Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa với điều kiện tự nhiên thuận lợi cho sự phát triển của hệ thực vật phong phú. Nguồn tài nguyên này từ lâu đã trở thành cơ sở cho y học cổ truyền và là đối tượng nghiên cứu của ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên nhằm tìm kiếm các hoạt chất có giá trị điều trị sinh học cao. Trong hệ thực vật Việt Nam, chi Phyllanthus (họ Thầu dầu - Euphorbiaceae) là một chi lớn với hơn 700 loài trên thế giới và khoảng 44 loài ghi nhận tại Việt Nam. Nhiều loài trong chi này được ứng dụng rộng rãi trong các bài thuốc dân gian để hỗ trợ điều trị bệnh về gan, thận, tiêu hóa và nhiễm trùng.

Cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) là loài thực vật mọc hoang dã khá phổ biến, được xếp vào nhóm thực vật có tiềm năng dược tính điều trị viêm gan trong kinh nghiệm cổ truyền. Trong y học dân gian, toàn bộ các bộ phận của cây đều có công dụng chữa bệnh: rễ được dùng trị lỵ, viêm ruột, ruột kết hạch, viêm gan, viêm thận, trẻ em cam tích; lá dùng làm dịu sốt, trị ỉa chảy, phù thũng, ứ huyết do ngã, rắn cắn; vỏ thân dùng chữa mụn nhọt, đậu mùa và tiểu tiện khó khăn. Mặc dù có lịch sử sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền và các loài cùng chi sở hữu nhiều hoạt tính sinh học quan trọng, các công trình nghiên cứu sâu về thành phần hóa thực vật của loài Phyllanthus reticulatus Poir. tại Việt Nam ở thời điểm năm 2013 vẫn còn ở mức sơ bộ. Xuất phát từ bối cảnh thực tiễn đó, khóa luận tốt nghiệp cử nhân hóa học của tác giả Liêu Diệp Hân tập trung khảo sát thành phần hóa học của loài cây này.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài bao gồm:

  1. Thu thập, xử lý và điều chế các phân đoạn cao chiết hữu cơ từ hỗn hợp lá, thân và rễ của cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.).
  2. Ứng dụng các phương pháp sắc ký (sắc ký cột silica gel pha thường, pha đảo và sắc ký lớp mỏng) để phân lập và tinh chế các hợp chất hóa học sạch từ các cao phân đoạn.
  3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được thông qua việc phân tích và giải đoán dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D-NMR ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC) kết hợp đối chiếu tài liệu tham khảo chuyên ngành.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các bộ phận gồm lá, thân và rễ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.), thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Mẫu thực vật được thẩm định tên khoa học bởi Giáo sư, Tiến sĩ Võ Văn Chi.
  • Phạm vi không gian: Mẫu nguyên liệu thực vật được thu hái thực tế tại huyện Tân Uyên, tỉnh Bình Dương. Các thực nghiệm phân tích phổ NMR được đo đạc tại Phòng thí nghiệm Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
  • Phạm vi thời gian: Mẫu cây được thu hái vào tháng 7 năm 2012; toàn bộ nghiên cứu chiết tách, phổ nghiệm và hoàn chỉnh khóa luận được hoàn thành vào tháng 5 năm 2013.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận thiết lập nền tảng lý thuyết dựa trên các tài liệu hóa thực vật và dược học về chi Phyllanthus, kết hợp phân loại hình thái thực vật của họ Euphorbiaceae. Về phương diện hóa thực vật, tác giả đối chiếu các nhóm chất đặc trưng đã từng được công bố trên thế giới và tại Việt Nam từ loài P. reticulatus và các loài tương đồng, bao gồm các khung triterpenoid pentacyclic (friedelan, oleanan, lupan), lignan, alkaloid và các dẫn xuất phenolic glycoside.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế theo quy trình chuẩn của hóa học hợp chất thiên nhiên:

  • Phương pháp chiết xuất: Chiết rắn - lỏng bằng kỹ thuật ngâm dầm bột thực vật khô trong dung môi ethanol $96^\circ$ ở nhiệt độ phòng, sau đó cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm trên máy Heidolph để thu nhận cao tổng ethanol thô. Tiếp theo, áp dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần (ether dầu hỏa và ethyl acetate) để thu được các phân đoạn cao tương ứng.
  • Phương pháp phân lập và tinh chế: Sử dụng sắc ký cột (SKC) cổ điển với chất hấp phụ là silica gel 60 (kích thước hạt 0,040 - 0,063 mm, Merck) cho hệ pha thường và silica gel RP-18 (Merck) cho hệ pha đảo. Quá trình giải ly được theo dõi liên tục bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) trên bản mỏng tráng sẵn nhôm Kieselgel $60\text{F}_{254}$ và RP-18 (Merck). Thuốc thử hiện hình bề mặt bản mỏng là dung dịch axit sunfuric ($\text{H}_2\text{SO}_4$) 30% kết hợp gia nhiệt, cùng việc quan sát dưới đèn soi tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm.
  • Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Xác định khung cấu trúc và vị trí nhóm thế dựa trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo trên máy Bruker Avance ở tần số 500 MHz đối với proton ($^1\text{H}$) và 125 MHz đối với cacbon ($^{13}\text{C}$). Hệ phổ bao gồm phổ 1 chiều ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT-90, DEPT-135) và phổ 2 chiều (COSY xác định tương tác spin-spin giữa các proton kế cận; HSQC xác định tương quan trực tiếp giữa proton và cacbon liên kết; HMBC xác định tương tác dị hạch xa qua 2 đến 3 liên kết hóa học). Dung môi phổ nghiệm sử dụng là cloroform deuteri ($\text{CDCl}_3$) và metanol deuteri ($\text{CD}_3\text{OD}$).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu liên quan đến cây Phèn đen về hình thái thực vật, công dụng dân gian, hoạt tính sinh học và thành phần hóa thực vật.

  • Đặc điểm thực vật: Cây Phèn đen có tên đồng danh dân gian là Nỗ, Sáp tràng thảo, Tạo phan diệp, Diệp hạ châu mạng. Cây có dạng bụi cao 2-4 m, cành mảnh màu đen nhạt, thường tụ 2-3 cành trên cùng một đốt dài 10-20 cm. Phiến lá mỏng, hình dạng thay đổi từ trái xoan, bầu dục đến trứng ngược nhọn, kích thước dài 1,5-3 cm và rộng 6-12 mm, mặt trên sẫm màu hơn mặt dưới. Quả hình cầu, khi chín chuyển màu đen, đường kính dài khoảng 5 mm và rộng 3 mm; hạt màu nâu hình 3 cạnh. Cây phân bố ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Trung Quốc, Tây và Nam Phi; ra hoa kết quả từ tháng 8 đến tháng 10 hằng năm.
  • Dược tính cổ truyền và hiện đại: Văn bản liệt kê các bài thuốc cổ phương từ Nam dược thần hiệu, Bách gia trân tàng, và Hoạt nhân toát yếu (của Hoàng Đôn Hòa) sử dụng rễ và lá Phèn đen chữa kiết lỵ, nhiệt tả, đại tiện ra máu, tụ máu do đòn ngã, nhọt độc, rắn cắn. Về dược lý hiện đại, dịch chiết lá P. reticulatus đã được Omulokoki và cộng sự kiểm chứng khả năng ức chế ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với $\text{IC}_{50} < 10\ \mu\text{g/ml}$. Chương tổng quan cũng điểm lại các nghiên cứu dược tính nổi bật của các loài trong chi: tác dụng kháng sinh của P. urinaria trên tụ cầu trùng và vi khuẩn đường ruột (Viện Vi trùng Việt Nam, 1961); hiệu quả làm âm tính virus viêm gan B trên 22/37 bệnh nhân của P. amarus và P. niruri (Blumberg và cộng sự, 1988); hiệu quả đào thải HBsAg của chế phẩm thảo dược LIV/94 trên bệnh nhân viêm gan mãn tính (Nguyễn Bá Kinh và cộng sự, 2002); hoạt tính chống oxy hóa của 5 loài Phyllanthus tại Ấn Độ (2007).
  • Thành phần hóa thực vật: Trên thế giới, Wai-Haan Hui (1976) đã tách được 21-$\alpha$-hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one, $\beta$-sitosterol, friedelin-1$\beta$,22$\beta$-diol và glochidonol từ P. reticulatus; Joshi (1981) cô lập friedelin, betulin và $\beta$-sitosterol; J. Xiong Ma (2012) phân lập syringaresinol cùng 2 arylnaphthalene lignan glycoside (reticulatusides A và B). Tại Việt Nam, Phan Văn Dân (2009) cô lập được $\beta$-sitosterol, daucosterol và một dẫn xuất dipeptide (2-acetamido-3-phenylpropyl 2-benzamido-3-phenylpropanoate). Bên cạnh đó, tác giả tổng thuật chi tiết các hợp chất triterpenoid, glycoside và alkaloid đã công bố từ hơn 15 loài khác cùng chi (như P. acidus, P. acuminatus, P. discoides, P. urinaria,...).

