Nghiên cứu khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong hệ tiêu hóa của con người

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Trang
• Người hướng dẫn: PTS. Nguyễn Văn A
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Khả năng phân giải muối mật của vi khuẩn Lactobacillus từ hệ tiêu hóa người
• Loại tài liệu: Luận văn tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS
• 1.1.1. Vị trí, đặc điểm chung
• 1.1.2. Chức năng sinh học và các đặc điểm probiotic của vi khuẩn Lactobacillus
• 1.1.3. Ứng dụng của Lactobacillus
• 1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME THỦY PHÂN MUỐI MẬT – BILE SALT HYDROLASE (BSH)
• 1.2.1. Sự hình thành và chuyển hóa của mật trong đường tiêu hóa
• 1.2.2. Enzyme thủy phân muối mật Bile salt hydrolase
• 1.3. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT HIỆN NAY
• 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới
• 1.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
• 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 2.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2.2. Mẫu vật nghiên cứu
• 2.2.3. Hóa chất và môi trường
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Lactobacillus
• 2.3.2. Phương pháp làm sạch và giữ chủng vi khuẩn Lactobacillus
• 2.3.3. Phương pháp xác định đặc tính sinh học và đặc điểm probiotic của các chủng vi khuẩn Lactobacillus
• 2.3.4. Xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus
• 2.3.5. Xác định khả năng ức chế sinh trưởng trên vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus
• 2.3.6. Định danh vi khuẩn
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTOBACILLUS
• 3.2. KẾT QUẢ LÀM SẠCH VI KHUẨN LACTOBACILLUS
• 3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM PROBIOTIC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS
• 3.3.1. Kết quả xác định hình thái tế bào vi khuẩn
• 3.3.2. Kết quả xác định khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus
• 3.3.3. Kết quả xác định khả năng chịu pH axit và muối mật của các chủng được chọn lọc
• 3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS
• 3.4.1. Khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong môi trường nuôi cấy
• 3.4.2. Kết quả xác định sự có mặt của các gen bsh
• 3.5. KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TRƯỞNG TRÊN VI KHUẨN GÂY BỆNH S.
• 3.6. ĐỊNH DANH VI KHUẨN
• 3.6.1. Kết quả tách DNA tổng số
• 3.6.2. Kết quả PCR
• 3.6.3. Kết quả giải trình tự
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

I. Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus

Vi khuẩn Lactobacillus là một chi vi khuẩn Gram dương, hình que, sống kỵ khí tùy tiện hoặc yếm khí, không sinh bào tử. Chúng có mặt từ dạ dày đến ruột già của người và động vật, với số lượng thay đổi tùy thuộc vào loài và vị trí trong ruột. Lactobacillus đóng vai trò quan trọng trong lên men thực phẩm và có nhiều lợi ích cho sức khỏe, bao gồm điều trị và phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng đường ruột. Chúng có khả năng chịu đựng điều kiện khắc nghiệt của môi trường sống, giúp tăng cường khả năng miễn dịch và chống lại các tác nhân gây bệnh. Nghiên cứu cho thấy, Lactobacillus có thể làm giảm sự tái phát của bệnh tiêu chảy và hỗ trợ điều trị các bệnh viêm ruột. Sự hiện diện của chúng trong đường tiêu hóa chứng tỏ khả năng chống chịu muối mật và pH thấp, nhờ vào việc sản xuất enzyme thủy phân muối mật BSH.

1.1 Chức năng sinh học và các đặc điểm probiotic

Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng phân giải protein và lactose, giúp cơ thể vật chủ tiêu hóa dễ dàng hơn. Chúng sản sinh enzyme proteinase, chuyển hóa protein thành peptide ngắn, và enzyme β-galactosidases, chuyển hóa lactose thành glucose và galactose. Axit lactic được sản xuất từ quá trình này có nhiều lợi ích sinh lý, như tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thụ dinh dưỡng. Nghiên cứu cho thấy, Lactobacillus có thể làm giảm cholesterol trong máu thông qua hoạt tính enzyme thủy phân muối mật, đồng hóa cholesterol và sản xuất các hợp chất ức chế enzyme HMG-CoA reductase. Những tác dụng này cho thấy tiềm năng của Lactobacillus trong việc cải thiện sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật.

