Xác Định Chữ Ký Methyl hóa DNA Trong U Tuyến Giáp Hình Thái Nang Đóng Kín

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học identification of dna methylation signatures in encapsulated, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải pháp cụ

• Tác giả: Nguyen Minh Hoang
• Người hướng dẫn: Nguyen Vu Phong, Ph.D
• Trường học: Nong Lam University
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Khám Phá Chữ Ký Methyl Hóa DNA Trong U Tuyến Giáp Hình Thái Nang Đóng Kín
• Loại tài liệu: graduation thesis
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thu Duc

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENTS
• CONFIRMATION AND ASSURANCE
• 1. CHAPTER 1: INTRODUCTION
• 1.1. Overview of encapsulated follicular-patterned thyroid tumors (EFPTTTs)
• 1.2. Challenges in the pathological diagnosis of EFPTTs
• 2. MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Discovery data - Gene Expression Omnibus (GEO)
• 2.2. TCGA Cohort
• 2.3. Data cohort from Juan
• 2.4. Introduction measurement of DNA methylation
• 2.5. PROCESSING CALA
• 2.6. Calling differential methylation positions (DMPs)
• 2.7. Feature importances - Random forest. Classification algorithm in machine learning. Validation of two cohorts
• 2.8. Analysis of position, genes and pathways of specific CpGs. Creating a demo shiny app as a tool for application
• 3. RESULTS AND DISCUSSION
• 3.1. Determine the significantly different DNA methylation positions (DMPs)
• 3.2. The first calling DMPs - between tumors and normal
• 3.3. The second calling DMPs - amongst FA, NIFTP, FC and fvPTC
• 3.4. Apply feature selection methods to collect CpGs
• 3.5. Classification Algorithm in Machine Learning
• 3.6. Validation
• 3.7. Analysis of position, genes and pathways of specific CpGs
• 3.8. DNA methylation level of 13 CpGs
• 3.9. Creating a demo shiny app as a tool for the clinical application
• 3.10. Calling DMR regression
• 4. CHAPTER 4: DISCUSSION
• 5. CHAPTER 5: CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS
• 5.1. Recommendations
• REFERENCES
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Chữ Ký Methyl Hóa DNA Trong U Tuyến Giáp

U tuyến giáp hình thái nang đóng kín (EFPTTs) là một trong những loại u thường gặp trong thực hành bệnh lý tuyến giáp. Chúng bao gồm các loại u lành tính, u có khả năng ác tính không rõ ràng và u ác tính. Việc phân loại và chẩn đoán chính xác các loại u này gặp nhiều khó khăn do sự chồng chéo về hình thái và sự biến đổi trong biểu hiện gen. Nghiên cứu này nhằm phát triển một phương pháp chẩn đoán mới dựa trên chữ ký methyl hóa DNA để phân biệt các loại u này.

1.1. Đặc Điểm Của U Tuyến Giáp Hình Thái Nang

U tuyến giáp hình thái nang bao gồm nhiều loại như adenoma nang, NIFTP, và carcinoma. Mỗi loại có đặc điểm hình thái và sinh học riêng, gây khó khăn trong việc chẩn đoán chính xác.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Methyl Hóa DNA Trong Chẩn Đoán

Methyl hóa DNA đã được chứng minh là một chỉ số sinh học tiềm năng trong việc phân loại các loại u tuyến giáp. Nghiên cứu cho thấy sự khác biệt trong mức độ methyl hóa giữa các loại u có thể giúp cải thiện độ chính xác trong chẩn đoán.

II. Thách Thức Trong Chẩn Đoán U Tuyến Giáp Hình Thái Nang

Chẩn đoán u tuyến giáp hình thái nang đóng kín gặp nhiều thách thức do sự chồng chéo về hình thái và thiếu sự đồng thuận giữa các bác sĩ. Các phương pháp hiện tại như xét nghiệm gen không đủ để phân loại chính xác. Điều này dẫn đến nguy cơ chẩn đoán sai và điều trị không cần thiết.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Phân Loại U

Sự chồng chéo về hình thái giữa các loại u khiến cho việc phân loại trở nên khó khăn. Các bác sĩ thường phải dựa vào hình ảnh mô học, điều này có thể dẫn đến sai sót.

2.2. Hệ Quả Của Chẩn Đoán Sai

Chẩn đoán sai có thể dẫn đến các biện pháp điều trị không cần thiết như phẫu thuật hoặc hóa trị, gây ra gánh nặng cho bệnh nhân và hệ thống y tế.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Chữ Ký Methyl Hóa DNA

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để xác định chữ ký methyl hóa DNA trong các mẫu u tuyến giáp. Các mẫu được phân tích bằng cách sử dụng công nghệ methyl hóa DNA để xác định các vị trí methyl hóa khác nhau giữa các loại u.

3.1. Quy Trình Phân Tích Methyl Hóa DNA

Quy trình bao gồm thu thập mẫu, xử lý và phân tích dữ liệu methyl hóa. Các mẫu được chia thành nhóm huấn luyện và kiểm tra để xây dựng mô hình phân loại.

3.2. Sử Dụng Machine Learning Trong Phân Tích

Mô hình phân loại được xây dựng dựa trên các chữ ký methyl hóa và các thuật toán machine learning như Random Forest để cải thiện độ chính xác trong chẩn đoán.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Methyl Hóa DNA

Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt rõ rệt trong mức độ methyl hóa giữa các loại u tuyến giáp. Các vị trí methyl hóa cụ thể đã được xác định và có liên quan đến sự phát triển của khối u. Mô hình phân loại đạt độ chính xác cao trong việc phân biệt các loại u.