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình xử lý 26,00 kg bột thực vật khô và quá trình điều chế các phân đoạn cao, cũng như diễn tiến sắc ký cô lập hai hợp chất tinh khiết:

  • Điều chế cao: 26,00 kg mẫu bột khô lá, thân, rễ Phèn đen được ngâm dầm kiệt với ethanol $96^\circ$. Sau khi lọc và thu hồi dung môi bằng máy cô quay áp suất thấp, thu được 534,00 g cao tổng ethanol. Chiết lỏng - lỏng phân bố cao tổng lần lượt với ether dầu hỏa và ethyl acetate thu được 52,00 g cao ether dầu hỏa và 118,00 g cao ethyl acetate.
  • Cô lập hợp chất H4 từ cao ether dầu hỏa: 52,00 g cao ether dầu hỏa được sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi ether dầu hỏa : ethyl acetate (ED : EA) có tỷ lệ EA tăng dần từ 10% đến 100%, thu được 4 phân đoạn chính:
    • Phân đoạn ED1 (ED : EA 9:1, khối lượng 16,00 g, sắc ký lớp mỏng cho vệt dài).
    • Phân đoạn ED2 (khối lượng 0,60 g, bản mỏng tách nhiều vết rõ).
    • Phân đoạn ED3 (ED : EA 1:1, khối lượng 8,20 g).
    • Phân đoạn ED4 (EA 100%, khối lượng 4,80 g). Phân đoạn ED2 (0,60 g) tiếp tục được sắc ký cột giải ly bằng hệ cloroform : metanol (C : Me) chứa 0% đến 5% metanol, thu được 3 phân đoạn phụ gồm ED21 (52,00 mg), ED22 (182,00 mg) và ED23 (208,00 mg). Phân đoạn ED21 cho một vết hồng tím rõ trên SKLM; sau khi kết tinh phân đoạn này trong dung môi metanol 100%, thu được 22,00 mg hợp chất H4 ở dạng bột màu trắng.
  • Cô lập hợp chất H2 từ cao ethyl acetate: 118,00 g cao ethyl acetate được sắc ký cột silica gel giải ly bằng hệ ED : EA (20% đến 100% EA), thu được 4 phân đoạn lớn: EA1 (86,00 g), EA2 (7,90 g), EA3 (2,53 g) và EA4 (2,65 g). Tiến hành tách tiếp phân đoạn EA2 (7,90 g) trên cột silica gel với hệ C : Me (0% đến 20% Me) thu được 3 phân đoạn phụ EA21 (1,02 g), EA22 (1,88 g) và EA23 (2,74 g). Phân đoạn EA22 (1,88 g) tiếp tục qua cột silica gel với hệ cloroform : ethyl acetate (C : EA 40% đến 60% EA), tách ra thành EA221 (0,42 g), EA222 (0,86 g) và EA223 (0,12 g). Phân đoạn EA222 (0,86 g) được tinh chế qua sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18 nhiều lần với hệ dung môi rửa giải $\text{Me} : \text{H}_2\text{O}$ tỷ lệ 1:1, thu được 42,00 mg hợp chất H2 ở dạng tinh thể hình kim màu trắng.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày việc giải đoán cấu trúc hai hợp chất tinh khiết H4 và H2 dựa trên phổ NMR 1 chiều và 2 chiều:

  • Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất H4:
    • Hợp chất H4 (22,00 mg) là bột màu trắng, SKLM với dung môi cloroform 100% cho 1 vết duy nhất có $R_f = 0,35$, phản ứng với $\text{H}_2\text{SO}_4$ 30% cho màu hồng tím.
    • Phổ $^1\text{H}$-NMR ($\text{CDCl}3$) xuất hiện tín hiệu của 1 proton nhóm amide tại $\delta{\text{H}}\ 6,91\ (1\text{H}, \text{d})$; 2 proton olefin tại $\delta_{\text{H}}\ 5,38$; các proton nhóm cacbinol $>\text{CH}-\text{O}$ trong vùng $\delta_{\text{H}}\ 3$; vùng proton mạch aliphatic dày đặc của hai mạch cacbon dài tại $\delta_{\text{H}}\ 1,25$ cùng 2 nhóm metyl cuối mạch ở $\delta_{\text{H}}\ 0,88\ (6\text{H}, \text{t})$.
    • Phổ $^{13}\text{C}$-NMR và DEPT ghi nhận 1 cacbon carbonyl nhóm amide $>\text{C}=\text{O}$ ở $\delta_{\text{C}}\ 174,4$; 1 nhóm oxymetylen $-\text{CH}2-\text{O}-$ ở $\delta{\text{C}}\ 70,3$; các nhóm metylen bão hòa trong khoảng $\delta_{\text{C}}\ 22 - 32$; 2 nhóm metyl tận cùng ở $\delta_{\text{C}}\ 14,2$; 1 nhóm $>\text{CH}-$ mang nitơ tại $\delta_{\text{C}}\ 51,5$. Tín hiệu HSQC khẳng định proton tại $\delta_{\text{H}}\ 6,91$ không gắn trực tiếp vào cacbon (đặc trưng của nhóm $-\text{NH}-$). Hai proton olefin tại $\delta_{\text{H}}\ 5,38$ tương quan trực tiếp với 2 cacbon tại $\delta_{\text{C}}\ 131,7$.
    • Đặc điểm cấu trúc đặc biệt: Phổ HMBC cho thấy proton H-1 tương quan đến cacbon C-2 ($\delta_{\text{C}}\ 51,5$) và cacbon C-4 ($\delta_{\text{C}}\ 85,3$). Độ dịch chuyển hóa học của C-1 và C-4 dịch chuyển về phía trường thấp hơn bình thường so với khung ceramide mạch hở kinh điển, chứng minh có liên kết ete nội phân tử giữa C-1 và C-4 tạo thành dị vòng tetrahydrofuran 5 cạnh. Do trên phổ $^{13}\text{C}$-NMR xuất hiện 2 tín hiệu cộng hưởng rất gần nhau tại vị trí $\delta_{\text{C}}\ 85,3$, tác giả kết luận mẫu H4 là hỗn hợp của hai ceramide đồng đẳng chỉ khác nhau về chiều dài mạch hydrocarbon, có nhóm thế $-\text{OH}$ gắn tại vị trí $2'$ của nhánh axit.
  • Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất H2:
    • Hợp chất H2 (42,00 mg) có dạng tinh thể hình kim màu trắng, SKLM với hệ C : Me (9:1) cho 1 vết có $R_f = 0,70$, hấp thụ tử ngoại và chuyển màu đen khi hiện hình bằng $\text{H}_2\text{SO}_4$ 30% kèm gia nhiệt.
    • Phổ $^1\text{H}$-NMR ($\text{CD}3\text{OD}$) cho thấy sự tồn tại của 2 hệ vòng thơm: một vòng benzen đơn thay thế (vòng benzoyl) gồm 2 proton tại $\delta{\text{H}}\ 8,02\ (2\text{H}, \text{d}, J = 8,0\ \text{Hz}, \text{H}-2'', \text{H}-6'')$ và 3 proton thơm tại $\delta_{\text{H}}\ 7,45 - 7,59\ (\text{m}, \text{H}-3'', \text{H}-4'', \text{H}-5'')$; một vòng benzen thế đối xứng vị trí 1,4 (gốc 4-hydroxyphenyl) thể hiện qua 2 cặp proton ghép đôi trực giao ortho ở $\delta_{\text{H}}\ 6,69\ (2\text{H}, \text{d}, J = 9,0\ \text{Hz}, \text{H}-3, \text{H}-5)$ và $\delta_{\text{H}}\ 6,98\ (2\text{H}, \text{d}, J = 9,0\ \text{Hz}, \text{H}-2, \text{H}-6)$. Về phần đường, phổ ghi nhận 1 proton anomer ở $\delta_{\text{H}}\ 4,75\ (1\text{H}, \text{d}, J = 7,5\ \text{Hz}, \text{H}-1')$ cùng các proton oxymethine nằm trong khoảng $\delta_{\text{H}}\ 3,3 - 4,5$. Hằng số tương tác spin $J = 8,5\ \text{Hz}$ giữa H-3' và H-4' chứng minh cấu hình không gian của đường là $\beta$-D-glucopyranose.
    • Phổ $^{13}\text{C}$-NMR và DEPT ghi nhận 1 cacbon cacbonyl este ở $\delta_{\text{C}}\ 167,8$; cacbon anomer ở $\delta_{\text{C}}\ 103,5$; 4 cacbon $>\text{CH}-\text{O}-$ của phân tử đường trong khoảng $\delta_{\text{C}}\ 70,0 - 78,0$; 1 nhóm oxymetylen $-\text{CH}2-\text{O}-$ ở $\delta{\text{C}}\ 65,0$ (tương ứng với C-6').
    • Khẳng định tương quan liên kết qua 2D-NMR: Proton anomer $\text{H}-1'$ cho tương quan HMBC đến cacbon C-1 ($\delta_{\text{C}}\ 152,1$) của vòng thơm 1,4-đối xứng, chứng minh phân tử đường liên kết oside với gốc 4-hydroxyphenyl. Hai proton của nhóm oxymetylen H-6' ($\delta_{\text{H}}\ 4,45$ và $4,65$) và các proton thơm $\text{H}-2'', \text{H}-6''$ ($\delta_{\text{H}}\ 8,02$) đều cho tương quan HMBC đến cacbon carbonyl este tại $\delta_{\text{C}}\ 167,8$. Điều này chứng minh nhóm benzoyl gắn vào vị trí C-6' của phân tử glucose qua liên kết este. Đối chiếu phổ nghiệm hoàn toàn phù hợp với hợp chất arbutin dẫn xuất, tác giả xác định cấu trúc của H2 là $6'\text{-}O\text{-benzoyl arbutin}$.