II. Tổng quan về enzyme thủy phân muối mật Bile Salt Hydrolase BSH

Enzyme Bile Salt Hydrolase (BSH) đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa và chuyển hóa muối mật. Muối mật được tổng hợp từ cholesterol trong gan và có vai trò nhũ tương hóa chất béo, giúp tăng cường sự tiếp xúc giữa lipase và lipid. BSH có khả năng cắt đứt liên kết peptide của axit mật tự do với glycine hoặc taurine, dẫn đến sự hình thành axit mật tự do không thể tái hấp thu qua ruột. Điều này giúp giảm lượng cholesterol trong máu, từ đó ngăn ngừa các bệnh liên quan đến tim mạch. Nghiên cứu cho thấy, các chủng Lactobacillus có khả năng sản xuất BSH, góp phần vào việc giảm cholesterol và cải thiện sức khỏe đường tiêu hóa.

2.1 Sự hình thành và chuyển hóa của mật trong đường tiêu hóa

Mật là dịch lỏng chứa axit mật, cholesterol và các thành phần khác, được lưu giữ trong túi mật và đổ vào tá tràng khi ăn. Axit mật chiếm khoảng 50% thành phần hữu cơ của mật và có vai trò thiết yếu trong việc tiêu hóa chất béo. Khi muối mật tiếp xúc với vi khuẩn đường ruột, enzyme BSH sẽ loại bỏ gốc glycine hoặc taurine, giúp giảm lượng cholesterol trong cơ thể. Việc sản xuất BSH từ các chủng Lactobacillus không chỉ giúp cải thiện sức khỏe đường tiêu hóa mà còn có tác dụng tích cực trong việc phòng ngừa các bệnh lý liên quan đến cholesterol cao.

III. Khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus

Khả năng phân giải muối mật của các chủng Lactobacillus được xác định thông qua các thí nghiệm trong môi trường nuôi cấy. Các nghiên cứu cho thấy, các chủng Lactobacillus có khả năng sống sót và phát triển trong môi trường có nồng độ muối mật cao và pH thấp. Kết quả cho thấy, các chủng này không chỉ có khả năng phân giải muối mật mà còn sản xuất enzyme BSH, giúp giảm cholesterol trong máu. Việc xác định sự có mặt của các gen bsh trong các chủng Lactobacillus cũng chứng minh tiềm năng ứng dụng của chúng trong việc phát triển các sản phẩm probiotic có lợi cho sức khỏe.

3.1 Kết quả xác định khả năng phân giải muối mật

Các thí nghiệm cho thấy, các chủng Lactobacillus có khả năng phân giải muối mật trong môi trường nuôi cấy, với tỷ lệ sống sót cao khi tiếp xúc với muối mật. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy sự hiện diện của các gen bsh, chứng minh khả năng sản xuất enzyme BSH của các chủng này. Những phát hiện này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các chế phẩm probiotic từ Lactobacillus, có thể giúp cải thiện sức khỏe đường tiêu hóa và giảm nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến cholesterol.

Tổng quan nghiên cứu

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tính đến năm 2015, trên toàn cầu có khoảng 2,1 tỷ người thừa cân và béo phì, gây ra nhiều bệnh lý chuyển hóa mãn tính như tiểu đường type 2, gan nhiễm mỡ, tăng huyết áp, ung thư và đặc biệt là bệnh tim mạch. Trong đó, bệnh mạch vành chiếm tỷ lệ tử vong cao nhất, liên quan mật thiết đến nồng độ cholesterol trong máu. Số liệu cho thấy, giảm 1% cholesterol máu có thể giảm 3% nguy cơ mắc bệnh mạch vành. Hệ vi sinh vật đường ruột với khoảng 10^14 tế bào vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát trọng lượng cơ thể và chuyển hóa. Chi Lactobacillus, một nhóm vi khuẩn lactic, được biết đến với khả năng sinh enzyme thủy phân muối mật (BSH), góp phần làm giảm cholesterol thông qua cơ chế chuyển hóa muối mật. Nghiên cứu này nhằm xác định khả năng phân giải muối mật và các đặc điểm probiotic của các chủng Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa người tại Hà Nội, góp phần phát triển các sản phẩm probiotic hỗ trợ sức khỏe tim mạch và chuyển hóa lipid.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