4.1. Các Vị Trí Methyl Hóa Quan Trọng

Nghiên cứu đã xác định 13 vị trí CpG có sự khác biệt đáng kể trong mức độ methyl hóa giữa các loại u, cung cấp thông tin quý giá cho việc phân loại.

4.2. Hiệu Quả Của Mô Hình Phân Loại

Mô hình phân loại dựa trên methyl hóa DNA cho thấy độ chính xác cao, với AUC đạt 0.7, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn.

V. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chữ ký methyl hóa DNA có thể là một công cụ chẩn đoán hữu ích trong việc phân loại u tuyến giáp hình thái nang đóng kín. Các kết quả cho thấy cần tiếp tục nghiên cứu để xác định rõ hơn các cơ chế sinh học liên quan.

5.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc sử dụng methyl hóa DNA như một chỉ số sinh học trong chẩn đoán u tuyến giáp.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu để xác định rõ hơn các con đường sinh học liên quan đến methyl hóa DNA và phát triển các phương pháp chẩn đoán mới.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

U tuyến giáp thể nang có vỏ bao (Encapsulated Follicular-Patterned Thyroid Tumors - EFPTTs) là nhóm tổn thương thường gặp trong thực hành giải phẫu bệnh tuyến giáp, chiếm từ 4% đến 7% dân số có nhân giáp trên lâm sàng. Nhóm u này bao gồm phổ bệnh học rộng:

• U lành tính: U tuyến thể nang (Follicular Adenoma - FA).
• Nhóm u ranh giới/nguy cơ ác tính thấp: U tân sinh tuyến giáp thể nang không xâm lấn với các đặc điểm nhân giống dạng nhú (Noninvasive Follicular Thyroid Neoplasm with Papillary-like Nuclear Features - NIFTP), u biệt hóa tốt có tiềm năng ác tính không xác định (Well-Differentiated Tumor of Uncertain Malignant Potential - WDT-UMP), và u thể nang có tiềm năng ác tính không xác định (Follicular Tumor of Uncertain Malignant Potential - FT-UMP).
• U ác tính: Ung thư tuyến giáp thể nang (Follicular Carcinoma - FC / FTC) và biến thể nang có vỏ bao xâm lấn của ung thư tuyến giáp dạng nhú (Invasive Encapsulated Follicular Variant Papillary Thyroid Carcinoma - IEFVPTC / fvPTC).

Trong thực tế lâm sàng, việc phân loại EFPTTs chủ yếu dựa trên đánh giá mô bệnh học qua hình ảnh nhuộm Hematoxylin & Eosin (H&E) về mức độ xâm lấn vỏ bao/mạch máu và thang điểm 3 thành phần của đặc điểm nhân tế bào dạng nhú (nuclear score 0–3). Tuy nhiên, các tiêu chí này ghi nhận sự biến thiên và bất đồng thuận cao giữa các nhà giải phẫu bệnh (chỉ số Kappa đối với xâm lấn nghi ngờ rất thấp, Kappa đánh giá nhân chỉ ở mức trung bình 0,452). Đồng thời, các biến đổi di truyền (đột biến gen nhóm RAS, BRAF, EIF1AX, các chuyển đoạn PAX8::PPARG, THADA) có sự chồng lấn giữa các phân nhóm, không đủ độ đặc hiệu để phân định chẩn đoán. Việc chẩn đoán thiếu chính xác dẫn đến nguy cơ điều trị quá mức (overtreatment) như phẫu thuật cắt toàn bộ tuyến giáp, xạ trị iod phóng xạ hoặc hóa trị không cần thiết.

Nhằm giải quyết thách thức này, khóa luận tập trung nghiên cứu dấu ấn biểu sinh methyl hóa DNA—một chỉ dấu phân tử ổn định theo dòng tế bào và mô—với các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

1. Xác định các chữ ký methyl hóa DNA (DNA methylation signatures) đặc trưng ở các phân nhóm FA, fvPTC, NIFTP và FC.
2. Ứng dụng các chữ ký methyl hóa kết hợp thuật toán học máy giải thích được (interpretable machine learning) để xây dựng mô hình phân loại đa lớp cho EFPTTs.
3. Thẩm định độ chính xác và tính tổng quát của mô hình trên 2 tập dữ liệu đoàn hệ độc lập (TCGA cohort và Juan cohort).
4. Phân tích chức năng sinh học, vị trí gen và các con đường tín hiệu (pathways) liên quan đến các vị trí CpG methyl hóa sai hỏng.
5. Xây dựng công cụ phân loại trực quan dạng ứng dụng web (Shiny App) hỗ trợ chia sẻ dữ liệu và định hướng ứng dụng chẩn đoán.

