyclin (Cdc28/Cln2) và giả thuyết tác động lên con đường sinh tổng hợp axit amin (thông qua threonyl-tRNA synthetase).
2. Kiểm chứng cơ chế kích hoạt yếu tố phiên mã Gcn4p khi tế bào chịu tác động của borrelidin, làm rõ sự phụ thuộc hoặc độc lập của con đường này đối với protein kinase Gcn2p và sự phosphoryl hóa tiểu đơn vị eIF2α.
3. Sàng lọc độc tính tế bào của thư viện các hợp chất sulfone vòng trên các dòng tế bào ung thư người (A549 và HeLa-S3) nhằm tìm kiếm các cấu trúc có hoạt tính kháng tăng sinh mạnh.
4. Ứng dụng giải thuật sinh học hệ thống MNI (Mode-of-action by Network Identification) và các thử nghiệm sinh hóa in vitro để xác định và kiểm chứng đích ức chế enzyme của hợp chất dẫn đường 4-(1-phenyl-1H-tetrazole-5-sulfonyl)-butyronitrile (PTSB).

Đối tượng nghiên cứu của luận án bao gồm hợp chất macrolide tự nhiên borrelidin (phân lập từ Streptomyces rochei), thư viện các hợp chất sulfone vòng tổng hợp hóa học, hợp chất dẫn đường PTSB; các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae đơn bội, lưỡng bội, các chủng đột biến xóa gen (gcn4Δ, gcn2Δ, gcn1Δ, gcn20Δ, hom3Δ, erg6Δ, trr2Δ, trx1Δ, trx2Δ, trx3Δ) và dị hợp tử (CDC28::cdc28, GCD1::gcd1, TRR1::trr1, CCY333); các dòng tế bào ung thư người (A549 - ung thư biểu mô phổi, HeLa-S3 - ung thư cổ tử cung, A375 - u hắc tố, H460 - ung thư phổi tế bào lớn, WiDR - ung thư biểu mô đại tràng) và tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (HUVEC). Phạm vi thực nghiệm được triển khai tại Khoa Hóa học, Trung tâm Phát triển Phương pháp luận Hóa học và Thư viện (CMLD), Đại học Boston, hoàn thành năm 2006 và bảo vệ năm 2007.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong chương tổng quan, tác giả điểm lại hệ thống các phương pháp xác định đích phân tử của thuốc bao gồm phương pháp trực tiếp và phương pháp gián tiếp. Phương pháp trực tiếp phổ biến nhất là sắc ký ái lực (affinity chromatography), đòi hỏi cố định phân tử nhỏ lên chất mang nhựa rồi phân lập và giải trình tự protein liên kết; ví dụ điển hình là việc xác định protein gắn FK506 (FKBP) của macrolide ức chế miễn dịch FK506, hoặc protein cyclophilin gắn với cyclosporin A. Bên cạnh đó là các kỹ thuật biểu hiện/dòng hóa hiển thị, hệ thống ba lai nấm men (yeast three-hybrid) và vi mảng protein (protein microarrays). Phương pháp gián tiếp dựa trên suy luận từ phản ứng tế bào, bao gồm sàng lọc kiểu hình (phenotype-based screens) kết hợp chụp ảnh tế bào, ví dụ như phát hiện chất ức chế kinesin nguyên phân Eg5 là monastrol từ thư viện 16.000 hợp chất qua xét nghiệm mức độ phosphoryl hóa nucleolin và hình thái thoi vô sắc. Phương pháp gián tiếp khác là so sánh hồ sơ biểu hiện gen hoặc protein cảm ứng bởi thuốc, như trường hợp nghiên cứu uretupamine gắn Ure2p (điều hòa các yếu tố phiên mã Gln3p và Nil1p) hoặc nghiên cứu rapamycin ức chế protein Tor (Tor1, Tor2) tương đồng với FRAP ở tế bào động vật có vú.

