Khảo Sát Tiềm Năng Kháng Khuẩn Từ Cao Chiết Lá Cây ỔI (Psidium guajava L.)

Khảo sát tiềm năng kháng khuẩn từ cao chiết lá cây ổi (Psidium guajava L.) đang trở thành một lĩnh… 74 trang · Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh · 2019.

• Tác giả: Nguyễn Đoàn Thanh Liêm
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học – Y Dược
• Đề tài: Khảo Sát Tiềm Năng Kháng Khuẩn Từ Cao Chiết Lá Cây Ổi
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• I. PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ
• II. PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về nguyên liệu
• 2.1.1. Sơ lược về cây ổi (Psidium guajava L.)
• 2.1.2. Nguồn gốc và sự phân bố
• 2.1.3. Đặc điểm hình thái
• 2.1.4. Thành phần hóa học của cây ổi
• 2.1.5. Giá trị dược liệu của cây ổi
• 2.2. Tổng quan về một số vi khuẩn gây bệnh ở người
• 2.2.1. Staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA)
• 2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước
• 2.3. Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu
• 2.3.1. Phân loại cao dược liệu
• 2.3.2. Các kĩ thuật chiết dược liệu
• 2.3.2.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt (Percolation)
• 2.3.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration)
• 2.3.2.3. Kỹ thuật chiết Sohxlet
• 2.3.2.4. Cô đặc và sấy khô
• 2.3.3. Phương pháp chiết lỏng-lỏng
• 2.3.4. Khái quát về phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn
• 2.3.4.1. Phương pháp khuếch tán
• 2.3.4.2. Phương pháp pha loãng liên tiếp
• 2.3.4.3. Phương pháp sắc ký cột
• 2.3.4.4. Phương pháp xác định cấu trúc
• III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu
• 3.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu. Bố trí thí nghiệm. Quy trình thu nhận và xử lý mẫu. Xác định tên khoa học của cây thuốc
• 3.5. Quy trình chiết xuất cao dược liệu từ lá cây ổi
• 3.6. Khảo sát giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
• 3.7. Định tính khả năng kháng khuẩn gây bệnh
• 3.8. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn gây bệnh
• 3.9. Xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên trong lá cây ổi
• IV. PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả giám định tên khoa học của cây
• 4.2. Kết quả chiết cao dược liệu
• 4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết thu được từ lá cây ổi
• 4.4. Xác định độ nhiễm khuẩn của cao chiết
• 4.5. Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn
• 4.6. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết
• 4.7. Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl axetat
• 4.8. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các cao phân đoạn cao ethyl axetat
• 4.9. Xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên trong lá cây ổi
• V. PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHẦN VII: PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Khảo Sát Tiềm Năng Kháng Khuẩn Từ Cao Chiết Lá Cây Ổi

Khảo sát tiềm năng kháng khuẩn từ cao chiết lá cây ổi (Psidium guajava L.) đang trở thành một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng. Cây ổi không chỉ là một loại trái cây phổ biến mà còn chứa nhiều hợp chất có khả năng kháng khuẩn. Nghiên cứu này nhằm mục đích tìm hiểu và đánh giá khả năng kháng khuẩn của các cao chiết từ lá cây ổi, từ đó mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên.

1.1. Giới Thiệu Về Cây Ổi Và Tính Kháng Khuẩn

Cây ổi (Psidium guajava L.) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng lá ổi chứa các hợp chất như flavonoid và tannin có khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ. Những hợp chất này có thể ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Kháng Khuẩn

Tình trạng kháng thuốc kháng sinh đang gia tăng trên toàn cầu, khiến việc tìm kiếm các nguồn kháng sinh tự nhiên trở nên cấp thiết. Nghiên cứu về cây ổi có thể cung cấp những giải pháp mới cho vấn đề này, đồng thời giúp bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

II. Vấn Đề Kháng Khuẩn Hiện Nay Và Tác Động Của Vi Khuẩn

Tình trạng kháng khuẩn đang trở thành một thách thức lớn trong y tế hiện đại. Việc sử dụng kháng sinh không hợp lý đã dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc. Các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn như Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) đang gia tăng, gây khó khăn trong điều trị.

2.1. Tình Hình Kháng Khuẩn Trên Thế Giới

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam nằm trong danh sách các quốc gia có tỷ lệ kháng thuốc cao. Việc này không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng mà còn gây gánh nặng cho hệ thống y tế.

