mở đầu để bắt đầu phiên mã mARN (Messenger Acid Ribonuleic); bộ ba xen giữa làm gián đoạn quá trình phiên mã; tín hiệu bổ sung đuôi poly (A) vào mARN. Tầm quan trọng của trật tự các nucleotit là yếu tố quyết định loại Hb, bất kỳ sự thay đổi nào như mất, thêm, thay đổi nucleotit trên gen globin đều tạo ra 8 bất thường mARN từ đó gây nên các dạng bất thường của thalassemia ở mức độ sinh học phân tử [29],[30],[31],[32]. Gen -globin và đột biến gen -globin Hình 1. Cấu trúc gen β-globin Họ gen β-globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 11 (11p15.5) có độ dài 60 kilobases (kb) gồm có 5 gen chức năng, sắp xếp theo trật tự từ trái sang phải là ε / γG / γA / δ / β (hình 1.
Gen β-globin có 626 base pair (bp) tham gia mã hóa nằm trên 3 exon là exon 1 (142 bp), exon 2 (223 bp) và exon 3 (261 bp). Độ dài intron 1 là 130 bp và intron 2 là 850 bp. Gen β-globin có cơ chế điều hòa rất phức tạp, hoạt động ở mức độ đơn gen cũng như toàn bộ cụm gen [3],[6],[22],[30]. Đột biến gen β-globin bao gồm: β0-thalassemia là các đột biến làm mất chức năng gen β-globin nên không tổng hợp được chuỗi β-globin, ví dụ như: đột biến làm tạo thành bộ ba kết thúc sớm như Cd17, Cd35,.
β+-thalassemia là các đột biến làm giảm chức năng gen β-globin nên giảm tổng hợp chuỗi β-globin ở nhiều mức độ khác nhau, ví dụ như đột biến ở vùng khởi động: -28, -88,. Các biến thể Hb là đột biến điểm làm thay đổi một acid amin, dẫn đến tổng hợp nên các biến thể chuỗi β globin khác tạo Hb bất thường như HbE, HbCs, HbS,. 9 Hiện nay đã phát hiện trên 200 đột biến gen β-globin, chủ yếu là đột biến không mất đoạn. Đột biến tại gen β-globin chiếm trên 75% các đột biến trong cụm gen không -globin.
Các đột biến mang tính đặc trưng và phân bố khác nhau ở các vùng miền, dân tộc [5],[6],[30],[31]. Liên đoàn Thalassemia quốc tế đã tổng hợp các kiểu gen, kiểu hình của các đột biến và tính phổ biến của đột biến theo quần thể dân tộc, vùng miền (tại phụ lục số 2). Cơ chế một số dạng đột biến thường gặp của gen β-globin: - Đột biến điểm tại vùng khởi động (promoter): đột biến thay thế nucleotit tại vị trí TATA hoặc CACCC dẫn đến giảm tổng hợp chuỗi β-globin so với bình thường, gây β+-thalassemia, như đột biến: -90 (C > T), -88 (C > T), -28 (A > G), [3],[22],30],[33]. - Những đột biến vô nghĩa (nonsense mutations): sự thay thế một nucleotit trong exon có thể dẫn đến sự tạo thành một trong ba mã kết thúc (UAA, UAG hoặc UGA) làm cho việc dịch mã kết thúc sớm hơn so với bình thường và tạo sản phẩm β-globin không vững bền bị phá hủy ngay trong tế bào, gây bệnh β0-thalassemia như Cd17 (AAG > TAG), Cd35 (TAC > TAA) [3],[22],[31],[33].
- Đột biến tại những trình tự tín hiệu nối (splicing signals): Những đột biến ở vị trí cho nối GT hoặc vị trí nhận nối AG của intron gây cản trở việc nối exon, do đó không tạo được mARN β-globin nên gây β0-thalassemia như IVS1-1 (G > T) [30],[31],[33]. - Những đột biến tại vị trí 5, 6 của intron dẫn tới giảm khả năng nối ARN chính xác nhưng còn tổng hợp được chuỗi β-globin gây bệnh β+-thalassemia như IVS1-5 (G > T), IVS1-6 ( T > C) [30],[31],[33]. - Đột biến ở trong các exon: các đột biến ở exon luôn tạo ra các bất thường bản sao mARN nên gây ra β+-thalassemia như Cd26 (GAG >AAG) tạo HbE [30],[31],[33]. 10 - Đột biến tại vị trí gắn đuôi poly A: vị trí AATAAA tại vùng không dịch mã là vị trí gắn poly Adenin cần thiết cho mARN di chuyển từ nhân ra tế bào chất để tham gia vào quá trình dịch mã tạo sản phẩm protein.