Về hợp chất borrelidin, y văn ghi nhận nhiều hoạt tính sinh học phân tán:

• Kháng sinh (phân lập năm 1949 từ Streptomyces rochei).
• Hoạt tính kháng sốt rét và ức chế tạo mạch: Ứng chế tạo ống mao mạch ở mô hình quai động mạch chủ chuột với $IC_{50} = 0,8\text{ nM}$, ức chế tổng hợp DNA và protein ở tế bào HUVEC với $IC_{50} = 20\text{ nM}$, ức chế dòng tế bào ung thư phổi H460 ($IC_{50} = 180\text{ nM}$) và tế bào ung thư đại tràng WiDR ($IC_{50} = 100\text{ nM}$).
• Hoạt tính ức chế enzyme: Ức chế cyclin-dependent kinase Cdc28/Cln2 ở nấm men S. cerevisiae với $IC_{50} = 24\text{ nM}$, đồng thời có báo cáo ức chế men threonyl-tRNA synthetase (ThrRS) ở Escherichia coli. Các đột biến kháng borrelidin ở E. coli, nấm men và tế bào buồng trứng chuột lang (CHO) đều liên quan đến sự gia tăng hàm lượng threonine hoặc biến đổi cấu trúc ThrRS.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là sự thiếu đồng nhất về cơ chế phân tử chính của borrelidin giữa các hệ thống thử nghiệm khác nhau, đồng thời thiết lập một quy trình tích hợp giữa di truyền hệ gen hóa học, phân tích tin sinh học/sinh học hệ thống và thử nghiệm động học enzyme để xác định đích của các phân tử nhỏ tổng hợp mới (như dẫn xuất sulfone PTSB) mà không cần chế tạo chất mang ái lực hóa học phức tạp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết của di truyền học hóa học (chemical genetics) gồm hai hướng tiếp cận: di truyền hóa học xuôi (forward chemical genetics - sàng lọc kiểu hình từ thư viện phân tử nhỏ để tìm hợp chất dẫn đường rồi xác định đích) và di truyền hóa học ngược (reverse chemical genetics - tìm kiếm phối tử gắn với protein đích đã biết). Hệ thống kiểm soát chung axit amin (General Amino Acid Control - GAAC) ở S. cerevisiae được sử dụng làm khung lý thuyết phân tích: khi tế bào thiếu hụt axit amin, các phân tử tRNA không nạp (uncharged tRNA) tích lũy, kích hoạt protein kinase Gcn2p phosphoryl hóa eIF2α tại serine 51, ngăn chặn hình thành phức hợp eIF-2 và kích thích dịch mã yếu tố phiên mã Gcn4p, từ đó hoạt hóa phiên mã hơn 30 gen sinh tổng hợp axit amin. Đối với PTSB, cơ sở lý thuyết dựa trên hệ thống oxy hóa khử thioredoxin (Trx/TrxR), trong đó thioredoxin reductase (TrxR) sử dụng NADPH để khử cầu disulfide của thioredoxin (Trx), duy trì cân bằng redox và đáp ứng stress oxy hóa của tế bào.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