• Lý thuyết về hệ vi sinh vật đường ruột: Hệ vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa và sức khỏe con người, đặc biệt là trong điều hòa cholesterol và các bệnh chuyển hóa.
• Mô hình enzyme thủy phân muối mật (BSH): Enzyme BSH do Lactobacillus sản xuất xúc tác thủy phân muối mật liên hợp, tạo ra axit mật tự do ít tan, dễ bị đào thải qua phân, từ đó làm giảm cholesterol huyết thanh.
• Khái niệm probiotic: Vi khuẩn sống có lợi, giúp cân bằng hệ vi sinh đường ruột, tăng cường miễn dịch và hỗ trợ điều trị các bệnh tiêu hóa.
• Khả năng chịu pH axit và muối mật: Yếu tố quyết định khả năng tồn tại và hoạt động của vi khuẩn probiotic trong môi trường đường tiêu hóa.
• Khả năng sản xuất hydrogen peroxide (H2O2): H2O2 có tác dụng kháng khuẩn, giúp Lactobacillus ức chế vi khuẩn gây bệnh như Staphylococcus aureus.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 115 chủng Lactobacillus được phân lập từ mẫu phân người khỏe mạnh tại Hà Nội.
• Phương pháp phân tích:
  • Phân lập và làm sạch vi khuẩn trên môi trường MRS pH 6.2 trong điều kiện kỵ khí.
  • Xác định đặc tính sinh học qua nhuộm Gram, thử catalase, đo nồng độ H2O2 bằng phương pháp HRP/TMB.
  • Thử nghiệm khả năng chịu pH axit (pH 2 và 3) và muối mật (0,3% Oxgall).
  • Xác định khả năng phân giải muối mật bằng phương pháp đĩa thạch có bổ sung muối mật và đo vòng sáng.
  • Phát hiện gen bsh1, bsh2, bsh3, bsh4 bằng PCR và giải trình tự gen 16S rRNA để định danh chủng.
  • Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng vi khuẩn gây bệnh S. aureus bằng phương pháp khuếch tán dịch nuôi.
• Timeline nghiên cứu: Tiến hành trong vòng 12 tháng tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

• Phân lập và làm sạch: 115 chủng Lactobacillus được phân lập thành công trên môi trường MRS, với khuẩn lạc đồng nhất, hình que, Gram dương, catalase âm tính.
• Khả năng sinh H2O2: Chủng Lac.VFE-14 sản xuất lượng H2O2 cao nhất đạt 2,183 mM, tiếp theo là Lac.VFE-08 (2,081 mM) và Lac.VFE-04 (2,067 mM), cao hơn nhiều so với các chủng Lactobacillus đã được báo cáo trước đây.
• Khả năng chịu pH axit và muối mật: Tỷ lệ sống sót sau 3 giờ ủ ở pH 2 và 3 lần lượt đạt trên 85% và 95% cho các chủng Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14. Khả năng sinh trưởng trong môi trường có 0,3% muối mật đạt 90-99%, trong đó Lac.VFE-14 có tỷ lệ sống sót cao nhất 99%.
• Khả năng phân giải muối mật: Các chủng Lactobacillus phân lập có khả năng thủy phân bốn loại muối mật chính (sodium glycocholate, sodium deoxyglycocholate, sodium taurocholate, sodium taurodeoxycholate) với vòng sáng rõ ràng trên đĩa thạch.
• Phát hiện gen bsh: Các gen bsh1, bsh2, bsh3 và bsh4 được phát hiện trong các chủng có hoạt tính BSH cao, chứng minh khả năng sinh enzyme thủy phân muối mật.
• Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh: Dịch nuôi của các chủng Lactobacillus có khả năng ức chế sự sinh trưởng của S. aureus, với vòng kháng khuẩn rõ rệt sau 48 giờ nuôi cấy.

Thảo luận kết quả

Khả năng sinh H2O2 cao của các chủng Lactobacillus phân lập cho thấy tiềm năng kháng khuẩn mạnh mẽ, hỗ trợ cân bằng hệ vi sinh đường ruột và ngăn ngừa vi khuẩn gây bệnh. Khả năng chịu pH axit và muối mật vượt trội giúp các chủng này tồn tại và phát triển hiệu quả trong môi trường đường tiêu hóa người. Hoạt tính BSH cao và sự hiện diện của các gen bsh chứng minh cơ chế giảm cholesterol qua thủy phân muối mật, phù hợp với các nghiên cứu quốc tế. Khả năng ức chế S. aureus góp phần bảo vệ sức khỏe đường ruột, giảm nguy cơ nhiễm trùng. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh nồng độ H2O2, tỷ lệ sống sót ở các pH và muối mật, cũng như kích thước vòng kháng khuẩn để minh họa hiệu quả probiotic của các chủng.