Phân loại theo WHO 2022	Thực thể u (Subtype)	Mức độ ác tính	Đặc điểm xâm lấn vỏ bao/mạch	Điểm đặc điểm nhân (Nuclear Score)	Đột biến gen đặc trưng
Lành tính	Follicular Adenoma (FA)	Benign	Không xâm lấn (Absent)	0 (Vắng mặt)	RAS (đến 20%), PAX8::PPARG (<10%)
Ranh giới / Nguy cơ thấp	NIFTP	Low-risk	Không xâm lấn (Absent)	2 – 3 (Rõ nét)	RAS (đến 60%), THADA (đến 30%)
Ranh giới / Nguy cơ thấp	FT-UMP	Low-risk	Nghi ngờ (Questionable)	0 – 1 (Không đáng kể)	RAS (đến 20%), PAX8::PPARG (<10%)
Ranh giới / Nguy cơ thấp	WDT-UMP	Low-risk	Nghi ngờ (Questionable)	2 – 3 (Rõ nét)	RAS (đến 20%), PAX8::PPARG (Hiếm)
Ác tính	Follicular Carcinoma (FC)	Malignant	Có xâm lấn (Present)	0 – 1 (Không có đặc điểm PTC)	RAS (đến 50%), PTEN, TSHR (<10%)
Ác tính	IEFVPTC / fvPTC	Malignant	Có xâm lấn (Present)	2 – 3 (Điển hình dạng nhú)	RAS (đến 70%), BRAF non-V600E

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và công nghệ phân tích biểu sinh

Khóa luận vận dụng cơ sở sinh học phân tử về methyl hóa DNA: quá trình gắn nhóm methyl ($-CH_3$) vào vị trí carbon số 5 của cytosine để tạo thành 5-methylcytosine ($5mC$) tại các vị trí dinucleotide CpG nhờ enzyme DNA methyltransferase (DNMT). Trong bộ gen người có khoảng 28 triệu vị trí CpG. Sự biến đổi methyl hóa tại các đảo CpG (CpG islands) ở vùng promoter điều hòa bất hoạt gen ức chế khối u hoặc tái kích hoạt gen sinh ung.

Dữ liệu methyl hóa được lượng giá bằng mảng vi lai (microarray) của Illumina gồm ba thế hệ: HumanMethylation27 (27K), HumanMethylation450 (450K) và Infinium MethylationEPIC (850K). Mức độ methyl hóa tại mỗi vị trí được tính toán qua:

• Giá trị Beta ($\beta$ value): $\beta = \frac{M}{M + U + \alpha}$ (trong đó $M$ là cường độ tín hiệu methyl hóa, $U$ là không methyl hóa, hằng số $\alpha = 100$).
• Giá trị M ($M$ value): $M = \log_2\left(\frac{M}{U}\right)$, sử dụng trong các kiểm định thống kê chuyên sâu.

Nguồn dữ liệu nghiên cứu

• Tập dữ liệu khám phá (Discovery dataset): Thu thập từ 4 nghiên cứu công khai trên cơ sở dữ liệu NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) gồm 178 mẫu (77 mô tuyến giáp bình thường, 37 FA, 36 FC, 22 fvPTC, 6 NIFTP) từ các mã định danh: GSE51090 (nền tảng 27K), GSE53051 (450K), GSE97466 (450K), GSE121377 (850K).
• Tập dữ liệu thẩm định (Validation cohorts):
  • TCGA cohort: Dự án TCGA-THCA ban đầu gồm 107 mẫu, được 2 chuyên gia giải phẫu bệnh độc lập xem xét và chẩn đoán lại dựa trên tiêu bản H&E, chọn lọc được 29 mẫu đạt tiêu chuẩn đồng thuận (24 fvPTC, 5 FC).
  • Juan cohort (Juan et al., 2022): Dữ liệu mảng EPIC 850K gồm 32 mẫu (5 FA, 10 FC, 7 fvPTC và các mẫu liên quan).

Quy trình phân tích tin sinh học và học máy

Toàn bộ quy trình được thực hiện trên môi trường R 4.2.1 và Bioconductor:

1. Tiền xử lý và kiểm soát chất lượng (QC): Sử dụng gói minfi và meffil để tính toán $p$-value phát hiện tín hiệu (loại bỏ đầu dò có detection $p$-value > 0,01 hoặc tỷ lệ phát hiện < 99%); chuẩn hóa phân vị phân tầng (stratified quantile normalization) bằng hàm preprocessQuantile; loại bỏ các đầu dò chứa biến thể đa hình đơn nucleotide (SNPs) và đầu dò phản ứng chéo (cross-reactive probes theo công bố của Chen et al., 2013). Sau khi hợp nhất các nền tảng, giữ lại 21.253 vị trí CpG chung.
2. Xác định vị trí methyl hóa sai biệt (DMPs Calling): Dùng gói DMRcate.
   • Lần 1: So sánh từng phân nhóm u với mô bình thường (FDR < 0,01 và $|\Delta\beta| > 0,2$) để lọc các vị trí CpG sai biệt giữa khối u và mô lành.
   • Lần 2: Loại bỏ mẫu bình thường, so sánh từng phân nhóm u với các phân nhóm u còn lại trong nhóm EFPTTs (FA vs non-FA, NIFTP vs non-NIFTP, FC vs non-FC, fvPTC vs non-fvPTC; FDR < 0,01) để thu thập các CpG đặc hiệu phân nhóm.
3. Lựa chọn đặc trưng (Feature Selection): So sánh các thuật toán MUVR (mô hình lõi PLS và Random Forest), hồi quy đa thức phạt L2 glmnet ($\lambda$ tối ưu), và chỉ số tạp chất Gini từ randomForest. Đánh giá tối ưu hóa thông qua quy trình Cross-Validation lặp 100 lần (tỷ lệ phân chia train/validation là 7:3).
4. Huấn luyện mô hình phân loại: Thử nghiệm và đánh giá 4 thuật toán gồm Decision Tree (DT), Support Vector Machine (SVM), Boosting và Random Forest (RF) dựa trên các chỉ số AUC, AUPRC, và Accuracy.
5. Hiệu chuẩn điểm số (Score Calibration): Chuyển đổi điểm số bầu chọn thô từ Random Forest thành xác suất tin cậy phân loại thông qua mô hình hồi quy đa thức logistic phạt L2 bằng glmnet.
6. Phân tích chú giải chức năng và con đường sinh học: Sử dụng các gói annotatr và missmethyl để đối chiếu tọa độ bộ gen hg19 (vùng promoter, exon, intron, CpG island, shore, shelf, open sea), phân tích làm giàu con đường sinh học theo Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) và Gene Ontology (GO).
7. Phân tích vùng methyl hóa sai biệt (DMR Calling): Xác định các vùng chứa nhiều CpG sai biệt liên tiếp bằng DMRcate theo mức độ ác tính tăng dần (0: Normal, 1: Benign/FA, 2: Borderline/NIFTP, 3: Malignant/FC & fvPTC).
8. Phát triển ứng dụng Web: Sử dụng gói shiny trong R để xây dựng giao diện tải dữ liệu mảng methyl hóa và phân loại tự động.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chapter 1: Introduction