• Thử nghiệm ức chế sinh trưởng và độc tính tế bào: Đo độ đục quang học ($OD_{600}$) trên các chủng nấm men nuôi cấy trong môi trường YPD lỏng; thử nghiệm chuyển hóa muối tetrazolium MTS trên các dòng tế bào ung thư người A549 và HeLa-S3 nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung huyết thanh bò thai (FBS).
• Lập hồ sơ phiên mã toàn hệ gen bằng DNA microarray: Tách chiết RNA tổng số bằng phenol:chloroform; phân lập mRNA bằng hạt nhựa poly-T (Qiagen Oligotex); phiên mã ngược tổng hợp cDNA có gắn nucleotide amino-allyl dUTP; ghép nối huỳnh quang Cyanine-3 (Cy3 - mẫu đối chứng, bước sóng 532 nm) và Cyanine-5 (Cy5 - mẫu xử lý thuốc, bước sóng 635 nm); lai cạnh tranh trên phiến kính vi mảng chứa 6.307 mẫu dò oligonucleotide 70-mer đại diện cho toàn bộ hệ gen nấm men; quét tín hiệu laser và phân tích dữ liệu bằng phần mềm GenePix Pro và GeneSpring. Áp dụng hệ số chuẩn hóa theo cường độ tín hiệu trung bình giữa hai kênh Cy3/Cy5 với ngưỡng lọc lớn hơn 3 lần độ lệch chuẩn của nền.
• Phân tích miễn dịch huỳnh quang (Western blot): Sử dụng kháng thể kháng eIF2α toàn phần và kháng thể đặc hiệu nhận diện eIF2α phosphoryl hóa tại Serine 51 ($eIF2\alpha[pS51]$) nhằm xác định trạng thái hoạt hóa của con đường GCN2.
• Thử nghiệm sinh hóa enzyme in vitro: Đo hoạt độ của hệ thống thioredoxin và thioredoxin reductase dựa trên phản ứng khử acid 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB, thuốc thử Ellman) thành 2-nitro-5-thiobenzoate (TNB) tại bước sóng 412 nm. Xác định các thông số động học ($K_m$ biểu kiến, $V_{max}$, $K_i$) khi thay đổi nồng độ cơ chất NADPH và nồng độ chất ức chế PTSB.
• Mô hình hóa gắn kết phân tử (Molecular docking): Sử dụng phần mềm GOLD (Genetic Optimisation for Ligand Docking) để mô phỏng tương tác liên kết giữa PTSB và miền liên kết NADPH trên cấu trúc tinh thể của TrxR từ E. coli.
• Tổng hợp hóa học: Tổng hợp hữu cơ các dẫn xuất alkyl sulfone vòng qua phản ứng alkyl hóa các dị vòng thiol (như 1-phenyl-1H-tetrazole-5-thiol) tiếp nối bằng phản ứng oxy hóa lưu huỳnh sử dụng magnesium monoperoxyphthalate (MMPP).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: An introduction to chemical genetics and drug target identification

Chương 1 hệ thống hóa các nguyên lý cơ bản của di truyền học hóa học và các chiến lược xác định đích phân tử của thuốc. Tác giả phân tích sự khác biệt giữa thư viện định hướng đích (target-directed synthesis) và thư viện định hướng đa dạng (diversity-oriented synthesis), đồng thời so sánh các ưu nhược điểm của phương pháp trực tiếp (như sắc ký ái lực FK506-FKBP) và gián tiếp (như phân tích kiểu hình phân bào của monastrol trên kinesin Eg5). Chương này làm rõ vai trò của sinh vật mô hình S. cerevisiae trong nghiên cứu y sinh học, nhấn mạnh rằng 30% gen liên quan đến bệnh ở người có gen tương đồng chức năng ở nấm men và 95% trong số ~6.200 khung đọc mở (ORF) của nấm men đã được tạo dòng đột biến xóa gen. Tác giả trình bày chi tiết quy trình kỹ thuật lập hồ sơ phiên mã toàn hệ gen bằng DNA microarray và cách tiếp cận tích hợp di truyền hệ gen hóa học với sinh học hệ thống để giải mã cơ chế tác động của phân tử nhỏ.

Chương 2: The application of chemical genomics to examine the molecular target of an anti-proliferative compound, borrelidin

Chương 2 trình bày các nghiên cứu thực nghiệm nhằm giải mã đích phân tử của borrelidin. Thử nghiệm ức chế sinh trưởng trên các chủng nấm men cho thấy giá trị $IC_{50}$ của borrelidin trên chủng hoang dại BY4741 là $23\ \mu\text{M}$ và chủng dị hợp tử $CDC28::cdc28$ là $7,6\ \mu\text{M}$. Sự chênh lệch không đáng kể này cho thấy kinase Cdc28 không phải là đích tác động chính nội bào của borrelidin.