2.2. Các Vi Khuẩn Gây Bệnh Thường Gặp

Các vi khuẩn như Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa là những tác nhân gây bệnh phổ biến. Chúng có khả năng gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng, đặc biệt là ở những bệnh nhân có hệ miễn dịch yếu.

III. Phương Pháp Chiết Xuất Cao Dược Liệu Từ Lá Cây Ổi

Phương pháp chiết xuất cao dược liệu từ lá cây ổi là một bước quan trọng trong nghiên cứu này. Các phương pháp chiết xuất như chiết ngâm dầm và chiết ngấm kiệt được áp dụng để thu được cao chiết có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất.

3.1. Kỹ Thuật Chiết Xuất Hiệu Quả

Kỹ thuật chiết ngâm dầm cho phép thu được cao chiết với nồng độ hoạt chất cao. Phương pháp này sử dụng dung môi phù hợp để tối ưu hóa quá trình chiết xuất.

3.2. Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của Cao Chiết

Sau khi chiết xuất, cao chiết sẽ được thử nghiệm để xác định khả năng kháng khuẩn. Các phương pháp như khuếch tán và pha loãng liên tiếp được sử dụng để đánh giá hiệu quả kháng khuẩn.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Khả Năng Kháng Khuẩn Của Cao Chiết

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết từ lá cây ổi có khả năng kháng khuẩn đáng kể đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Đặc biệt, cao chiết nước và cao ethyl axetat cho thấy hiệu quả tốt nhất trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn.

4.1. Kết Quả Thử Nghiệm Kháng Khuẩn

Các thử nghiệm cho thấy đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết nước đạt 12 mm đối với Salmonella typhi. Điều này chứng tỏ khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ của cao chiết từ lá cây ổi.

4.2. Phân Tích Thành Phần Hóa Học

Phân tích cho thấy lá cây ổi chứa nhiều hợp chất phenolic và flavonoid, có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Những hợp chất này có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên.

V. Kết Luận Và Hướng Đi Tương Lai Trong Nghiên Cứu

Nghiên cứu về tiềm năng kháng khuẩn từ cao chiết lá cây ổi mở ra nhiều triển vọng trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các hợp chất từ cây ổi có thể giúp giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay.

5.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Kháng Khuẩn

Nghiên cứu này không chỉ góp phần vào việc phát triển các sản phẩm kháng sinh mới mà còn nâng cao nhận thức về việc sử dụng hợp lý kháng sinh trong điều trị.

5.2. Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các hợp chất hoạt tính trong lá cây ổi và khả năng ứng dụng của chúng trong y học. Việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên sẽ là một giải pháp bền vững cho vấn đề kháng thuốc.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Tình trạng nhiễm trùng da, niêm mạc và các bệnh lý truyền nhiễm do vi khuẩn, vi nấm gây ra đang ngày càng phổ biến và diễn biến phức tạp tại Việt Nam do đặc thù khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Việc lạm dụng thuốc kháng sinh trong điều trị y tế đã làm gia tăng nhanh chóng hiện tượng kháng thuốc ở vi sinh vật. Theo báo cáo năm 2013 của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam thuộc nhóm các quốc gia có tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh cao hàng đầu thế giới. Sự xuất hiện và lan rộng của các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc (multidrug resistant – MDR), đặc biệt là Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhi, đang đặt ra thách thức nghiêm trọng cho công tác điều trị lâm sàng. Trước thực trạng đó, việc tìm kiếm và khai thác các hoạt chất sinh học tự nhiên từ nguồn thực vật bản địa nhằm phát triển các tác nhân kháng khuẩn mới là hướng nghiên cứu có tính cấp thiết cao.

Cây ổi (Psidium guajava L.) là loài thực vật nhiệt đới giàu hợp chất phenolic, flavonoid (quercetin, avicularin, guaijaverin), triterpenoid, carotenoid và tanin. Nhiều nghiên cứu quốc tế đã ghi nhận hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn của các dịch chiết từ lá ổi. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các công bố khoa học chuyên sâu về việc khảo sát tiềm năng kháng khuẩn của các phân đoạn cao chiết từ lá cây ổi đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh trên người vẫn còn hạn chế.