Chương mở đầu trình bày vị trí và dịch tễ học của các khối u bắt nguồn từ tế bào nang tuyến giáp. Tác giả nhấn mạnh vấn đề nan giải trong chẩn đoán giải phẫu bệnh đối với nhóm EFPTTs theo phân loại của WHO (2022). Khóa luận nêu rõ các nguy cơ lâm sàng bắt nguồn từ việc đánh giá chủ quan hình thái học và sự chồng chéo của các đột biến gen. Từ đó, xác lập giả thuyết khoa học: hệ thống dấu ấn methyl hóa DNA có thể đóng vai trò như một bộ phân loại chính xác nhằm phân định FA, NIFTP, FC và fvPTC, đồng thời giúp khám phá các gen và con đường dẫn truyền tín hiệu điều hòa sự phát sinh khối u.

Chapter 2: Literature Review

Chương tổng quan tài liệu hệ thống hóa các kiến thức chuyên sâu về:

• Đặc điểm giải phẫu bệnh và tiêu chuẩn mô học của từng thực thể trong EFPTTs: tiêu chuẩn 4 bước của NIFTP, tiêu chí xâm lấn vỏ bao/mạch máu theo CAP (College of American Pathologists), thang điểm 3 thành phần đánh giá nhân tế bào dạng nhú.
• Hồ sơ biến đổi di truyền học của EFPTTs: đặc trưng bởi nhóm biến đổi dạng RAS-like và sự vắng mặt của đặc tính BRAFV600E-like.
• Cơ chế sinh học phân tử của hiện tượng methyl hóa DNA trong ung thư tuyến giáp: tình trạng giảm methyl hóa toàn cục (hypomethylation) ưu thế ở các u dạng nhú và tăng methyl hóa (hypermethylation) ở ung thư thể nang (FC), liên quan đến sự bất hoạt các gen ức chế khối u như CDKN2A, RASSF1A, PTEN.
• Các nghiên cứu tiền đề ứng dụng methyl hóa trong phân loại u thần kinh trung ương (bộ phân loại Heidelberg với 82 phân nhóm) và u sarcoma (62 phân nhóm), tạo tiền đề vững chắc cho việc áp dụng học máy trên dữ liệu biểu sinh phân loại EFPTTs.

Chapter 3: Materials and Methods

Chương phương pháp mô tả chi tiết quy trình xử lý dữ liệu và thiết kế thực nghiệm:

• Thu thập và chuẩn hóa dữ liệu vi lai methyl hóa từ 4 bộ dữ liệu GEO và 2 bộ đoàn hệ độc lập (TCGA và Juan).
• Thiết lập quy trình tiền xử lý, kiểm soát chất lượng, loại bỏ các biến thể SNPs và đầu dò lai chéo.
• Phân chia tập dữ liệu khám phá (n=178) thành tập huấn luyện (training data, n=127) và tập kiểm tra (testing data, n=51).
• Quy trình gọi DMPs 2 bước kết hợp các phương pháp giảm chiều dữ liệu và lựa chọn biến quan trọng (MUVR, glmnet, Random Forest Gini importance).
• Thiết lập kiến trúc mô hình học máy đa lớp, hiệu chuẩn xác suất chẩn đoán bằng mô hình hồi quy đa thức L2 và cấu trúc phát triển ứng dụng Shiny.