Chương 4: Kết luận và đề xuất

Tác giả đúc kết lại kết quả chiết tách từ 26,00 kg nguyên liệu Phèn đen đã thu được hai phân đoạn cao chiết có hiệu suất đáng kể và cô lập thành công 22,00 mg hợp chất H4 (dẫn xuất ceramide vòng ete) và 42,00 mg hợp chất H2 ($6'\text{-}O\text{-benzoyl arbutin}$). Trên cơ sở các kết quả đạt được, chương đề xuất hai hướng triển khai tiếp theo: tiếp tục phân lập các phân đoạn sắc ký chưa khảo sát của cao ether dầu hỏa, cao ethyl acetate và phần dịch nước còn lại; đồng thời gửi mẫu thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất tinh khiết đã thu nhận.

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp kết quả chiết xuất và cô lập các phân đoạn

Mẫu chiết xuất / Hợp chất Khối lượng Trạng thái cảm quan Phương pháp phân lập / Tinh chế Cấu trúc xác định
Bột nguyên liệu khô ban đầu 26,00 kg Bột mịn khô Sấy khô, nghiền cơ học Toàn phần lá, thân, rễ
Cao ethanol thô 534,00 g Cao đậm đặc Ngâm dầm ethanol $96^\circ$, cô quay Cao tổng
Cao ether dầu hỏa 52,00 g Cao phân đoạn Chiết lỏng - lỏng phân bố Phân đoạn kém phân cực
Cao ethyl acetate 118,00 g Cao phân đoạn Chiết lỏng - lỏng phân bố Phân đoạn phân cực trung bình
Hợp chất H4 22,00 mg Bột màu trắng ($R_f = 0,35$) SKC silica gel (ED:EA $\rightarrow$ C:Me), kết tinh MeOH 100% Hỗn hợp hai ceramide vòng ete tạo bởi C1-C4
Hợp chất H2 42,00 mg Tinh thể hình kim màu trắng ($R_f = 0,70$) SKC pha thường (ED:EA $\rightarrow$ C:Me $\rightarrow$ C:EA), SKC pha đảo RP-18 ($\text{Me}:\text{H}_2\text{O}$ 1:1) $6'\text{-}O\text{-benzoyl arbutin}$