Mục tiêu nghiên cứu: Đề tài nhằm mục đích khảo sát, đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết khác nhau từ lá cây ổi (Psidium guajava L.), từ đó tạo cơ sở khoa học và tiền đề thực nghiệm cho các nghiên cứu sản xuất hợp chất kháng khuẩn gây bệnh trên người.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể gồm 7 nội dung:

1. Chiết xuất cao dược liệu từ lá cây ổi.
2. Thử nghiệm đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn của các mẫu cao chiết.
3. Thử nghiệm định tính hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh của cao chiết.
4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết từ lá cây ổi đối với vi khuẩn gây bệnh.
5. Điều chế các phân đoạn từ cao chiết bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng.
6. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của từng phân đoạn cao chiết.
7. Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn từ lá cây ổi bằng phương pháp sắc ký cột và các phương pháp phổ.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá cây ổi tươi thu hái tại thành phố Tây Ninh, được giám định hình thái và định danh tên khoa học tại Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
• Đối tượng vi sinh vật thử nghiệm: 04 chủng vi khuẩn chuẩn gồm Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC 43300, Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhi ATCC 14028 và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh - Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh.
• Không gian và thời gian thực hiện: Đề tài được tiến hành từ tháng 02/2019 đến tháng 05/2019 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh (Cơ sở III) - Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp thực nghiệm

Khung lý thuyết và tổng quan phân loại

• Đặc điểm thực vật học và hóa học của cây ổi: Cây ổi có tên khoa học là Psidium guajava L., thuộc chi Psidium, họ Đào kim nương (Myrtaceae), bộ Sim (Myrtales) theo hệ thống APG II (2003) và APG III (2009). Thành phần hóa học trong lá chứa tinh dầu (dl-limonen, eugenol), các hợp chất triterpenoid (betulinic acid, lupeol, acid maslinic, acid guajavalic), 16 dẫn xuất carotenoid, hợp chất nhân benzen, tanin pyrogalic (7–10%) và nhóm flavonoid đa dạng (quercetin, avicularin, guaijaverin, myricetin, kaempferol, luteolin).
• Đặc điểm các chủng vi khuẩn đích:
  • Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA): Vi khuẩn cầu Gram dương, không di động, không sinh bào tử, là tác nhân gây nhiễm trùng cơ hội, viêm phổi, nhiễm trùng huyết và có tỷ lệ kháng đa kháng sinh rất cao.
  • Escherichia coli: Trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, thường trú ở đường tiêu hóa nhưng là tác nhân hàng đầu gây tiêu chảy, nhiễm trùng đường tiểu, nhiễm trùng huyết.
  • Salmonella typhi: Trực khuẩn Gram âm, có lông, di động, tác nhân gây bệnh thương hàn, xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột.
  • Pseudomonas aeruginosa: Trực khuẩn mủ xanh Gram âm, gây nhiễm trùng cơ hội trên vết bỏng, mắt, đường tiết niệu và đường hô hấp ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch.
• Tiêu chuẩn đánh giá dược liệu và thử nghiệm sinh học: Tiêu chuẩn cao dược liệu và giới hạn nhiễm khuẩn theo quy định của Dược điển Việt Nam IV (2009); tiêu chuẩn thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu theo chuẩn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Phòng thí nghiệm Hoa Kỳ (CLSI, 2008, 2009, 2010).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Thu nhận và xử lý mẫu dược liệu: Lá ổi tươi sau thu hái được rửa sạch, phơi khô tự nhiên ở điều kiện thoáng khí, sau đó nghiền nhỏ thành bột thô để phục vụ trích ly.
• Phương pháp chiết tách dược liệu:
  • Chiết rắn - lỏng: Sử dụng kỹ thuật ngâm dầm bột lá ổi với dung môi ethanol ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ theo tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1:6 (w/v). Lọc chân không thu dịch chiết, sau đó loại dung môi bằng thiết bị cô quay chân không ở nhiệt độ 50–60°C để thu cao thô ethanol.
  • Chiết lỏng - lỏng: Hòa tan cao thô với nước cất theo tỷ lệ khối lượng/thể tích 1:10 (w/v). Tiến hành chiết lỏng - lỏng phân đoạn lần lượt bằng bình lóng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: Hexane (kém phân cực), Ethyl axetat (phân cực trung bình) và Nước (phân cực mạnh). Dịch chiết từng phân đoạn được cô quay chân không để thu các dạng cao đặc tương ứng.
• Phương pháp khảo sát giới hạn nhiễm khuẩn: Đánh giá theo Dược điển Việt Nam IV (2009). Mẫu cao chiết được hòa tan trong DMSO (1 mg/mL). Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được trên môi trường Nutrient Agar (NA) ủ ở 37°C trong 24–48 giờ; đếm tổng số nấm men – nấm mốc trên môi trường Sabouraud Dextrose Agar (SDA) ủ ở 28–30°C trong 5 ngày.
• Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn (định tính và bán định lượng): Sử dụng kỹ thuật khuếch tán qua giếng thạch (Well Diffusion Assay) trên môi trường Mueller Hinton Agar (MHA). Nồng độ huyền dịch vi khuẩn thử nghiệm được chuẩn hóa đạt 0,5 McFarland (tương đương mật độ $1 - 2 \times 10^8\text{ CFU/mL}$). Đục giếng thạch vô trùng đường kính 6 mm. Mẫu cao chiết thử nghiệm ở nồng độ 100 mg/mL pha trong DMSO; thể tích nạp vào mỗi giếng là 70 µL. Mẫu đối chứng dương là streptomycin (20 µg/mL), đối chứng âm là DMSO 1%. Các đĩa thạch được ủ ở 37°C trong 18–24 giờ; đo đường kính vòng vô khuẩn và xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Excel.
• Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Áp dụng phương pháp pha loãng trong môi trường thạch (Agar Dilution Method) theo chuẩn CLSI (2010). Từ dung dịch gốc nồng độ 100 mg/mL, dịch cao chiết được pha loãng bậc hai liên tiếp trong DMSO (các nồng độ tương ứng 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64), sau đó phối trộn với thạch MHA vô trùng. Nhỏ 2 µL huyền dịch vi khuẩn nồng độ $10^6\text{ CFU/mL}$ lên mặt thạch, ủ ở 37°C trong 18–24 giờ để ghi nhận nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật.
• Phương pháp phân đoạn sắc ký và xác định cấu trúc:
  • Sắc ký cột (Column Chromatography): Sử dụng chất hấp phụ silica gel Merck pha thường (cỡ hạt 0,040–0,063 mm) và silica gel pha đảo RP-18 $F_{254}$, kết hợp kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).
  • Xác định cấu trúc: Đo điểm nóng chảy trên máy BOTIUS; đo phổ khối lượng ESI-MS (máy Agilent 1100 LC-MSD Trap) và HR-ESI-MS (máy Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS); đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$ 500 MHz và $^{13}\text{C-NMR}$ 125 MHz) trên máy Bruker AM500 FT-NMR tại Viện Hóa học (sử dụng TMS làm chất chuẩn nội).