Phân nhóm mẫu (Subtypes)	Tập huấn luyện (Training, n=127)	Tập kiểm tra (Testing, n=51)	Tổng cộng (Discovery, n=178)
Follicular Adenoma (FA)	27	10	37
NIFTP	4	2	6
Follicular Carcinoma (FC)	28	8	36
fvPTC	13	9	22
Mô tuyến giáp bình thường (Normal)	55	22	77

Chapter 4: Results and Discussion

Chương kết quả và thảo luận trình bày chi tiết các phát hiện phân tử và hiệu năng của mô hình:

• Kết quả gọi DMPs: Bước gọi DMPs thứ nhất (U vs Lành tính) xác định được 384 vị trí CpG sai biệt có ý nghĩa ($FDR < 0,01$ và $|\Delta\beta| > 0,2$). Trong đó, NIFTP chiếm ưu thế giảm methyl hóa (241/254 CpGs), trong khi FC chiếm ưu thế tăng methyl hóa (116/119 CpGs). Bước gọi DMPs thứ hai giữa 4 phân nhóm u trích xuất được 79 CpGs đặc hiệu (71 CpGs phân định NIFTP, 4 CpGs cho FC, 3 CpGs cho FA, 1 CpG cho fvPTC).
• Lựa chọn đặc trưng: Phương pháp MUVR-PLS mid đã xác định được tập đặc trưng tối ưu gồm đúng 13 CpGs với hiệu năng cao nhất qua 100 lần Cross-Validation. Phân tích thành phần chính (PCA) trên 13 CpGs này phân tách rõ ràng 4 phân nhóm u so với việc dùng toàn bộ 21.253 đầu dò ban đầu.
• Hiệu năng mô hình học máy: Thuật toán Random Forest (1.000 cây quyết định, $mtry = 3$) vượt trội hơn Decision Tree, SVM và Boosting. Mô hình đạt hiệu năng phân loại tuyệt đối với NIFTP ($AUC = 1,0$), phân loại tốt FA ($AUC = 0,86$), FC ($AUC = 0,79$) và fvPTC ($AUC = 0,65$). Kiểm định loại trừ hiệu ứng mẻ (Batch effects) theo nền tảng và nghiên cứu cho thấy chỉ số AUC duy trì ổn định ở mức xấp xỉ 0,85.
• Thẩm định trên 2 đoàn hệ độc lập: Đánh giá trên 29 mẫu TCGA-THCA và 32 mẫu của Juan cohort chứng minh tính tổng quát của mô hình.
• Phân tích chức năng sinh học: Đầu dò cg11484872 nằm tại vùng promoter của gen TNF, liên quan trực tiếp đến 4 con đường tín hiệu sinh ung gồm MAPK, NF-$\kappa$B, TNF signaling pathway và con đường chết theo chương trình (Apoptosis). Phân tích vùng DMR còn phát hiện biến đổi methyl hóa quan trọng liên quan đến gen ALX4.
• Ứng dụng Shiny App demo: Triển khai thành công giao diện web tích hợp điểm số hiệu chuẩn (Calibration Scores) cho phép người dùng nhập dữ liệu methyl hóa và nhận kết quả dự đoán phân nhóm u kèm độ tin cậy xác suất.

Chapter 5: Conclusions and Recommendations

Chương kết luận khẳng định tính khả thi của việc sử dụng chữ ký biểu sinh methyl hóa DNA trong chẩn đoán phân biệt EFPTTs. Khóa luận khuyến nghị tiếp tục mở rộng quy mô mẫu cho các phân nhóm u hiếm gặp (NIFTP, WDT-UMP, FT-UMP), kiểm chứng thực nghiệm bằng phương pháp giải trình tự bisulfite nhắm mục tiêu (Targeted Bisulfite Pyrosequencing) trên các mẫu bệnh phẩm mô đúc khối paraffin (FFPE) tại các cơ sở y tế trong nước.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính

• Trích xuất thành công tập dấu ấn gồm 13 vị trí CpG tối ưu từ 21.253 đầu dò vi lai, có khả năng phân định 4 thực thể u nang tuyến giáp.
• Phân định rõ đặc trưng biểu sinh giữa các phân nhóm: NIFTP thể hiện trạng thái giảm methyl hóa sâu sắc (hypomethylation) so với mô bình thường, trong khi FC thể hiện trạng thái tăng methyl hóa (hypermethylation).
• Mô hình phân loại Random Forest đạt các chỉ số phân loại cao trên tập dữ liệu kiểm tra:
  • Phân nhóm NIFTP: $AUC = 1,0$ (chẩn đoán chính xác 2/2 mẫu thử nghiệm).
  • Phân nhóm FA: $AUC = 0,86$.
  • Phân nhóm FC: $AUC = 0,79$.
  • Phân nhóm fvPTC: $AUC = 0,65$ (dự đoán đúng 6/9 mẫu thử nghiệm).
  • Khả năng chống chịu hiệu ứng mẻ (Batch Effect Invariance): AUC duy trì ~0,85 khi tích hợp các yếu tố gây nhiễu từ nền tảng mảng và nguồn nghiên cứu.
• Thẩm định độc lập thành công trên 29 mẫu đoàn hệ TCGA và 32 mẫu đoàn hệ Juan.
• Xác định mối liên hệ chức năng giữa dấu ấn methyl hóa cg11484872 tại promoter của gen TNF với 4 con đường sinh học ung thư (MAPK, NF-kappa B, TNF signaling, Apoptosis) và vùng DMR tại gen ALX4.