Chủng nấm men / Dòng tế bào	Hoạt tính sinh học / Đặc điểm di truyền	$IC_{50}$ thực nghiệm	$IC_{50}$ tài liệu công bố
BY4741	Wild-type (đơn bội)	$23\ \mu\text{M}$	—
BY4743	Wild-type (lưỡng bội)	$25\ \mu\text{M}$	—
CCY333 (DS)	Chủng nhạy cảm thuốc (erg6Δ pdr3Δ pdr1Δ)	$0,38\ \mu\text{M}$	—
erg6Δ	Đột biến tính thấm màng	$1,4\ \mu\text{M}$	—
CDC28::cdc28	Dị hợp tử cyclin-dependent kinase	$7,6\ \mu\text{M}$	—
gcn4Δ	Đột biến xóa yếu tố phiên mã GAAC	$46\ \mu\text{M}$	—
gcn2Δ	Đột biến xóa eIF2α kinase	$34\ \mu\text{M}$	—
GCD1::gcd1	Dị hợp tử tiểu đơn vị eIF2B	$13\ \mu\text{M}$	—
hom3Δ	Đột biến xóa aspartate kinase	$1,9\ \mu\text{M}$	—
Cdc28/Cln2	Kinase phụ thuộc cyclin ở S. cerevisiae	—	$24\text{ nM}$
HUVEC	Tổng hợp DNA và protein	—	$20\text{ nM}$
Rat aorta	Tạo ống mao mạch mô hình quai động mạch chủ	—	$0,8\text{ nM}$
H460	Tế bào ung thư phổi tế bào lớn ở người	—	$180\text{ nM}$
WiDR	Tế bào ung thư đại tràng ở người	—	$100\text{ nM}$

Dữ liệu vi mảng DNA trên chủng hoang dại xử lý $100\ \mu\text{M}$ borrelidin trong 60 phút cho thấy sự thay đổi mức độ phiên mã của hơn 300 gen tăng biểu hiện từ 2 lần trở lên:

Tên gen	Hệ số cảm ứng (Fold Change)	Chức năng protein
ARG3	29,8	Ornithine carbamoyltransferase (sinh tổng hợp arginine)
LYS1	17,6	Saccharopine dehydrogenase (sinh tổng hợp lysine)
CPA2	17,2	Carbamyl phosphate synthetase
HIS5	11,3	Histidinol-phosphate aminotransferase (sinh tổng hợp histidine)
TRP3	8,5	Indole-3-glycerol-phosphate synthase
MET10	5,3	Sulfite reductase alpha subunit
ARG1	28,3	Argininosuccinate synthetase (sử dụng nitơ/lưu huỳnh)
STR3	6,6	Cystathionine beta-lyase
GLN3	4,9	Yếu tố phiên mã điều hòa nitơ dương tính
SNZ1	32,8	Protein sinh tổng hợp vitamin B6
SNO1	4,8	Protein liên quan sinh tổng hợp vitamin B6
BIO3	4,6	DAPA aminotransferase (sinh tổng hợp biotin)
BIO4	4,0	Dethiobiotin synthetase

Ngược lại, các gen liên quan đến sinh tổng hợp ribosome (DHR2: 0,50; NIP7: 0,49; BRX1: 0,49; NOP16: 0,46; RPS10A: 0,34), xử lý rRNA (HAS1: 0,44; RPF1: 0,45) và vận chuyển hexose (HXT7: 0,31; HXT6: 0,25; HXT4: 0,17; HXT2: 0,16) bị ức chế biểu hiện.

Khi phân tích trên các chủng đột biến, chủng gcn4Δ không còn biểu hiện cảm ứng các gen sinh tổng hợp axit amin khi xử lý borrelidin. Tuy nhiên, chủng gcn2Δ vẫn biểu hiện sự gia tăng phiên mã của các gen đích thuộc Gcn4p (với 12% hệ gen bị thay đổi biểu hiện từ 2 lần trở lên), khác biệt hoàn toàn với chất ức chế 3-amino-1,2,4-triazole (3AT) vốn mất hoàn toàn khả năng cảm ứng ở chủng gcn2Δ. Phân tích Western blot xác nhận borrelidin kích thích dịch mã Gcn4p thông qua một cơ chế thay thế không phụ thuộc vào quá trình phosphoryl hóa eIF2α bởi Gcn2p. Thử nghiệm bổ sung $10\text{ mM}$ threonine vào môi trường nuôi cấy chủng nhạy cảm thuốc CCY333 xử lý $400\text{ nM}$ borrelidin đã đảo ngược hoàn toàn đáp ứng phiên mã của các enzyme sinh tổng hợp axit amin về mức bình thường, khẳng định borrelidin tác động thông qua sự ức chế threonyl-tRNA synthetase (ThrRS).