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Đặt vấn đề

Chương này phân tích thực trạng nhiệt đới ẩm tại Việt Nam làm gia tăng các bệnh lý nhiễm trùng ngoài da và niêm mạc; tổng quan nguy cơ từ cuộc khủng hoảng kháng kháng sinh toàn cầu và vị trí của Việt Nam trong danh sách các nước có tỷ lệ kháng thuốc cao theo số liệu WHO năm 2013. Tác giả chỉ ra tính cấp thiết của việc tìm kiếm nguồn dược chất thiên nhiên từ lá ổi (Psidium guajava L.) để kháng lại các chủng vi khuẩn đa kháng thường gặp. Chương đặt ra mục tiêu tổng quát và phân định rõ 7 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể của khóa luận.

Phần II: Tổng quan tài liệu

Chương II hệ thống hóa toàn diện các tài liệu lý thuyết và thực nghiệm liên quan đến đề tài:

• Phân loại thực vật học, nguồn gốc địa lý, đặc điểm hình thái và phân bố của cây ổi (Psidium guajava L.).
• Tổng hợp thành phần hóa học (flavonoid, triterpenoid, carotenoid, tinh dầu, tanin) và giá trị dược liệu của các bộ phận cây ổi trong y học cổ truyền và y học hiện đại.
• Tổng quan sinh học và cơ chế gây bệnh của 4 tác nhân vi khuẩn: Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA), Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa.
• Lịch sử nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của lá ổi trong và ngoài nước (các công trình của Gnan & Demello 1999, Abdelrahim 2002, Mahfuzul Hoque 2007, Nobre 2008, Mohammed 2017, Garode 2014, Huỳnh Kim Diệu 2010, Lê Quốc Duy 2016).
• Lý thuyết về các phương pháp chiết xuất cao dược liệu (ngâm dầm, ngấm kiệt, Soxhlet, chiết lỏng - lỏng), tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao theo Dược điển Việt Nam IV, các phương pháp thử hoạt tính sinh học (khuếch tán giếng thạch, pha loãng liên tiếp xác định MIC theo chuẩn CLSI) và phương pháp phân tích phổ (NMR, ESI-MS).

