Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn., thuộc họ Thầu dầu - Euphorbiaceae) là loài thực vật nhiệt đới phân bố rộng rãi tại châu Á, bao gồm Việt Nam, Ấn Độ và Thái Lan. Trong y học cổ truyền Việt Nam và Ấn Độ, hầu hết các bộ phận của cây đều được sử dụng làm thuốc: quả dùng trị cảm mạo, tiêu chảy, bảo vệ gan; rễ và vỏ thân dùng chữa viêm ruột, tăng huyết áp, phù thũng; lá dùng nấu nước trị lở loét. Dưới góc độ dược lý học hiện đại, các công trình quốc tế đã chứng minh các nhóm hoạt chất từ Me rừng sở hữu hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, bảo vệ gan, kháng virus (HSV-1, HSV-2, TMV) và gây độc tế bào ung thư.

Mặc dù thành phần hóa học của quả, lá và rễ cây Me rừng đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới, tại Việt Nam các công trình nghiên cứu về thành phần hóa thực vật của loài này còn tương đối hạn chế, đặc biệt chưa có công trình nào khảo sát trên bộ phận vỏ thân. Vì vậy, đề tài khóa luận tập trung nghiên cứu thành phần hóa học của vỏ thân cây Me rừng nhằm cung cấp dữ liệu khoa học về các hợp chất tự nhiên, góp phần làm sáng tỏ cơ sở hóa học cho các tác dụng chữa bệnh dân gian và bổ sung tư liệu cho kho tàng dược liệu Việt Nam.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài gồm:

  1. Chiết xuất và điều chế các loại cao phân đoạn từ bột vỏ thân cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.).
  2. Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng để cô lập các hợp chất hữu cơ tinh khiết từ cao phân đoạn ethyl acetate.
  3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được thông qua các phương pháp phổ nghiệm cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D-NMR, kết hợp đối chiếu tài liệu tham khảo.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Mẫu vỏ thân cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.), được TS. Phạm Văn Ngọt (Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh) định danh thực vật học.
  • Không gian: Mẫu được thu hái tại xã Tân Tiến, thị xã La Gi, tỉnh Bình Thuận; quá trình thực nghiệm chiết tách và xử lý mẫu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh.
  • Thời gian: Mẫu thu hái vào tháng 5 năm 2014; nghiên cứu phổ nghiệm và hoàn thành khóa luận vào tháng 5 năm 2018.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu dựa trên cơ sở hóa học các hợp chất thiên nhiên phân lập từ chi Phyllanthus, bao gồm các nhóm chất: alkaloid (zeatin nucleotide, zeatin riboside), benzenoid (các dẫn xuất galloyl mucic acid, emblirol A-B), coumarin (ellagic acid), flavonoid (quercetin, kaempferol glucosides), tannin (isocorilagin, phyllanemblinins), terpenoid và phytosterol.

Quy trình thực nghiệm kết hợp các phương pháp chiết tách và phổ nghiệm cấu trúc:

  • Hóa chất và chất hấp phụ: Sử dụng silica gel pha thường (cỡ hạt 40–63 µm của Merck và 230–400 µm của Himedia), silica gel pha đảo RP-18 (Merck) cho sắc ký cột (SKC). Bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel DC-Alufolien 60 F254 và RP-18 F254 (Merck) dùng cho sắc ký lớp mỏng (SKLM). Dung môi kỹ thuật được tinh chế gồm n-hexane, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol, acid acetic và nước cất. Thuốc thử phát hiện vết là dung dịch $H_2SO_4$ 20% kết hợp hơ nóng và đèn tử ngoại bước sóng 254 nm, 365 nm.
  • Phương pháp phân lập: Sử dụng phương pháp ngâm dầm chiết kiệt với ethanol $96^\circ$, chiết lỏng - lỏng phân bố theo độ phân cực dung môi, và sắc ký cột silica gel pha thường giải ly bằng hệ dung môi gradient tăng dần độ phân cực (n-hexane : ethyl acetate, ethyl acetate : methanol, n-hexane : acetone, chloroform : methanol, chloroform : acetone : acid acetic).
  • Phương pháp xác định cấu trúc: Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân bao gồm phổ 1D ($^1\text{H}$-NMR tần số 500 MHz, $^{13}\text{C}$-NMR tần số 125 MHz, DEPT) và phổ 2D (HSQC, HMBC, $^1\text{H}$-$^1\text{H}$ COSY) trên máy Bruker Avance tại Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh) và Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng (Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội).