Chương 3: A chemical genomics approach towards the target identification of a novel anti-proliferative compound, PTSB

Chương 3 trình bày việc tổng hợp và xác định cơ chế tác động của nhóm hợp chất sulfone vòng. Sàng lọc độc tính tế bào trên dòng A549 và HeLa-S3 đã xác định hợp chất 4-(1-phenyl-1H-tetrazole-5-sulfonyl)-butyronitrile (PTSB) có hoạt tính ức chế mạnh nhất.

Hợp chất	Cấu trúc / Tên hóa học	$IC_{50}$ A549 ($\mu\text{M}$)	$IC_{50}$ HeLa-S3 ($\mu\text{M}$)
PTSB	4-(1-phenyl-1H-tetrazole-5-sulfonyl)-butyronitrile	1,4	2,5
BFPTSB	4-[1-(2-bromo-4-fluoro-phenyl)-1H-tetrazole-5-sulfonyl]-butyronitrile	3,8	6,2
Dẫn xuất 4-Br	4-[1-(4-bromo-phenyl)-1H-tetrazole-5-sulfonyl]-butyronitrile	5,1	8,4
Dẫn xuất benzothiazole	3-(benzothiazole-2-sulfonylmethyl)-benzonitrile	12,0	18,5
Dẫn xuất tetrazole nitrile	4-(1-phenyl-1H-tetrazole-5-sulfonylmethyl)-benzonitrile	15,2	22,0
Dẫn xuất sulfonyl benzyl	2-phenylmethanesulfonyl-benzothiazole	24,5	35,0

Hồ sơ vi mảng phiên mã toàn hệ gen nấm men xử lý PTSB cho thấy sự tăng biểu hiện mạnh mẽ của các gen đáp ứng stress oxy hóa và ức chế các gen sinh tổng hợp ribosome. Phân tích dữ liệu bằng thuật toán sinh học hệ thống MNI (Mode-of-action by Network Identification) xếp hạng con đường thioredoxin là đích dự đoán hàng đầu. Thử nghiệm đo quang học DTNB in vitro chứng minh PTSB ức chế trực tiếp hoạt tính của thioredoxin reductase (TrxR). Đồ thị động học biến thiên $K_m$ biểu kiến theo nồng độ chất ức chế và mô hình docking phân tử bằng phần mềm GOLD xác nhận PTSB liên kết cạnh tranh tại vị trí gắn coenzyme NADPH trên enzyme TrxR.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án của tác giả Erin L. Eastwood đã đạt được các kết quả và đóng góp mới sau:

• Về mặt lý thuyết và cơ chế:
  • Làm sáng tỏ cơ chế tác động nội bào của borrelidin: chứng minh borrelidin không ức chế trực tiếp cyclin-dependent kinase Cdc28 trong điều kiện sinh lý tế bào nấm men mà gây ra trạng thái thiếu hụt threonine thông qua ức chế threonyl-tRNA synthetase (ThrRS), dẫn đến kích hoạt con đường kiểm soát chung axit amin (GAAC).
  • Phát hiện một cơ chế điều hòa dịch mã Gcn4p mới không phụ thuộc vào kinase Gcn2p và không đòi hỏi sự phosphoryl hóa eIF2α tại serine 51 khi tế bào xử lý borrelidin.
  • Thiết lập mô hình kết hợp giữa hồ sơ phiên mã vi mảng DNA toàn hệ gen, thuật toán mạng sinh học hệ thống (MNI) và các phép đo động học enzyme để xác định đích phân tử của các hợp chất tổng hợp mới.
• Về mặt thực tiễn và phát triển phân tử nhỏ:
  • Tổng hợp và đánh giá thành công thư viện các dẫn xuất cyclic sulfone, xác định hợp chất dẫn đường PTSB có hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào ung thư phổi A549 ($IC_{50} = 1,4\ \mu\text{M}$) và HeLa-S3 ($IC_{50} = 2,5\ \mu\text{M}$).
  • Xác thực enzyme thioredoxin reductase (TrxR) là đích phân tử trực tiếp của PTSB, chỉ ra cơ chế ức chế cạnh tranh với vị trí liên kết NADPH của cấu trúc 1-phenyl-1H-tetrazole sulfone.
• Kiến nghị và giải pháp đề xuất:
  • Đề xuất sử dụng quy trình sàng lọc di truyền hệ gen hóa học trên nấm men S. cerevisiae như một bước chuẩn hóa trong giai đoạn tiền lâm sàng để định danh đích phân tử của các hợp chất tiềm năng.
  • Kiến nghị tiếp tục tối ưu hóa cấu trúc hóa học của khung phân tử PTSB nhằm nâng cao hoạt lực và tính chọn lọc đối với enzyme thioredoxin reductase ở người phục vụ nghiên cứu phát triển thuốc chống ung thư.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế được đề cập trong văn bản:
  • Các thử nghiệm lập hồ sơ phiên mã và sàng lọc di truyền xóa gen chủ yếu được thực hiện trên sinh vật mô hình nấm men đơn bào Saccharomyces cerevisiae, cần thêm các nghiên cứu xác thực trên tế bào động vật có vú bậc cao.
  • Cơ chế phân tử chi tiết của con đường hoạt hóa dịch mã Gcn4p độc lập với Gcn2p dưới tác động của borrelidin chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn ở cấp độ tương tác protein-protein.
  • Các thử nghiệm ức chế enzyme TrxR in vitro và mô phỏng docking GOLD sử dụng dữ liệu cấu trúc enzyme TrxR từ E. coli và nấm men, chưa khảo sát trên cấu trúc tinh thể đầy đủ của TrxR1 và TrxR2 ở người.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Khảo sát các yếu tố điều hòa dịch mã phụ trợ tham gia vào con đường cảm ứng Gcn4p thay thế khi vắng mặt Gcn2p.
  • Đánh giá hoạt tính ức chế hệ thống thioredoxin reductase của PTSB và các dẫn xuất trên các mô hình khối u in vivo.
  • Mở rộng tổng hợp hóa dược các chất tương tự PTSB mang các nhóm thế khác nhau trên nhân phenyl và dị vòng tetrazole để cải thiện dược động học và độ hòa tan.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo hữu ích cho nghiên cứu sinh, giảng viên và các nhà nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Hóa dược (Medicinal Chemistry), Dược lý học phân tử (Molecular Pharmacology), Di truyền học nấm men và Sinh học hệ thống (Systems Biology).

Các nội dung mang giá trị tham khảo học thuật cao bao gồm:

• Quy trình thực nghiệm chuẩn về tách chiết RNA, tổng hợp cDNA gắn nhãn huỳnh quang amino-allyl Cy3/Cy5 và chuẩn hóa dữ liệu vi mảng DNA 70-mer trên 6.307 mẫu dò của nấm men.
• Phương pháp phối hợp giữa các chủng đột biến xóa gen, chủng nhạy cảm thuốc (CCY333) và chủng dị hợp tử để giải mã cơ chế tác động của phân tử nhỏ.
• Phương pháp thiết kế thử nghiệm đo động học enzyme thioredoxin reductase sử dụng thuốc thử DTNB và kỹ thuật mô phỏng docking GOLD xác định vị trí gắn phối tử.

Câu hỏi thường gặp

1. Phân tích vi mảng DNA trên nấm men hoang dại xử lý borrelidin cho thấy những thay đổi chính nào về biểu hiện gen?

Xử lý $100\ \mu\text{M}$ borrelidin trên chủng hoang dại làm tăng biểu hiện từ 2 lần trở lên ở hơn 300 gen. Các nhóm gen cảm ứng mạnh nhất là sinh tổng hợp axit amin (ARG3 tăng 29,8 lần; LYS1 tăng 17,6 lần; CPA2 tăng 17,2 lần; HIS5 tăng 11,3 lần), sử dụng nitơ và lưu huỳnh (ARG1 tăng 28,3 lần; STR3 tăng 6,6 lần; GLN3 tăng 4,9 lần) và sinh tổng hợp cofactor/vitamin (SNZ1 tăng 32,8 lần; SNO1 tăng 4,8 lần; BIO3 tăng 4,6 lần). Ngược lại, các gen sinh tổng hợp ribosome (DHR2, NIP7, BRX1) và vận chuyển hexose (HXT7, HXT6, HXT4, HXT2) bị ức chế biểu hiện.