Phần III: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương III mô tả chi tiết địa điểm, thời gian, nguồn gốc mẫu dược liệu lá ổi Tây Ninh và các chủng vi khuẩn kiểm định ATCC; liệt kê đầy đủ hệ thống máy móc thiết bị, dụng cụ, hóa chất tinh khiết và môi trường nuôi cấy vi sinh. Tác giả trình bày chi tiết sơ đồ bố trí thí nghiệm toàn diện từ khâu xử lý nguyên liệu, chiết thô bằng ethanol, chiết lỏng - lỏng phân đoạn (Hexane, Ethyl axetat, Nước), kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn, thử nghiệm giếng thạch, xác định MIC theo chuẩn CLSI, đến quy trình phân đoạn bằng sắc ký cột silica gel và đo phổ cấu trúc.

Phần IV: Kết quả và thảo luận

Chương IV trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

• Kết quả định danh thực vật xác nhận mẫu lá nghiên cứu là loài Psidium guajava L. thuộc họ Myrtaceae.
• Khảo sát hiệu suất chiết xuất cao thô ethanol và hiệu suất phân bố khối lượng của các phân đoạn chiết lỏng - lỏng (Nước, Ethyl axetat, Hexane).
• Kết quả kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn khẳng định các mẫu cao đều đạt tiêu chuẩn an toàn vi sinh của Dược điển Việt Nam IV.
• Đánh giá định tính và bán định lượng đường kính vòng kháng khuẩn của từng loại cao chiết đối với 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm, chỉ rõ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các hệ dung môi.
• Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các phân đoạn cao chiết có hoạt tính.
• Quá trình điều chế các phân đoạn thứ cấp từ cao ethyl axetat bằng sắc ký cột và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn này.

Phần V: Kết luận và đề nghị

Chương V tóm lược các kết quả chính về mặt chiết xuất và hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn cao lá ổi, khẳng định tiềm năng vượt trội của phân đoạn ethyl axetat. Đồng thời, tác giả đưa ra các kiến nghị mang tính định hướng cho việc tiếp tục phân lập tinh sạch và xác định cấu trúc chi tiết của các hợp chất tinh khiết từ phân đoạn tiềm năng.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chi tiết

1. Hiệu suất chiết xuất cao dược liệu:
   • Từ 4,0 kg bột lá ổi khô ban đầu, sau quá trình chiết ngâm dầm với ethanol và cô quay chân không, thu được 1,84 kg cao đặc ethanol thô, đạt hiệu suất chiết 46,0%.
   • Tiến hành chiết lỏng - lỏng phân đoạn từ cao thô ethanol với ba dung môi có độ phân cực khác nhau, khối lượng và hiệu suất thu hồi (tính trên lượng bột dược liệu ban đầu) được ghi nhận trong bảng sau:

Dung môi phân đoạn	Khối lượng cao thu được (g)	Hiệu suất thu hồi (%)
Nước	700,0	17,50
Ethyl axetat	500,0	12,50
Hexane	155,2	3,88

2. Kết quả khảo sát giới hạn nhiễm khuẩn:

   • Cả 3 loại cao chiết (Nước, Ethyl axetat, Hexane) đều không phát hiện sự nhiễm nấm men và nấm mốc (kết quả âm tính: ít hơn 10 CFU/g).
   • Số lượng vi khuẩn hiếu khí sống sót trong các mẫu cao chiết:
     • Cao nước: $5,18 \times 10^2\text{ CFU/g}$
     • Cao ethyl axetat: $6,86 \times 10^2\text{ CFU/g}$
     • Cao hexane: $1,95 \times 10^3\text{ CFU/g}$
   • Tất cả các mẫu cao đều nằm trong giới hạn cho phép của Dược điển Việt Nam IV năm 2009 đối với cao thuốc (quy định tổng số vi khuẩn hiếu khí không quá $5 \times 10^4\text{ CFU/g}$).

3. Khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết (ở nồng độ 100 mg/mL):

   • Cao hexane: Không thể hiện khả năng kháng khuẩn đối với bất kỳ chủng vi khuẩn nào trong 4 chủng thử nghiệm (không tạo vòng vô khuẩn).
   • Cao nước: Có khả năng kháng khuẩn ở mức độ trung bình, tạo đường kính vòng vô khuẩn đối với E. coli ($20,33 \pm 1,62\text{ mm}$), S. typhi ($15,67 \pm 0,33\text{ mm}$), P. aeruginosa ($15,33 \pm 0,57\text{ mm}$) và MRSA ($22,33 \pm 0,57\text{ mm}$).
   • Cao ethyl axetat: Thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trên tất cả các chủng, đặc biệt đạt hiệu quả ức chế cao nhất trên chủng vi khuẩn đa kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) với đường kính vòng kháng khuẩn lên đến $31,67 \pm 1,52\text{ mm}$.