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày tổng quan về giá trị sử dụng của các loài thuộc chi Phyllanthus, lý do lựa chọn vỏ thân cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) tại Bình Thuận, cùng các mục tiêu, nhiệm vụ trọng tâm của khóa luận tốt nghiệp.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

  • Đặc điểm thực vật cây Me rừng: Mô tả hình thái thực vật của cây gỗ nhỏ cao 2–7 m, lá nhỏ hai dãy giống lá kép lông chim, hoa đơn tính cùng gốc, quả hình cầu nhiều thịt. Tên gọi dân gian: mác kham (Tày), diều cam (Dao), xì xà liên (K'Ho), me quả tròn, chùm ruột núi.
  • Dược tính theo y học cổ truyền và hiện đại: Tổng kết các công dụng trị bệnh đường ruột, gan mật, hạ men gan, hạ huyết áp, hoạt tính kháng oxy hóa ($IC_{50} = 1{,}07\text{ mg/mL}$ theo DPPH), khả năng ức chế vi khuẩn gram âm (E. typhi), gram dương (S. subtilis), vi nấm (C. niger), kháng virus HSV-1, HSV-2, virus khảm thuốc lá (TMV), và tác dụng ức chế tế bào ung thư vú, ung thư cổ tử cung (HeLa).
  • Tổng quan thành phần hóa học: Liệt kê và hệ thống hóa cấu trúc của 75 hợp chất đã từng được công bố trên các bộ phận khác nhau của loài Phyllanthus emblica.

Chương 2: Thực nghiệm

Chi tiết hóa quá trình xử lý 16,2 kg bột vỏ thân khô, ngâm dầm với ethanol thu được 350,5 g cao ethanol thô. Tiến hành chiết lỏng - lỏng thu được:

  • Cao n-hexane: 11,5 g
  • Cao ethyl acetate: 85,4 g
  • Dịch chiết còn lại: 224 g

Quy trình phân lập từ 85,4 g cao ethyl acetate qua nhiều giai đoạn sắc ký cột silica gel:

  • Cột cấp 1: Giải ly hệ Hexane : Ethyl Acetate ($70%\rightarrow 100%$ EA) và Ethyl Acetate : Methanol ($5%\rightarrow 100%$ Me), thu được 9 phân đoạn chính ($\text{EA1}\rightarrow \text{EA9}$).
  • Cột cấp 2 trên phân đoạn EA4 (4,6 g): Thu được 8 phân đoạn phụ ($\text{EA4.1}\rightarrow \text{EA4.8}$).
  • Tinh chế phân đoạn EA4.6: Thu nhận hợp chất PEE04 (5,8 mg) dạng hình kim màu trắng.
  • Tinh chế phân đoạn EA4.3: Thu nhận hợp chất PA1 (5,9 mg) dạng bột màu trắng.
  • Tinh chế phân đoạn EA4.7: Thu nhận hợp chất PA2 (10,9 mg) dạng bột màu trắng.
Bột vỏ thân khô (16,2 kg) -> Ngâm dầm EtOH -> Cao thô (350,5 g)

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này tập trung biện luận phổ chi tiết cho 3 hợp chất tinh khiết cô lập được:

  • Hợp chất PEE04 (Periplogenin): Dạng hình kim trắng; vết SKLM có màu xanh khi hiện hình bằng dung dịch $H_2SO_4$ 20%. Phổ $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT và HSQC xác nhận 23 carbon gồm 2 nhóm methyl ($\delta_C\text{ 16,0}$ và $24{,}0$), 10 nhóm methylene, 5 nhóm methine và 6 carbon bậc bốn. Điểm đặc trưng là tín hiệu vòng lactone không no $\alpha,\beta$ ở $\delta_C\text{ 174,8}$ (C-20) và $\delta_C\text{ 117,8}$ (C-22), tín hiệu olefin $\delta_H\text{ 5,90}$ (1H, s, H-22), các carbon mang oxy tại $\delta_C\text{ 68,0}$ (C-3), $\delta_C\text{ 85,6}$ (C-5), $\delta_C\text{ 85,5}$ (C-14). Tương quan HMBC từ proton H-17 ($\delta_H\text{ 2,78}$) đến C-16, C-20, C-21 khẳng định vòng lactone gắn tại vị trí C-17 của khung steroid pregnane. Dữ liệu phổ hoàn toàn tương thích với periplogenin.
  • Hợp chất PA1 (16-Dehydropregnenolone): Dạng bột trắng; vết SKLM màu vàng nâu với $H_2SO_4$ 20%. Phổ $^{13}\text{C}$-NMR thể hiện 21 carbon, gồm 1 nhóm carbonyl ketone liên hợp tại $\delta_C\text{ 197,0}$ (C-20), 4 carbon olefin gồm $\delta_C\text{ 141,6}$ (C-5), $\delta_C\text{ 121,2}$ (C-6), $\delta_C\text{ 144,8}$ (C-16), $\delta_C\text{ 155,6}$ (C-17), nhóm methyl ketone tại $\delta_C\text{ 27,3}$ và $\delta_H\text{ 2,39}$ (3H, s, H-21), nhóm oxymethine tại $\delta_C\text{ 71,9}$ (C-3). Tương quan HMBC giữa H-21 với C-20 và C-17, cùng tương quan giữa proton H-16 ($\delta_H\text{ 6,71}$) với C-20 xác định liên kết đôi tại vị trí C16–C17 và nhóm acetyl tại C-17. Kết quả phổ đối chiếu hoàn toàn phù hợp với 16-dehydropregnenolone.
  • Hợp chất PA2 (Phyllanthol): Dạng bột trắng; không hấp thụ UV, cho vết màu cam nhạt khi thử bằng $H_2SO_4$ 20%. Khung triterpenoid ursane với 30 carbon trên phổ $^{13}\text{C}$-NMR, bao gồm 7 nhóm methyl, 1 carbon oxymethine tại $\delta_C\text{ 79,2}$ (C-3), và đặc biệt là tín hiệu vòng cyclopropane tại C13–C14 thể hiện qua carbon methylene ở $\delta_C\text{ 13,8}$ (C-27) cùng proton tương ứng ở vùng từ trường rất cao $\delta_H\text{ 0,00}$ (d, $J=4{,}0\text{ Hz}$) và $\delta_H\text{ 0,48}$ (d, $J=4{,}0\text{ Hz}$). Tương quan HMBC từ proton cyclopropane đến các carbon bậc bốn xung quanh xác nhận cấu trúc phyllanthol.