Thuật toán học máy (với 13 CpGs)	AUC	AUPRC	Accuracy
Decision Trees (DTs)	0,41	0,38	0,45
Support Vector Machines (SVMs)	0,72	0,68	0,65
Boosting	0,78	0,73	0,68
Random Forest (RF)	0,85	0,81	0,70

Đóng góp học thuật và thực tiễn

1. Đóng góp phương pháp luận: Cung cấp một quy trình tin sinh học hoàn chỉnh xử lý dữ liệu methyl hóa DNA đa nền tảng (27K, 450K, 850K) tích hợp học máy có khả năng giải thích, khắc phục sự phụ thuộc vào đánh giá chủ quan của hình thái học vi thể.
2. Giá trị chẩn đoán lâm sàng: Đưa ra giải pháp tiềm năng giúp hạn chế tình trạng chẩn đoán quá mức và phẫu thuật xâm lấn không cần thiết cho bệnh nhân mang khối u ranh giới NIFTP hoặc u lành tính FA.
3. Phát hiện sinh học mới: Làm sáng tỏ cơ chế điều hòa biểu sinh của gen TNF và ALX4 trong quá trình phát sinh và tiến triển của các khối u tuyến giáp thể nang.
4. Công cụ ứng dụng: Xây dựng nền tảng ứng dụng web Shiny tích hợp thuật toán hiệu chuẩn xác suất (Calibration Score) phục vụ cộng đồng nghiên cứu và định hướng triển khai chẩn đoán thực tế.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế về cỡ mẫu u ranh giới: Do hạn chế từ các bộ dữ liệu công khai, số lượng mẫu NIFTP còn khiêm tốn ($n=6$), đồng thời hai phân nhóm ranh giới khác là WDT-UMP và FT-UMP chưa thể đưa vào phân tích do thiếu dữ liệu mảng methyl hóa.
• Thiếu hụt thông tin lâm sàng: Một số bộ dữ liệu từ GEO bị khuyết các thông tin về tuổi, giới tính và chủng tộc do chính sách bảo mật của tác giả công bố gốc.
• Hướng phát triển tiếp theo:
  • Thu thập thêm mẫu bệnh phẩm FFPE thực tế tại các bệnh viện Việt Nam đối với các phân nhóm NIFTP, WDT-UMP, FT-UMP.
  • Tối ưu hóa kỹ thuật kiểm chứng trong phòng thí nghiệm thông qua giải trình tự bisulfite nhắm mục tiêu (Targeted Bisulfite Pyrosequencing) cho bộ 13 chỉ dấu CpG nhằm giảm giá thành xét nghiệm.
  • Nghiên cứu sâu hơn cơ chế phân tử của gen TNF và con đường tín hiệu apoptosis trong u tuyến giáp thể nang.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho:

• Sinh viên và học viên ngành Công nghệ Sinh học, Tin sinh học (Bioinformatics), Y Sinh học: Tham khảo quy trình phân tích dữ liệu mảng methyl hóa Illumina (minfi, meffil, DMRcate), phương pháp chọn lọc biến (MUVR, glmnet), và kỹ thuật xây dựng mô hình học máy phân loại đa lớp trong R.
• Các nhà nghiên cứu và bác sĩ Giải phẫu bệnh - Ung bướu: Nắm bắt các bằng chứng biểu sinh mới hỗ trợ phân định các tổn thương u nang tuyến giáp khó phân loại, cung cấp góc nhìn toàn diện về sự khác biệt giữa tổn thương lành tính, giáp biên và ác tính.
• Lập trình viên và nhà phát triển công cụ Y sinh: Tham khảo kiến trúc chuyển đổi điểm số thô thành điểm hiệu chuẩn xác suất lâm sàng (Score Calibration) và cách thiết kế ứng dụng web tương tác bằng R Shiny.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao u tuyến giáp thể nang có vỏ bao (EFPTTs) lại khó chẩn đoán chính xác bằng giải phẫu bệnh truyền thống?

EFPTTs có hình thái vi thể chồng lấn cao (cấu trúc nang chiếm >95% kèm vỏ bao sợi bao quanh). Việc chẩn đoán phân biệt giữa FA, NIFTP, FC và fvPTC phụ thuộc vào đánh giá xâm lấn vỏ bao/mạch máu và đặc điểm nhân tế bào dạng nhú, vốn có độ bất đồng thuận lớn giữa các bác sĩ giải phẫu bệnh (chỉ số tương đồng Kappa đối với xâm lấn nghi ngờ rất thấp, đánh giá nhân chỉ đạt 0,452). Ngoài ra, các đột biến gen nhóm RAS xuất hiện ở hầu hết các phân nhóm u nên không thể dùng làm dấu ấn chẩn đoán đơn độc.

2. Sự khác biệt cốt lõi về trạng thái methyl hóa DNA giữa NIFTP và Ung thư thể nang (FC) là gì?

Qua bước gọi DMPs lần thứ nhất so với mô tuyến giáp bình thường, NIFTP thể hiện trạng thái giảm methyl hóa rõ rệt (hypomethylation) với 241/254 vị trí CpG bị giảm methyl hóa. Ngược lại, FC thể hiện trạng thái tăng methyl hóa vượt trội (hypermethylation) với 116/119 vị trí CpG tăng methyl hóa.

3. Tập đặc trưng 13 vị trí CpG được lựa chọn bằng phương pháp nào và đạt hiệu năng ra sao?

Tập 13 CpGs được xác định từ 79 đầu dò đặc hiệu thông qua phương pháp MUVR-PLS mid kết hợp quy trình thẩm định chéo (Cross-Validation) lặp 100 lần. Khi đưa vào mô hình Random Forest (1.000 cây, $mtry = 3$), mô hình đạt $AUC = 0,85$, $AUPRC = 0,81$, trong đó phân loại chính xác tuyệt đối phân nhóm NIFTP ($AUC = 1,0$).