Phân đoạn cao chiết	E. coli (mm)	S. typhi (mm)	P. aeruginosa (mm)	MRSA (mm)
Cao Nước	$20,33 \pm 1,62$	$15,67 \pm 0,33$	$15,33 \pm 0,57$	$22,33 \pm 0,57$
Cao Ethyl axetat	Thể hiện hoạt tính mạnh	Thể hiện hoạt tính mạnh	Thể hiện hoạt tính mạnh	$31,67 \pm 1,52$
Cao Hexane	0	0	0	0

Đóng góp của nghiên cứu

• Về mặt thực nghiệm: Xác lập quy trình chiết xuất và phân đoạn cao lá ổi thu hái tại Tây Ninh; chứng minh mối tương quan giữa độ phân cực của dung môi với hiệu suất thu hồi cao và hoạt tính sinh học. Dung môi có độ phân cực trung bình (ethyl axetat) cho thấy khả năng làm giàu các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất.
• Về mặt dược liệu học: Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm có độ tin cậy cao về khả năng ức chế chủng vi khuẩn đa kháng nguy hiểm MRSA ($31,67\text{ mm}$) của phân đoạn cao ethyl axetat lá ổi tại Việt Nam, vượt trội so với các phân đoạn nước và hexane, tạo nền tảng vững chắc cho các nghiên cứu tinh chế hoạt chất kháng sinh tự nhiên tiếp theo.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

• Mẫu dược liệu lá ổi mới chỉ được thu hái tại một địa điểm địa lý đơn lẻ (thành phố Tây Ninh) trong một khoảng thời gian nhất định (tháng 2/2019 – tháng 5/2019), chưa phản ánh được sự biến thiên hàm lượng hoạt chất theo mùa vụ hoặc theo các vùng sinh thái khác nhau.
• Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn mới dừng lại ở quy mô in vitro trên 4 chủng vi khuẩn kiểm định chuẩn ATCC, chưa khảo sát trên các chủng phân lập lâm sàng thực tế từ bệnh viện.
• Việc phân tách các phân đoạn sắc ký và giải mã cấu trúc hóa học phân tử chi tiết của các hợp chất đơn lẻ từ cao ethyl axetat còn cần thêm thời gian và dữ liệu phổ đầy đủ hơn để hoàn thiện định danh đơn chất.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn cao ethyl axetat trên tập mẫu vi khuẩn lâm sàng đa kháng thuốc thu thập tại các bệnh viện.
• Tiếp tục thực hiện sắc ký cột tinh chế trên phân đoạn cao ethyl axetat để phân lập các hợp chất đơn lẻ tinh khiết và xác định cấu trúc hóa học hoàn chỉnh bằng phổ NMR, MS.
• Nghiên cứu cơ chế tác động kháng khuẩn ở mức độ tế bào và phân tử của các phân đoạn hoạt tính (tác động lên màng tế bào, ức chế tổng hợp thành tế bào hoặc ức chế protein).
• Khảo sát độc tính tế bào (cytotoxicity) và đánh giá hiệu quả kháng khuẩn in vivo trên mô hình động vật thí nghiệm.
• Nghiên cứu công thức bào chế các chế phẩm ứng dụng thực tế từ cao chiết lá ổi, chẳng hạn như gel bôi ngoài da, dung dịch sát trùng vết thương hoặc nước súc miệng kháng khuẩn.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng hưởng lợi: Tài liệu là nguồn tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và các nghiên cứu viên thuộc chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Sinh học - Y Dược, Dược học, Hóa thực vật và Vi sinh học ứng dụng.
• Nội dung có giá trị tham khảo cao:
  • Quy trình thực nghiệm chiết xuất ngâm dầm và kỹ thuật chiết lỏng - lỏng phân đoạn tách chiết hợp chất tự nhiên theo gradient độ phân cực.
  • Phương pháp kiểm tra giới hạn vi sinh vật trong cao dược liệu bám sát hướng dẫn của Dược điển Việt Nam IV.
  • Quy trình chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn 0,5 McFarland, kỹ thuật khuếch tán giếng thạch trên môi trường MHA và phương pháp xác định MIC theo chuẩn CLSI.
  • Bảng số liệu đối sánh thực nghiệm về hiệu suất chiết và hoạt tính kháng khuẩn giữa các phân đoạn phân cực khác nhau của lá cây ổi.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Dung môi ban đầu được sử dụng để chiết cao thô từ lá ổi là gì và hiệu suất thu nhận đạt bao nhiêu?

