MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên trong nhiều lĩnh vực tăng lên đã dẫn đến sự phát triển nghiên cứu thu nhận exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn. Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường [115]. Các PS tách chiết được có sự đa dạng về cấu trúc và các tính chất chức năng. Chính vì vậy, nguồn EPS này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm cũng như mỹ phẩm.
Chúng là những tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel,. Hơn nữa, gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng được nghiên cứu phổ biến [88], [125], [139] … Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp. Đây là lý do chính khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng còn khá hạn chế. Từ khi LAB được "công nhận là vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm [59].
Nhiều chủng LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS – với những tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat,. Bên cạnh đó, nhờ những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với sức khỏe con người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic (LAB) được quan tâm nhiều hơn so với EPS từ các loài khác. Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide, vị trí liên kết trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng dụng của các EPS sinh tổng hợp bởi các chủng thuộc LAB khác nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],…. Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn khác nhau có thể liên quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành phần các chất dinh dưỡng trong quá trình 1 lên men cũng như điều kiện nuôi cấy và thu nhận.
Sự đa dạng này sẽ tạo nên những ảnh hưởng không nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính chất chức năng trong công nghệ thực phẩm. Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc biệt là cung cấp một số thông tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng Lactobacillus fermentum nói riêng, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum”. Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được: 1) Điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả nhất; 2) Một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm; 3) Một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu.
Với những đặc tính mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp chất được tổng hợp hóa học. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về polysaccharide 1. Giới thiệu chung về polysaccharide Polysaccharide (PS) là polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate và thường được coi là các polyme sinh học đa năng với các chức năng được biết đến như là nguồn năng lượng dự trữ (tinh bột, glycogen); tạo nên cấu trúc vững chắc cho thực vật hoặc động vật (cellulose, chitin); chất bảo vệ (exopolysaccharide của vi sinh vật),.
Trong chuỗi PS, các monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycoside. Sự khác nhau giữa các PS thường liên quan đến các monosaccharide cấu tạo nên chúng. Các PS chỉ chứa một loại monosaccharide được gọi là homopolysaccharide hoặc homoglycan. Các PS chứa nhiều hơn một loại monosaccharide được gọi là heteropolysaccharide hoặc heteroglycan.
Các monosaccharide có cấu trúc dị vòng được cấu tạo bởi các nguyên tử oxy, hydro, carbon. Sự phân loại các monosaccharide dựa vào số lượng nguyên tử carbon dạng vòng 7, 6, 5 cạnh hoặc dạng mạch hở. Các PS thường được tạo nên bởi các đơn vị lặp lại, bao gồm một hoặc nhiều monosaccharide và phổ biến nhất trong tự nhiên thường có cấu trúc vòng 6 cạnh (pyranose). Các monosaccharide này có cấu trúc dạng α và β.
Trong đó, dạng β-D-glucopyranose là phổ biến nhất. β-D-glucopyranose có thể chuyển đổi lẫn nhau tạo nên dạng cấu hình ghế (Hình 1. Ngoài ra, vòng 5 cạnh (furanose) cũng được coi là thành phần có vai trò quan trọng về mặt sinh học (Hình 1.1b) do chúng có mặt trong acid nucleic và một số PS từ vi sinh vật. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose (a) (b) (b) của fructose [29] 3 Trong những năm gần đây, nhiều loại PS mới có vai trò quan trọng trong y học và thương mại đã được thu nhận từ quá trình lên men vi sinh vật.
Các PS này có thể được sinh tổng hợp từ các loài vi sinh vật gây bệnh hoặc không gây bệnh. Trong đó, các PS được tổng hợp từ các loài vi sinh vật không gây bệnh đã được khai thác vì chúng có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và trong công nghệ sinh học với những tính chất độc đáo và mới lạ như tạo gel, khả năng tự phân hủy sinh học, tính bám dính sinh học,. Một số PS phổ biến đã được thu nhận từ vi sinh vật có thể kể đến như (i) xanthan, gellan, dextran, alternan, curdlan, exopolysaccharide (EPS) của vi khuẩn lactic (LAB), levan, alginate (từ vi khuẩn); (ii) pullulan, scleroglucan, schizophyllan và lentinan (từ nấm); và (iii) BYG (Beer’ yeast glucan) - các glucan thương mại từ nấm men bia [67]. Ứng dụng của polysaccharide Với nguồn nguyên liệu thu nhận phổ biến, chi phí thu nhận thấp đã góp phần giúp các hợp chất PS có thêm nhiều phạm vi ứng dụng hơn trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm,… Trong công nghệ thực phẩm: Các PS được sử dụng như những chất phụ gia được bổ sung vào quá trình chế biến thực phẩm với vai trò giúp hoàn thiện cấu trúc thực phẩm từ đó làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm: tạo gel, làm tăng độ nhớt, từ đó tạo nên sự ổn định của nhũ tương hoặc giúp ngăn chặn hiện tượng tách nước trong một số sản phẩm có bản chất cấu trúc gel đặc biệt là sữa chua [67].