Chương 4: Kết luận và đề xuất

Tổng kết toàn bộ kết quả phân lập và định danh cấu trúc 3 hợp chất; đồng thời đề xuất kế hoạch nghiên cứu tiếp theo đối với các phân đoạn cao chưa khảo sát.

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp các hợp chất cô lập được từ vỏ thân cây Me rừng

Ký hiệu mẫu Khối lượng thu nhận Trạng thái cảm quan Nhóm hợp chất Tên khoa học của hợp chất Tính mới ghi nhận
PEE04 5,8 mg Dạng tinh thể hình kim, màu trắng Cardenolide / Steroid khung pregnane Periplogenin Lần đầu tiên cô lập từ loài P. emblica và chi Phyllanthus
PA1 5,9 mg Dạng bột, màu trắng Steroid khung pregnane 16-Dehydropregnenolone Lần đầu tiên cô lập từ loài P. emblica và chi Phyllanthus
PA2 10,9 mg Dạng bột, màu trắng Triterpene khung ursane Phyllanthol Lần đầu tiên cô lập từ vỏ thân loài P. emblica

Đóng góp khoa học của đề tài

  • Đây là công trình thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam khảo sát có hệ thống về thành phần hóa học trên bộ phận vỏ thân của cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.).
  • Đã phân lập thành công và xác định chính xác cấu trúc hóa học của 3 hợp chất tinh khiết có độ tinh khiết cao.
  • Cả 3 hợp chất đều lần đầu tiên được tìm thấy trong vỏ thân cây Me rừng, trong đó có 2 hợp chất steroid (periplogenin và 16-dehydropregnenolone) lần đầu tiên được phát hiện hiện diện trong toàn bộ chi Phyllanthus. Phát hiện này có ý nghĩa quan trọng trong hóa phân loại thực vật (chemotaxonomy) của chi Phyllanthus thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Do giới hạn thời gian và quy mô của một khóa luận tốt nghiệp cử nhân, nghiên cứu mới chỉ tập trung phân lập các hợp chất từ phân đoạn EA4 thuộc cao ethyl acetate; các phân đoạn khác của cao ethyl acetate cũng như toàn bộ cao n-hexane (11,5 g) và phần dịch chiết phân cực còn lại (224 g) vẫn chưa được khảo sát chi tiết.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    1. Tiếp tục triển khai sắc ký cột trên các phân đoạn còn lại của cao ethyl acetate, cao n-hexane và dịch chiết nước để phân lập thêm các hợp chất thứ cấp mới.
    2. Thực hiện các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, kháng viêm, độc tế bào, bảo vệ gan) trên các hợp chất tinh khiết thu nhận được nhằm làm sáng tỏ giá trị dược dụng của vỏ thân cây Me rừng.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng tham khảo: Khóa luận là tài liệu chuyên khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học, giảng viên và nghiên cứu viên thuộc các ngành Hóa học (Hóa hợp chất thiên nhiên, Hóa hữu cơ), Dược học, Thực vật học và Công nghệ Hóa dược.
  • Nội dung giá trị:
    • Cung cấp quy trình chiết xuất, phân bố lỏng - lỏng và các điều kiện dung môi thực tế trong sắc ký cột silica gel để tách phân đoạn các hợp chất steroid và triterpenoid.
    • Cung cấp tập hợp số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC) chuẩn xác và phương pháp luận biện luận cấu trúc các khung phân tử tự nhiên đặc thù (vòng lactone không no, vòng cyclopropane trong triterpene ursane).