Đóng góp học thuật

  • Bổ sung dữ liệu thực nghiệm về thành phần hóa thực vật của loài Phyllanthus reticulatus Poir. thu hái tại khu vực Đông Nam Bộ (Bình Dương, Việt Nam).
  • Đây là lần đầu tiên cô lập và xác định cấu trúc một dẫn xuất phenolic glycoside ester hóa là $6'\text{-}O\text{-benzoyl arbutin}$ từ dịch chiết ethyl acetate của loài cây này tại Việt Nam, đồng thời làm rõ sự hiện diện của lớp chất ceramide có cấu trúc dị vòng ete năm cạnh hiếm gặp từ dịch chiết ether dầu hỏa.
  • Cung cấp đầy đủ các giá trị độ dịch chuyển hóa học phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT) và tương quan phổ 2 chiều (COSY, HSQC, HMBC) có độ phân giải cao (500 MHz) phục vụ công tác tra cứu phổ học hợp chất thiên nhiên.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự xác định các giới hạn thực tế gắn liền với phạm vi của một đồ án tốt nghiệp đại học:

  • Hạn chế: Do giới hạn về thời gian thực hiện, nghiên cứu mới chỉ tập trung phân lập được 2 phân đoạn nhỏ (ED2 thuộc cao ether dầu hỏa và EA2 thuộc cao ethyl acetate). Các phân đoạn có khối lượng lớn khác như ED1 (16,00 g), ED3 (8,20 g), ED4 (4,80 g), EA1 (86,00 g), EA21 (1,02 g), EA23 (2,74 g), EA3 (2,53 g), EA4 (2,65 g) và toàn bộ phần cặn chiết tan trong nước vẫn chưa được tiến hành sắc ký tiếp. Ngoài ra, khóa luận mới dừng lại ở bước nhận danh cấu trúc hóa học, chưa kịp triển khai đánh giá các hoạt tính sinh học in vitro (như thử nghiệm độc tính tế bào, kháng viêm, chống oxy hóa hay ức chế vi sinh vật kiểm định).
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    1. Tiếp tục triển khai sắc ký cột trên các phân đoạn còn lưu giữ của cao ether dầu hỏa và cao ethyl acetate nhằm tìm kiếm thêm các hợp chất triterpenoid hoặc flavonoid thứ cấp.
    2. Xử lý và khảo sát thành phần hóa học phần cao nước còn lại sau chiết phân bố lỏng - lỏng.
    3. Mở rộng thử nghiệm hoạt tính sinh học chuyên sâu đối với hai hợp chất tinh khiết H4 và H2 ($6'\text{-}O\text{-benzoyl arbutin}$) để kiểm chứng tương quan với các tác dụng điều trị trong y học cổ truyền.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn trực tiếp cho:

  • Sinh viên, học viên cao học chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa hữu cơ, Dược học và Công nghệ hóa học.
  • Cán bộ nghiên cứu đang thực hiện các đề tài chiết tách hoạt chất sinh học từ các loài thuộc chi Phyllanthus hoặc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).
  • Các nội dung có tính ứng dụng tham khảo kỹ thuật cao:
    • Quy trình chiết ngâm dầm và phân bố lỏng - lỏng trên khối lượng mẫu lớn (26 kg nguyên liệu) để thu nhận lượng cao phân đoạn sạch.
    • Các hệ dung môi sắc ký cột phân đoạn hiệu quả đối với các hợp chất ceramide kém phân cực (hệ ether dầu hỏa : ethyl acetate kết hợp cloroform : metanol) và glycoside phân cực (kỹ thuật kết hợp silica gel pha thường với silica gel pha đảo RP-18 rửa giải bằng hệ metanol : nước).
    • Phương pháp luận phân tích và kết nối tương quan phổ 2D-NMR để giải quyết cấu trúc dị vòng ete bất thường và xác định vị trí liên kết este giữa gốc đường với vòng thơm.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu thực vật Phèn đen dùng trong nghiên cứu được thu thập ở đâu, thời điểm nào và do ai xác định tên khoa học?
Mẫu lá, thân và rễ cây Phèn đen được thu hái tại huyện Tân Uyên, tỉnh Bình Dương vào tháng 7 năm 2012. Tên khoa học của mẫu được Giáo sư, Tiến sĩ Võ Văn Chi thẩm định là Phyllanthus reticulatus Poir., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).