Các đột biến điểm xảy ra tại vị trí AATAAA sẽ gây β+-thalassemia, như: AATAAA → AATGAA, AATAAA → CATAAA [30],[31],[33]. - Những đột biến khung đọc xảy ra ở các exon: đột biến thêm vào hoặc mất đi một hoặc vài nucleotit, hoặc một đoạn có dẫn đến thay đổi khung đọc mã di truyền làm thay đổi sản phẩm β-globin, như đột biến: Cd8/9 (+G), Cd41/42 (–TTCT), Cd71/72 (+A) gây β0-thalassemia [30],[31],[33]. Các đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp ở người Việt Nam [34],[35],[36] STT Vị trí đột biến Kiểu đột biến Kiểu gen 1 Vùng khởi động -28 (A > G) β+ Đvùột 2 Vùng kết nối trên intron I IVS1-1 (G > T) β0 3 Vùng kết nối trên intron I IVS1-5 (G > C) β+ 4 Vùng kết nối trên intron II IVS2-654 β0/β+ 5 Đột biến vị trí cắt ẩn trên exon 1 Cd26 (GAG > AAG) β+ (Glu > Lys, HbE) 6 Đột biến vô nghĩa Cd17 (AAG > TAG) β0 7 Đột biến khung đọc trên exon 2 Cd41/42 (-TTCT) β0 8 Đột biến khung đọc Cd71/72 (+ A) β+ 9 Đột biến khung đọc Cd95 (+ A) β+ 11 1. Gen α-globin và đột biến gen α-globin Hình 1.
Cấu trúc gen α-globin Họ gen α-globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16p13.3) gồm 3 gen chức năng là δ, α1, α2 và 4 gen giả là Ψδ1, Ψα1, Ψα2, θ (hình 1. Gen α1 có chiều dài 840 bp và gen α2 có chiều dài 830 bp. Số lượng chuỗi α- globin được tổng hợp phụ thuộc vào số gen α-globin hoạt động [3],[6],[29]. Mức độ phiên mã của gen α2 gấp 2 đến 3 lần so với gen α1 [31],[37],[38].
Khoảng 40 kb phía trước của cụm gen α globin là một khu vực được gọi là HS-40. Khu vực này có nhiều vị trí nhạy cảm với ADNase và liên quan đến các yếu tố phiên mã. Tính toàn vẹn của HS-40 là rất cần thiết cho sự hoạt động của gen α-globin, nếu bị mất một đoạn trong phần đó có thể làm cả đoạn gen α-globin sau đó không hoạt động được. Ngoài cấu trúc gen và trình tự của gen α-globin, còn có một số yếu tố phiên mã gen cũng rất quan trọng.
Các yếu tố điều hòa hoạt động gen α-globin bằng cách gắn vào promoter gen α-globin và/hoặc với vị trí tương tác protein gắn ADN tại vùng HS-40 hoặc cấu trúc nhiễm sắc thể (ví dụ như gen ATRX trên nhiễm sắc thể 13) [29]. Vì thế, những trường hợp mất đoạn vùng HS-40 cũng gây ra α-thalassemia, trong khi cả 2 gen α-globin đều còn nguyên vẹn [29],[31]. Đột biến gây α-thalassemia Đột biến gây bệnh -thalassemia bao gồm đột biến mất đoạn và đột biến điểm. Đột biến mất đoạn có 2 dạng là đột biến đoạn lớn làm mất cả 2 gen α và 12 đột biến đoạn nhỏ làm mất 1 gen α.
Hiện nay đã phát hiện được trên 300 đột biến, trong đó đột biến mất đoạn là chủ yếu (khoảng 90%) [29],[39]. a) Đột biến α+-thalassemia: là đột biến làm mất 1 gen α-globin trên 1 nhiễm sắc thể (kiểu gen: -α). Có một số kiểu đột biến α+-thalassemia, trong đó phổ biến nhất là đột biến mất đoạn 3. b) Đột biến α0-thalassemia: là đột biến mất cả 2 gen α trên 1 nhiễm sắc thể (kiểu gen: --).