4. Dấu ấn cg11484872 có ý nghĩa sinh học như thế nào trong sự phát triển khối u?

Vị trí CpG mang mã hiệu cg11484872 nằm tại vùng promoter của gen TNF (Tumor Necrosis Factor). Phân tích làm giàu con đường KEGG chỉ ra vị trí này tham gia điều hòa 4 con đường tín hiệu liên quan trực tiếp đến ung thư gồm: con đường tín hiệu MAPK, NF-kappa B, con đường truyền tín hiệu TNF và con đường chết tế bào theo chương trình (Apoptosis).

5. Yếu tố hiệu ứng mẻ (Batch Effect) do gộp nhiều nền tảng mảng (27K, 450K, 850K) được kiểm soát như thế nào?

Tác giả đã kiểm tra mô hình qua 4 kịch bản hiệu chỉnh: không hiệu chỉnh, hiệu chỉnh theo nền tảng mảng (Platform), hiệu chỉnh theo nghiên cứu (Study), và hiệu chỉnh đồng thời cả hai yếu tố (Study + Platform). Kết quả cho thấy giá trị AUC của mô hình Random Forest không bị dao động và luôn duy trì ổn định quanh mức 0,85, chứng minh mô hình không bị thiên lệch bởi nguồn dữ liệu.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Minh Hoàng đã xây dựng thành công quy trình tin sinh học và mô hình học máy Random Forest dựa trên chữ ký 13 vị trí methyl hóa DNA nhằm phân loại chính xác các phân nhóm u tuyến giáp thể nang có vỏ bao (EFPTTs). Nghiên cứu làm sáng tỏ bức tranh biểu sinh đối lập giữa phân nhóm u ranh giới NIFTP (giảm methyl hóa) và ung thư thể nang FC (tăng methyl hóa), đồng thời xác định mối liên hệ của dấu ấn cg11484872 tại promoter gen TNF với các con đường sinh ung. Kết quả nghiên cứu đã được thẩm định độc lập trên hai đoàn hệ TCGA và Juan, đồng thời được đóng gói thành công cụ web Shiny trực quan, mở ra hướng tiếp cận mới hỗ trợ chẩn đoán chính xác và cá thể hóa điều trị ung thư tuyến giáp trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES IDENTIFICATION OF DNA METHYLATION SIGNATURES IN ENCAPSULATED FOLLICULAR-PATTERNED THYROID TUMORS Major : BIOTECHNOLOGY Studentname : NGUYEN MINH HOANG Student ID : 18126053 Academic year : 2018-2022 Thu Duc city, 03/2022 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATION THESIS IDENTIFICATION OF DNA METHYLATION SIGNATURES IN ENCAPSULATED FOLLICULAR-PATTERNED THYROID TUMORS Advisors Student Nguyen Vu Phong, Ph.D Nguyen Minh Hoang Luu Phuc Loi, Ph.D 18126053 Thu Duc city, 03/2022 ACKNOWLEDGEMENTS Words cannot express my gratitude to my advisors - Luu Phuc Loi, Ph., and Nguyen Vu Phong, Ph.D, Nguyen Phan Xuan Truong, MD, Msc and my team — Le Nhat Thong, Le Van Hieu for their invaluable patience, feedback and support. I also could not have undertaken this journey without my defense committee, who generously provided knowledge and expertise. Additionally, this endeavor would not have been possible without the generous support from the VnPathoinformatics who gave me advices for my research. Lastly, I would be remiss in not mentioning my family, especially my parents, Their belief in me has kept my spirits and motivation high during this process.

CONFIRMATION AND ASSURANCE My name is Nguyen Minh Hoang, student ID: 18126053, class: DH18SHD (Phone: [phone], email: [e-mail]), of Biotechnology, Nong Lam University Ho Chi Minh city. The research work contained in this thesis has not been previously submitted for a degree or diploma at any other higher education institution. To the best of my knowledge and belief, the thesis contained no material previously published or written by another person except where due references are made. Thu Duc City, February 25", 2023 Student’s signature Nguyen Minh hoang ABSTRACT Encapsulated follicular-patterned thyroid tumors (EFPTTs) are commonly encountered in pathological thyroid practice.

They include benign (FA), borderline (NIFTP, WDT- UMP, FT-UMP), and malignant TEFVPTC/fvPTC, FC) tumors. Pathologic diagnosis of these entities can be made based on the histologic examination of capsular/vascular invasion and nuclear features of PTC. However, classifications of the numerous follicular-patterned neoplasms have received considerable attention due to high interobserver variability and demonstrated behavioral variation. Additionally, it also shares similar genetic lesions with different prevalences but these findings are not high enough to consistently guide diagnosis.

This study aims to develop a new molecular biology diagnostic approach based on DNA methylation for distinguishing the EFPTTs group. Methylation arrays of 178 human thyroid tumor samples, including 6 NIFTP, 37 FA, 36 FC, 22 fvPTC, and 77 normal thyroid tissues were processed and normalized with the in-house established pipeline. They were divided into training (n=127) and testing datasets (n=51). Next, DNA methylation signatures among subtypes were determined and combined with machine learning to build a model for the classification of EFPTTs.

Finally, the model was validated by two independent cohorts to analyze performance and aberrant DNA methylation with related genes was investigated. As a result, after calling DMPs and features selection methods, 13 CpGs were identified and had significant differences in the methylation levels among NIFTP, FA, FC, and fvPTC. In particular, NIFTP was hypomethylated compared to normal samples and other subtypes, while FC was hypermethylated. Secondly, the classification model of four subtypes was carried out based on Random Forest algorithms by using the 13 features above (accuracy =0.7 and average AUC =0.