2. Khối lượng nguyên liệu bột thực vật ban đầu và lượng cao chiết thu nhận được là bao nhiêu?
Tổng khối lượng bột khô lá, thân và rễ phèn đen đưa vào chiết xuất là 26,00 kg. Sau khi ngâm dầm với ethanol $96^\circ$ và cô quay đuổi dung môi, thu được 534,00 g cao ethanol thô. Tiến hành chiết lỏng - lỏng phân bố cao ethanol thô này thu được 52,00 g cao ether dầu hỏa và 118,00 g cao ethyl acetate.

3. Hợp chất H4 và H2 được cô lập từ phân đoạn nào và có đặc điểm cảm quan ra sao?

  • Hợp chất H4 thu được từ phân đoạn ED21 (thuộc cao ether dầu hỏa), có khối lượng 22,00 mg, cảm quan ở dạng bột màu trắng, cho một vết duy nhất trên SKLM ($R_f = 0,35$ với hệ cloroform 100%) và hiện màu hồng tím với thuốc thử $\text{H}_2\text{SO}_4$ 30% đun nóng.
  • Hợp chất H2 thu được từ phân đoạn EA222 (thuộc cao ethyl acetate), có khối lượng 42,00 mg, cảm quan ở dạng tinh thể hình kim màu trắng, cho một vết trên SKLM ($R_f = 0,70$ với hệ cloroform : metanol 9:1) và hiện màu đen với thuốc thử $\text{H}_2\text{SO}_4$ 30% đun nóng.

4. Dữ liệu phổ nghiệm nào chứng minh hợp chất H4 có cấu trúc vòng ete 5 cạnh giữa C-1 và C-4?
Phổ $^{13}\text{C}$-NMR cho thấy độ dịch chuyển hóa học của cacbon C-1 và C-4 nằm ở vùng trường thấp hơn so với các ceramide mạch hở thông thường, trong đó C-4 xuất hiện ở $\delta_{\text{C}}\ 85,3$. Đồng thời, phổ HMBC thể hiện rõ tương quan dị hạch giữa proton H-1 với cacbon C-4 ($\delta_{\text{C}}\ 85,3$), chứng tỏ C-1 và C-4 liên kết trực tiếp với nhau thông qua một cầu nối ete tạo thành dị vòng tetrahydrofuran 5 cạnh.

5. Cấu trúc của hợp chất H2 được nhận danh là gì và liên kết este được xác lập dựa trên tương quan phổ nào?
Hợp chất H2 được xác định là $6'\text{-}O\text{-benzoyl arbutin}$. Sự liên kết giữa nhóm benzoyl với phân tử đường glucose qua liên kết este tại vị trí C-6' được khẳng định nhờ phổ HMBC: hai proton của nhóm oxymetylen $\text{H}-6'$ ($\delta_{\text{H}}\ 4,45$ và $4,65$) và hai proton vòng thơm $\text{H}-2'', \text{H}-6''$ ($\delta_{\text{H}}\ 8,02$) đều cho tương quan đến cacbon carbonyl este tại $\delta_{\text{C}}\ 167,8$.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Liêu Diệp Hân đã xử lý thành công 26,00 kg mẫu thực vật lá, thân và rễ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) để điều chế các phân đoạn cao chiết hữu cơ bằng dung môi ethanol, ether dầu hỏa và ethyl acetate. Bằng việc kết hợp sắc ký cột silica gel pha thường, pha đảo RP-18 và sắc ký lớp mỏng, nghiên cứu đã phân lập được 22,00 mg hợp chất H4 và 42,00 mg hợp chất H2 ở trạng thái tinh khiết. Dựa trên phân tích chuyên sâu các hệ phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D-NMR, cấu trúc của H4 được xác định là hỗn hợp ceramide chứa vòng ete 5 cạnh, và hợp chất H2 được nhận danh là dẫn xuất phenolic glycoside $6'\text{-}O\text{-benzoyl arbutin}$. Nghiên cứu đã cung cấp những dẫn liệu thực nghiệm có giá trị về thành phần hóa thực vật của cây Phèn đen, tạo tiền đề khoa học cho việc phân lập tiếp các phân đoạn tồn dư và đánh giá hoạt tính sinh học trong các nghiên cứu tiếp theo.