Đề xuất và khuyến nghị

• Phát triển sản phẩm probiotic: Tận dụng các chủng Lactobacillus có hoạt tính BSH cao để sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ giảm cholesterol, cải thiện sức khỏe tim mạch trong vòng 2 năm, do các công ty dược phẩm và thực phẩm chức năng thực hiện.
• Nghiên cứu sâu về cơ chế: Tiếp tục nghiên cứu cơ chế phân giải muối mật và tác động lên chuyển hóa lipid ở mô hình động vật và lâm sàng trong 3 năm tới, do các viện nghiên cứu sinh học và y học đảm nhiệm.
• Ứng dụng trong chăn nuôi: Áp dụng các chủng Lactobacillus làm probiotic trong chăn nuôi để tăng cường miễn dịch, giảm sử dụng kháng sinh, nâng cao năng suất vật nuôi trong 1-2 năm, do các doanh nghiệp nông nghiệp thực hiện.
• Giáo dục và truyền thông: Tổ chức các chương trình đào tạo, hội thảo về lợi ích của probiotic Lactobacillus trong chăm sóc sức khỏe và phòng ngừa bệnh tim mạch cho cộng đồng và cán bộ y tế trong 1 năm, do các cơ quan y tế và giáo dục phối hợp thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành vi sinh, công nghệ sinh học: Nắm bắt kiến thức về phân lập, đặc tính và ứng dụng vi khuẩn Lactobacillus trong y học và công nghiệp.
• Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng và probiotic: Tìm hiểu tiềm năng phát triển sản phẩm mới dựa trên các chủng Lactobacillus có hoạt tính BSH cao.
• Ngành y tế và dinh dưỡng: Áp dụng kiến thức về probiotic trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh chuyển hóa, đặc biệt là bệnh tim mạch và rối loạn lipid máu.
• Ngành chăn nuôi và nông nghiệp: Ứng dụng probiotic Lactobacillus để cải thiện sức khỏe vật nuôi, giảm thiểu sử dụng kháng sinh và tăng năng suất.

Câu hỏi thường gặp

1. Lactobacillus có vai trò gì trong việc giảm cholesterol?
   Lactobacillus sản xuất enzyme BSH thủy phân muối mật, làm giảm hấp thu cholesterol và tăng đào thải muối mật qua phân, từ đó giảm cholesterol huyết thanh.

2. Khả năng chịu pH axit và muối mật quan trọng thế nào?
   Khả năng này giúp Lactobacillus tồn tại và phát triển trong môi trường đường tiêu hóa, đảm bảo hiệu quả probiotic khi sử dụng đường uống.

3. Làm thế nào để xác định hoạt tính BSH của Lactobacillus?
   Hoạt tính BSH được xác định bằng phương pháp đĩa thạch có bổ sung muối mật, đo vòng sáng xung quanh khuẩn lạc và phát hiện gen bsh qua PCR.

4. Hydrogen peroxide do Lactobacillus sản xuất có tác dụng gì?
   H2O2 có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh như Staphylococcus aureus, giúp cân bằng hệ vi sinh và bảo vệ sức khỏe đường ruột.

5. Ứng dụng thực tế của các chủng Lactobacillus này là gì?
   Các chủng có thể được sử dụng trong sản xuất probiotic hỗ trợ giảm cholesterol, trong chăn nuôi để tăng cường miễn dịch, và trong công nghiệp thực phẩm lên men.

Kết luận

• Đã phân lập thành công 115 chủng Lactobacillus từ mẫu phân người khỏe mạnh tại Hà Nội với đặc tính probiotic nổi bật.
• Các chủng có khả năng sinh H2O2 cao, chịu được pH axit và muối mật, phù hợp với môi trường đường tiêu hóa.
• Hoạt tính thủy phân muối mật (BSH) và sự hiện diện của gen bsh được xác nhận, chứng minh tiềm năng giảm cholesterol.
• Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh S. aureus góp phần bảo vệ sức khỏe đường ruột.
• Đề xuất phát triển sản phẩm probiotic và nghiên cứu ứng dụng sâu rộng trong y học và nông nghiệp trong các giai đoạn tiếp theo.

Hãy tận dụng kết quả nghiên cứu này để phát triển các giải pháp probiotic hiệu quả, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng và phát triển bền vững ngành công nghệ sinh học.