2. Sự khác biệt căn bản trong cơ chế kích hoạt con đường GCN4 giữa borrelidin và 3-amino-1,2,4-triazole (3AT) trên chủng đột biến gcn2Δ là gì?

Khi xử lý bằng chất ức chế sinh tổng hợp histidine 3AT trên chủng xóa gen gcn2Δ, sự gia tăng biểu hiện của các gen sinh tổng hợp axit amin bị triệt tiêu hoàn toàn, chứng minh 3AT phụ thuộc hoàn toàn vào kinase Gcn2p để cảm ứng Gcn4p. Ngược lại, khi xử lý bằng borrelidin trên chủng gcn2Δ, mức độ phiên mã của các gen đích của Gcn4p vẫn tăng tương tự như ở chủng hoang dại, cho thấy borrelidin có khả năng kích thích dịch mã Gcn4p thông qua một con đường thay thế không phụ thuộc vào Gcn2p.

3. Hợp chất PTSB có tên hóa học là gì và thể hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng như thế nào trên các tế bào ung thư?

PTSB có tên hóa học đầy đủ là 4-(1-phenyl-1H-tetrazole-5-sulfonyl)-butyronitrile. Trong thử nghiệm độc tính tế bào, PTSB thể hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng mạnh nhất trong thư viện sulfone vòng với giá trị $IC_{50}$ đạt $1,4\ \mu\text{M}$ trên dòng tế bào ung thư biểu mô phổi người A549 và $2,5\ \mu\text{M}$ trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa-S3.

4. Bằng cách nào tác giả xác định và kiểm chứng được đích phân tử nội bào của PTSB?

Tác giả sử dụng phương pháp lập hồ sơ phiên mã toàn hệ gen nấm men khi xử lý PTSB, ghi nhận sự kích hoạt mạnh các gen đáp ứng stress oxy hóa. Dữ liệu biểu hiện gen được đưa vào thuật toán sinh học hệ thống MNI để dự đoán đích tác động, chỉ ra hệ thống thioredoxin. Sau đó, thử nghiệm sinh hóa in vitro với thuốc thử Ellman (DTNB) và phân tích động học biến thiên $K_m$ biểu kiến đã xác nhận PTSB ức chế trực tiếp enzyme thioredoxin reductase (TrxR) thông qua cơ chế cạnh tranh với cơ chất NADPH.

5. Thí nghiệm bổ sung threonine mang lại kết quả gì trong việc giải thích cơ chế của borrelidin?

Thí nghiệm nuôi cấy chủng nấm men nhạy cảm thuốc CCY333 với $400\text{ nM}$ borrelidin khi bổ sung $10\text{ mM}$ threonine cho thấy toàn bộ các gen sinh tổng hợp axit amin vốn bị cảm ứng mạnh bởi borrelidin đã trở về mức biểu hiện bình thường. Điều này chứng minh rằng việc bổ sung threonine ngoại bào giúp giải phóng tế bào khỏi tình trạng thiếu hụt axit amin giả tạo bằng cách vượt qua sự ức chế của borrelidin lên enzyme threonyl-tRNA synthetase (ThrRS).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Erin L. Eastwood đã ứng dụng phương pháp di truyền hệ gen hóa học kết hợp phân tích vi mảng DNA toàn hệ gen, thuật toán sinh học hệ thống MNI và các thử nghiệm sinh hóa động học enzyme để giải mã đích phân tử của hai nhóm hợp chất chống tăng sinh tế bào. Công trình đã làm sáng tỏ cơ chế tác động của macrolide tự nhiên borrelidin thông qua ức chế threonyl-tRNA synthetase và phát hiện con đường dịch mã Gcn4p không phụ thuộc Gcn2p trên mô hình Saccharomyces cerevisiae. Đồng thời, nghiên cứu đã phát hiện và xác thực hợp chất tổng hợp mới PTSB là chất ức chế cạnh tranh với NADPH trên enzyme thioredoxin reductase, đóng góp cơ sở khoa học cho việc phát triển các tác nhân điều biến redox trong điều trị ung thư.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BOSTON UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL OF ARTS AND SCIENCES Dissertation A CHEMICAL GENOMIC APPROACH TOWARDS DETERMINING THE MOLECULAR TARGET OF ANTI-PROLIFERATIVE COMPOUNDS by ERIN L., University of Massachusetts Dartmouth, 1999 Submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy 2007 UMI Number: 3246602 Copyright 2006 by Eastwood, Erin L. All rights reserved. INFORMATION TO USERS The quality of this reproduction is dependent upon the quality of the copy submitted. Broken or indistinct print, colored or poor quality illustrations and photographs, print bleed-through, substandard margins, and improper alignment can adversely affect reproduction.