Hiện nay đã xác định được khoảng 50 loại đột biến mất đoạn 2 gen globin gồm mất 1 phần gen trên cả 2 gen α, mất hoàn toàn cả 2 gen α hoặc mất cả 2 gen α và gen δ làm mất hoàn toàn quá trình tổng hợp chuỗi α-globin [29]. Phổ biến các đột biến α0-thalassemia ở khu vực Đông Nam Á là --SEA, --THAI, --FIL, ở khu vực Địa Trung Hải là --MED. Đồng hợp tử các đột biến α0-thalassemia gây Hb Bart’s, dị hợp tử α0-thalassemia với α+- thalassemia gây ra HbH [29],[31]. c) Đột biến không mất đoạn: là các đột biến tại 1 hoặc vài nucleotit làm tổng hợp ra các biến thể chuỗi α-globin (kiểu gen: αTα hoặc αT).
Các đột biến điểm chủ yếu ở trong vùng HS-40 và trong gen α1, α2. Hiện nay người ta đã xác định được 69 đột biến điểm liên quan đến biểu hiện của gen α [29]. Điển hình trong nhóm đột biến điểm là đột biến thay thế T thành C ở bộ 3 kết thúc làm bộ 3 kết thúc dịch mã từ TAA chuyển thành CAA (mã hóa cho acid amin glutamin) vì vậy ribosom tiếp tục dịch mã đến khi nó chạm vào mã kết thúc tiếp theo trong khung đọc. Kết quả 1 chuỗi α-globin bị kéo dài thêm 31 acid amin so với phân tử 141 acid amin của chuỗi α-globin ban đầu tạo nên Hb Constant Spring (HbCs), đây là đột biến điểm phổ biến nhất ở Đông Nam Á (chiếm khoảng 4% các đột biến α-globin) [29],[31].
Ngoài ra, còn có các đột biến khác làm tổng hợp các protein bất thường như đột biến α2 codon 125 (T > C) tạo Hb Quong Sze (Qs), đột biến α2 codon 142 (A > T) tạo Hb Pakse cũng gặp ở người Đông Nam Á [29],[31]. Các phương pháp xác định đột biến gen globin thông dụng Hiện nay có nhiều phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện đột biến gen globin. Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm khác nhau trong phát hiện các loại đột biến, việc lựa chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào các phòng xét nghiệm [7]. Phương pháp PCR cách đoạn (Gap-PCR) Nguyên lý kỹ thuật: Kỹ thuật Gap-PCR sử dụng 1 mồi xuôi và 1 mồi ngược gắn ở hai bên ranh giới của vùng ADN đứt gãy.
Với alen bình thường, khoảng cách giữa 2 mồi quá lớn nên không hình thành được sản phẩm ADN. Với alen có đột biến, khoảng cách này đủ ngắn để 2 mồi tạo nên đoạn ADN sản phẩm. Các sản phẩm PCR được điện di và so sánh kích thước với thang chuẩn ADN và các băng của chứng dương để xác định đột biến của mẫu. Ưu điểm: Kỹ thuật đơn giản, nhanh, chi phí thấp.
Có thể sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi (Multiplex gap – PCR) để chẩn đoán đồng thời nhiều đột biến. Nhược điểm: Chỉ phát hiện được những đột biến mất đoạn đã biết trước trình tự vùng ADN đứt gãy. Ứng dụng: để chẩn đoán các đột biến mất đoạn α-thalassemia như đột biến: --SEA, --THAI, --MED, --20.2 và một vài mất đoạn β thalassemia như -thalassemia, HPFH,. Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn đầu dò phụ thuộc kết nối (Multiplex ligation dependent probe amplification – MLPA): Nguyên lý: Kỹ thuật này sử dụng các đoạn dò (probe) có khả năng lai với phân tử ADN đích đặc hiệu.
Mỗi probe gồm 2 chuỗi oligonucleotide có kích thước khác nhau (đoạn dò xuôi và đoạn dò ngược). Các probe sẽ gắn đặc hiệu vào phân tử ADN đích, sau đó enzyme ligase được thêm vào để nối hai 14 đoạn dò này lại với nhau tạo thành đoạn dò hoàn chỉnh và được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được đánh dấu huỳnh quang.