Trong dược phẩm: PS được coi là những vật liệu sinh học phổ biến. Chúng đang đóng góp vai trò quan trọng cho quá trình phát triển sản phẩm mới trong dược phẩm và những ứng dụng y tế như các chất kết dính đơn giản hoặc là phương tiện phân phối thuốc tinh vi [67], [114]. Trong công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm: Nhờ các đặc tính tạo màng film, tạo gel cùng khả năng gắn các ion đã giúp cho các PS được sử dụng như là các công cụ vô giá trong công nghệ sinh học và trong công tác nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Chẳng hạn như, việc sử dụng agar tạo cho các khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển; sử dụng các PS hòa tan, không hòa tan và dẫn xuất của chúng giúp cố định protein, cố định enzyme và tế bào động vật hoặc sử dụng như dextran hoặc pullulan làm chất 4 chuẩn trong kỹ thuật phân tách các phân tử bằng phương pháp sắc ký như sắc ký khối phổ (mass spectrometry (MS)), sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography (HPLC)) [67], [114].
Nhìn chung, nhờ vào những tính chất chức năng công nghệ như khả năng tạo gel, tạo độ nhớt, làm bền nhũ tương cũng như khả năng tự phân giải nên các hợp chất PS càng ngày càng được quan tâm nghiên cứu khai thác bởi các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới [10], [19], [39], [136]. Một trong những nguồn cung cấp các hợp chất PS đang được quan tâm nhiều nhất là LAB đặc biệt là các PS được chúng tiết ra ngoài môi trường và được gọi là EPS. Tổng quan về Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum là một loài vi khuẩn Gram dương thuộc chi Lactobacillus (Lb.), các vi khuẩn này thường được tìm thấy trong các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật. Chúng là những vi khuẩn ưa ấm, có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, lên men dị hình chặt chẽ, có thể lên men các đường như glucose (glc), fructose (fruc), maltose, sucrose, lactose.
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng chịu các tác động không nhỏ bởi các yếu tố vật lý (pH, nhiệt độ, thời gian, …), các yếu tố hóa học (nguồn carbon (C) nguồn nitrogen (N),…). fermentum có thể tạo thành các khuẩn lạc màu trắng xám với đường kính khoảng 1µm. Hình dạng khuẩn lạc của chủng này có thể lồi lõm hoặc hơi lồi, bề mặt nhẵn (Hình 1. Đặc điểm nổi bật của khuẩn lạc Lb.
fermentum là có cấu trúc vòng tròn đồng tâm ở trung tâm khi được quan sát dưới kính hiển vi (Hình 1. Hầu hết các tế bào vi khuẩn được sắp xếp dưới dạng đơn lẻ hoặc theo cặp; chúng không có khả năng sinh bào tử và không di động [143]. Hình dạng khuẩn lạc Lb. fermentum [143] 5 Từ lâu, Lb.
fermentum đã được sử dụng như là giống khởi đầu cho quá trình lên men trong nhiều sản phẩm thực phẩm và đồ uống. Bên cạnh đó, cũng giống như các loài thuộc LAB khác, trong quá trình lên men carbohydrate, ngoài sản phẩm chính là acid lactic, Lb. fermentum còn tạo ra các hợp chất tạo hương (diacetyl/acetoin) và đặc biệt là các PS ngoại bào (EPS) [59]. Chúng là những hợp chất có giá trị thương mại lớn với các tính chất hóa lý có lợi như khả năng tạo gel, tạo kết cấu, tạo độ đặc trong thực phẩm cùng những tác động có lợi liên quan đến sức khỏe như có tiềm năng probiotic, làm giảm cholesterol, kích thích miễn dịch, chống ung thư [81], [89], [132].
Kể từ các chủng vi khuẩn lactic (LAB-Lactic Acid Bacteria) được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA- Food and Drug Administration) công nhận là vi khuẩn an toàn cho sức khỏe con người, sự quan tâm về EPS từ LAB nói chung đặc biệt là từ các loài Lb. fermentum nói riêng nhằm thay thế cho các PS từ thực vật ngày càng tăng trong xu hướng sản xuất, lưu thông các sản phẩm có tính chất tự nhiên và an toàn.