Quá trình chiết thô ban đầu sử dụng kỹ thuật ngâm dầm bột lá ổi với dung môi ethanol ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ theo tỷ lệ 1:6 (w/v). Từ 4,0 kg bột dược liệu lá ổi khô, sau khi cô quay chân không ở 50–60°C đã thu được 1,84 kg cao đặc ethanol thô, tương ứng với hiệu suất chiết đạt 46,0%.

2. Trong các phân đoạn chiết lỏng - lỏng, phân đoạn nào cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất và trên chủng vi khuẩn nào?

Phân đoạn cao ethyl axetat (dung môi có độ phân cực trung bình) thể hiện hoạt tính kháng khuẩn vượt trội nhất đối với cả 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Trong đó, hiệu quả ức chế mạnh nhất được ghi nhận trên chủng vi khuẩn đa kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC 43300 với đường kính vòng vô khuẩn lên tới $31,67 \pm 1,52\text{ mm}$ ở nồng độ 100 mg/mL.

3. Các mẫu cao chiết lá ổi có đạt tiêu chuẩn an toàn về giới hạn nhiễm khuẩn theo Dược điển Việt Nam IV không?

Có. Tất cả các mẫu cao chiết (Nước, Ethyl axetat, Hexane) đều âm tính với nấm men và nấm mốc (dưới 10 CFU/g). Tổng số vi khuẩn hiếu khí dao động từ $5,18 \times 10^2\text{ CFU/g}$ (cao nước), $6,86 \times 10^2\text{ CFU/g}$ (cao ethyl axetat) đến $1,95 \times 10^3\text{ CFU/g}$ (cao hexane), tất cả đều thấp hơn rất nhiều so với ngưỡng giới hạn tối đa cho phép của Dược điển Việt Nam IV năm 2009 ($5 \times 10^4\text{ CFU/g}$).

4. Đề tài đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên những chủng vi sinh vật nào và theo các tiêu chuẩn kỹ thuật nào?

Nghiên cứu tiến hành khảo sát trên 04 chủng vi khuẩn chuẩn ATCC gồm: Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC 43300, Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhi ATCC 14028 và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Phương pháp định tính kháng khuẩn giếng thạch được thực hiện trên môi trường MHA với huyền dịch 0,5 McFarland, và phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được thiết kế dựa trên tiêu chuẩn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Phòng thí nghiệm Hoa Kỳ (CLSI).

5. Những phương pháp phân tích phổ và thiết bị nào được đề cập trong khóa luận để xác định cấu trúc hợp chất?

Để phân tích cấu trúc các hợp chất tự nhiên phân lập từ lá ổi, khóa luận sử dụng: thiết bị đo điểm nóng chảy BOTIUS; hệ thống khối phổ ion hóa phun mù điện tử ESI-MS (máy Agilent 1100 LC-MSD Trap) và khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS (máy Agilent 6530 Q-TOF LC/MS); cùng hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$ 500 MHz và $^{13}\text{C-NMR}$ 125 MHz) đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR sử dụng chất chuẩn nội tetramethylsilane (TMS).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Đoàn Thanh Liêm đã hoàn thành việc khảo sát tiềm năng kháng khuẩn của các phân đoạn cao chiết từ lá cây ổi (Psidium guajava L.) thu hái tại Tây Ninh đối với 4 chủng vi khuẩn gây bệnh gồm MRSA, E. coli, S. typhi và P. aeruginosa. Kết quả thực nghiệm khẳng định tất cả các mẫu cao đều đạt chuẩn an toàn vi sinh theo Dược điển Việt Nam IV năm 2009, trong đó phân đoạn cao ethyl axetat thể hiện hoạt tính kháng khuẩn vượt trội nhất, đặc biệt có khả năng ức chế rất mạnh đối với chủng vi khuẩn đa kháng thuốc MRSA với đường kính vòng vô khuẩn đạt $31,67 \pm 1,52\text{ mm}$. Công trình đã cung cấp đầy đủ luận cứ khoa học và cơ sở thực nghiệm vững chắc, mở ra tiềm năng ứng dụng lá ổi trong việc nghiên cứu và phát triển các chế phẩm dược liệu kháng khuẩn tự nhiên hỗ trợ điều trị y tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: Nguyễn Đoàn Thanh Liêm GVHD: ThS. Dương Nhật Linh Khóa Luận Tốt Nghiệp TS. Nguyễn Tấn Phát Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới nóng ẩm, người dân tiếp xúc nhiều với bùn đất ẩm ướt kéo dài chính là điều kiện thuận lợi cho các loài vi khuẩn, vi nấm phát triển mạnh, các bệnh về da và niêm mạc do nấm, nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra ngày càng phổ biến và nghiêm trọng (Al-Alawi và cs. Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc để trị bệnh ngày càng gia tăng, phương pháp chữa trị hiện nay chủ yếu là dùng kháng sinh nên dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi sinh vật (Trần Xuân Thuyết, 2011).