In the unlikely event that the author did not send a complete manuscript and there are missing pages, these will be noted. Also, if unauthorized copyright material had to be removed, a note will indicate the deletion. ® UMI UMI Microform 3246602 Copyright 2007 by ProQuest Information and Learning Company. All rights reserved.

This microform edition is protected against unauthorized copying under Title 17, United States Code. ProQuest Information and Learning Company 300 North Zeeb Road P. Box 1346 Ann Arbor, MI 48106-1346 © Copyright by ERIN L. EASTWOOD 2006 Approved by First Reader Soe Scott E.

Assistant Professor of Chemistry and Pharmacology Second Reader ⁄⁄⁄⁄ zZ⁄Z Mark W. Associate Professor of Chemistry and Biomedical Engineering ACKNOWLEDGEMENTS I would like to thank the Boston University Department of Chemistry and the Center for Chemical Methodology and Library Development for this opportunity and for providing financial support. Elliott, and Dr. Pinghua Liu, thank you for serving on my committee and for your guidance.

I would like to thank my research advisor, Dr. Schaus, for giving me the chance and the confidence to grow as a scientist. Thank you for your support over the last five years. I would also like to thank the past and present Schaus group members including Josh Giguere, John Westbrook, Nolan McDougal, Melissa Dominguez, Sha Lou, Stacy Rodgen, Whitney Trevellini, Christiane Bode, Amal Ting, Jen Goss, Josh Bishop, Phil Moquist, Allison Wensley, Elise Birkett, Laura Kliman, Andrew Wojtovich, and Valerie Curtis for providing laughs as well as support in and outside the lab.

You made me smile on my worst days. I could not have asked for a better group of people to work with. I wish you all the best. I would like to thank our collaborators; Sarah Chobot and Mike Hamil! from the Elhott lab in the BU Chemistry Department for their help with the thioredoxin assays; Melissa Landon and Dr.

Sandor Vajda from the BU Bioinformatics Department for the GOLD studies; the Gardner and Collins labs at the Center for BioDynamics and iv Department of Biomedical Engineering at BU for the predictions of the target of PTSB using the MNI; and Dr. John Tullai from the Cooper lab in the Department of Biology at BU for his help with the western blot analysis. I would like to thank the office staff in the chemistry department for all of their hard work. A special thank you goes to Katinka Csigi for her help in my job search as well as her suggestions on my presentations and résumé.

You are a wonderful lady. I am very thankful to the CMLD faculty and staff, especially Paul Ferrari and Aruna Jain. Aaron Beeler, Dayle Acquilano, and Chris Singleton, thank you for the help with my library synthesis and data analysis. To my friends and family, I am so lucky to have such a strong support system.

Stacy, Christiane, Melissa, Jen, and Allison, I am grateful to have such a great set of friends that are also my colleagues. SuzAnn, we have been through a lot together. I do not know how I would have made it through those first years without you. Thank you for being the sister that I never had.

My family has always been an important part of my life. I would not be who I am without their love and support. Mom and Dad, words can not explain how much you both mean to me. I love you both very much.

Thank you for letting me find my own way and making me believe in myself. The support of my family extends beyond my parents.