Câu hỏi thường gặp

1. Khối lượng nguyên liệu vỏ thân cây Me rừng sử dụng và hiệu suất thu nhận các phân đoạn cao là bao nhiêu?

Nghiên cứu sử dụng 16,2 kg bột khô vỏ thân cây Me rừng thu hái tại Bình Thuận. Quá trình ngâm dầm chiết kiệt bằng ethanol $96^\circ$ thu được 350,5 g cao ethanol thô. Sau khi chiết phân bố lỏng - lỏng, thu được 11,5 g cao n-hexane, 85,4 g cao ethyl acetate và 224 g phần dịch chiết còn lại.

2. Hợp chất PEE04 được phân lập như thế nào và có những đặc trưng phổ nào giúp xác định là Periplogenin?

PEE04 (5,8 mg) được cô lập từ phân đoạn phụ EA4.6 thông qua sắc ký cột silica gel nhiều lần với hệ dung môi chloroform : methanol và chloroform : acetone. Phổ NMR thể hiện khung pregnane 23 carbon với một vòng lactone không no $\alpha,\beta$ ($\delta_C\text{ 174,8}$, $\delta_C\text{ 117,8}$ và $\delta_H\text{ 5,90}$), cùng 3 nhóm hydroxyl gắn tại C-3 ($\delta_C\text{ 68,0}$), C-5 ($\delta_C\text{ 85,6}$) và C-14 ($\delta_C\text{ 85,5}$). Các tương quan HMBC từ proton H-17 và nhóm methyl khẳng định cấu trúc periplogenin.

3. Căn cứ nào trên phổ NMR giúp phân biệt hợp chất PA1 (16-Dehydropregnenolone) với các steroid thông thường khác?

PA1 (5,9 mg) có tín hiệu nhóm methyl ketone đặc trưng gồm carbon carbonyl liên hợp ở $\delta_C\text{ 197,0}$ (C-20) và proton methyl đơn ở $\delta_H\text{ 2,39}$ (3H, s, H-21). Khác với các dẫn xuất pregnenolone thông thường, PA1 có thêm một liên kết đôi nội vòng tại vị trí C16–C17 ($\delta_C\text{ 144,8}$ và $\delta_C\text{ 155,6}$) với proton olefin H-16 cộng hưởng ở $\delta_H\text{ 6,71}$ (1H, dd, $J=3{,}0\text{ Hz}, 1{,}0\text{ Hz}$), tạo nên hệ thống liên hợp với nhóm carbonyl C-20.

4. Dấu hiệu phổ học quan trọng nhất để nhận diện vòng cyclopropane trong hợp chất PA2 (Phyllanthol) là gì?

Dấu hiệu đặc trưng nhất là sự xuất hiện của tín hiệu carbon methylene của vòng cyclopropane ở vùng từ trường cao $\delta_C\text{ 13,8}$ (C-27) trên phổ $^{13}\text{C}$-NMR, cùng cặp proton dị phân của nhóm $-CH_2-$ tại $\delta_H\text{ 0,00}$ (1H, d, $J=4{,}0\text{ Hz}$, H-27a) và $\delta_H\text{ 0,48}$ (1H, d, $J=4{,}0\text{ Hz}$, H-27b) trên phổ $^1\text{H}$-NMR. Tương quan HMBC giữa proton này với C-13, C-14, C-15 xác định vị trí vòng ba cạnh tại C13–C14 trên khung triterpene ursane.

5. Ý nghĩa phát hiện mới của khóa luận đối với nghiên cứu chi Phyllanthus là gì?

Khóa luận đã ghi nhận lần đầu tiên sự có mặt của periplogenin và 16-dehydropregnenolone trong chi Phyllanthus, đồng thời là công trình đầu tiên cô lập phyllanthol từ vỏ thân của loài Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.). Dữ liệu này chứng minh tính đa dạng về mặt hóa thực vật của vỏ thân Me rừng, mở rộng danh mục hợp chất thiên nhiên của chi Phyllanthus.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Bảo Quý đã thực hiện thành công việc chiết xuất và phân lập các hợp chất tự nhiên từ vỏ thân cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) thu hái tại tỉnh Bình Thuận. Bằng việc phối hợp các kỹ thuật sắc ký cột và phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D, 2D-NMR, đề tài đã cô lập và xác định cấu trúc hoàn chỉnh của 3 hợp chất tinh khiết gồm Periplogenin (5,8 mg), 16-Dehydropregnenolone (5,9 mg) và Phyllanthol (10,9 mg). Kết quả này đóng góp những dẫn liệu khoa học mới cho ngành hóa học hợp chất thiên nhiên khi lần đầu tiên ghi nhận sự xuất hiện của hai khung steroid periplogenin và 16-dehydropregnenolone trong chi Phyllanthus.