Vào năm 2013, theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), Việt Nam được xếp vào danh sách các nước có tỉ lệ kháng thuốc kháng sinh cao nhất thế giới (Theo WHO, 2013). Ở Châu Âu mỗi năm, số ca nhiễm và tử vong do vi khuẩn đa kháng thường gặp nhất thường là Escherichia coli, Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa (Francesca và cs. Nhiễm trùng thông thường trong chăm sóc sơ sinh đang ngày càng trở nên cực kỳ khó khăn, và đôi khi không thể điều trị (Francesca và cs. Vì vậy, việc tìm ra nguồn thuốc mới thay thế cho các thuốc đang sử dụng trở nên cấp thiết trong đó thực vật là những nguồn đầy tiềm năng đang được quan tâm.

Ổi (Psidium guajava L.) chứa nhiều hợp chất phenolic ức chế phản ứng peroxid hóa trong cơ thể, do đó nó có thể ngăn chặn các bệnh mãn tính khác nhau như bệnh tiểu đường, bệnh tim mạch và ung thư. Hơn nữa, ổi làm giảm lượng phóng xạ tự do trong cơ thể, có nghĩa là các polyphenol trong lá ổi có thể ngăn ngừa xơ vữa động mạch, đục thủy tinh thể và cũng ức chế lão hóa sinh học của cơ thể và da. Lá ổi chứa triterpenes, cineol và tannin. Ngoài ra, ba lavonoid (avicularin, guaijaverin và quercetin) đã được phân lập từ lá.

Trong lá trưởng thành, nồng độ flavonoid lớn nhất được tìm thấy trong: Quercetin > Myricetin > Kaempferol > Luteolin (Anand và cs. Ổi (Psidium guajava L.) rất giàu các chất chống oxy hóa, vitamin C, kali và chất xơ. Những thành phần dinh dưỡng này chính là những yếu tố làm nên lợi ích nhiều mặt về sức khỏe của trái ổi. Trong một số nghiên cứu, cây ổi (Psidium guajava L.) cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn gây bệnh đáng kể như Staphylococcus spp., Escherichia coli, Clostridium spp, Pseudomonas spp (Abdeirahirn và cs.

SVTH: Nguyễn Đoàn Thanh Liêm 2 GVHD: ThS. Dương Nhật Linh Khóa Luận Tốt Nghiệp TS. Nguyễn Tấn Phát Năm 2005, Mecks và cộng sự đã nghiên cứu ra được có hơn 20 hợp chất hoạt tính sinh học đã được chiết từ lá, thân, vỏ và rễ của cây ổi (Meckes và cs. Lá ổi được sử dụng để điều trị tiêu chảy và đau bụng.

Lá ổi đã được sử dụng ở Mỹ như là kháng sinh ở dạng thuốc bôi hoặc thuốc sắc cho vết thương, loét và đau răng (Meckes và cs. Theo kết quả nghiên cứu của Xavier và cộng sự (2016) đã cho thấy được hoạt tính của hợp chất Akaloids được chiết xuất từ cây ổi có thể điều trị bệnh viêm dạ dày mạn tính do vi khuẩn Helicobacter pylori gây ra (Xavier và cs. Mohammed và cộng sự (2016) đã cho thấy sự hiện diện của tanin, flavonoid, steroid, terpenoid, và phenol có trong dịch chiết lá cây ổi với các dung môi nước, ethanol, chloroform. Sau đó Mohammed và cộng sự đã đưa ra khả năng kháng vi khuẩn Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A và Salmonella paratyphi B của cao chiết nước bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch là cao nhất với đường kính kháng khuẩn tương ứng lần lượt là: 8mm, 9,6 mm, 12 mm (Mohammed và cs.