Thirdly, 29 samples from the TCGA cohort and 32 samples from the Juan cohort were applied for validation with AUC values of 0. Finally, aberrant DNA methylation in EFPTTs was relative to cell proliferation, immunity, and apoptosis. Moreover, cg11484872 located in the promoter region of TNF was a gene in four cancer-related pathways including MAPK, NF-kappa B, TNF signaling pathways, and apoptosis. In conclusion, the classification model was built successfully based on significant DNA methylation lever in the EFPTTs group and revealed the change in methylation among tumors had connected to some pathways.

This study provides a new diagnosis of EFP TT that could be validated in practice in the future, as well as new approaches to thyroid cancer treatment and research. Keywords: Encapsulated follicular-patterned thyroid tumors, DNA methylation NIFTP, FA, FC, IFFVPTC/fvPTC, TCGA, WDT-UMP, FT-UMP, TNF, machine learning, Random forest. TABLE OF CONTENTS Page ACKNOWLEDGEMENTS 15155. 1 CONFIRMATION AND ASSURANCCE.

HH HH ng rệt ii BÀI) ROA es rer eee 1H TABLE-OF CONTENTS nong 012 dc0x GA G3 5A GIšNgk aesessoem mazar V IIRSN9)00. vill Single Nucleotide Polymorphisms. x LIST OF FIGURES sunnesrraigrsosgiisnioigtesetbdikgsi3s3ibi3s6x8505352933g0154Gg8531213GGTĐESIIGEEESLLGGSA8L4k XI CHAPTER. 1: INTRODUCTION pe csserssnseseneussenspeesseaupsnrstaageenuses preemies marr eemesers 1 I9 2.

1 TD ON SGCES cscs span ces na ai Sw a ctr on one ean incl le 2 15: IRESCATCIITS GOTHIEGHEEE acu ae -ase-ann cawaes wou sarns cee abeneea nape yemeansanonns ea owen oaevmnatssen sew oneesmensees 2 2. Overview of encapsulated follicular-patterned thyroid tumors (EFPTTTs). Challenges in the pathological diagnosis of EEP T”S. MATERIALS AND METHODS.

Material be soxsxttsitsgiiDEIHEGIDGHIS L8 ESEREEGIGGE( Seine eR ERE Ee 14 3. Discovery data - Gene Expression Omnibus (GEO).cenncnsrnearsnecarensoncersensnsensensessangensensenconsenstansaisensanseneensentensenseannnciene 14 mia Ghd IE ol Cee ere ee ee er eee er ee ee 14 Dud Ae, GSH 12137 dT vccsraveessaye 156004066383 035021866<050183l66/0110303598835655 S80124633884230838532044863ExG208gE 14 3als2‹ Vala Oi Hỗ ss sncsnsceucsuesencsvessrencseeaeanneeanenswreeatener nex sunaxnensannaviesseunerenncunce eveeneasicats 14 3. TCGA Cohort na. Data cohort from Juan.

Juan et al, 2022 }.-c c1 0100001161 182 sữa 15 Sele MIEUHDSaserznasssbioloesottolis285sg8:0N0i303nd33iaslsgSBnnstxtfqstzfifaoststthaatstelstoiRsib4S:ptiiaa 1 3. Introduction measurement of DNA methyÏatfIon. 22ie PROCESSING CALA sesnswcsvemsncssneaanaasnonsaawnse sists tu GG3ện we 0048046501638006/30853G5RS30009150250083868 17 3. NG†maHSSUOHS:sosssssssosissiniitsstbiig35648101031116331665018455195185845113985E5885335335885938E% 18 2/0 0t, Teri) se ss0926001553000E155G00030/B5H0535080/388)8/280038E4GHĐlS49d8Đ4OGSD5IESGSVAGG:05000002252000 19 3.

Calling differential methylation positions (DMPS).32, GIMTet PACA BES xscceseemeespewsrseesssnenwseaneepearatemsrmeemuese een eee: 21 3. Feature importances - Randomforest. Classification algorithm in machine learning. Validation of two COMOTtS 5.

Analysis of position, genes and pathways of specific CpGs. Creating a demo shiny app as a tool for appÏIcation. RESULTS AND DISSCUSION. Determine the significantly different DNA methylation positions (DMPs).

The first calling DMPs - between tumors and normal. The second calling DMPs - were amongst FA, NIFTP, FC and fvPTC. Apply feature selection methods to collect Cps. Classification Algorithm in Machine LearnIng.- --- --- 5+ +=+ec+ec+ecxerees 34 ALA.

Validation saysxsssseesgg0118113561344819135041365316334655950536153014114EGG14M. Analysis of position, genes and pathways of specific CpGs. DNA methylation level of 13 Cps. Analysis of position, genes and pathways of specific CpGs.

Creating a demo shiny app as a tool for the clinical application.7, Calling DMR regressiOn sua csay d2 1o 0 nhàn t6 A8ã55410ã1ã4940145448804355/4320904465E08108 46 DAD SCM SO HuaøsssuyssserseøtiavaorsielGutruosgrfbsiovg/Edouincblogi SuiuEbuigugrlfB-ieieitdEneoibgEdusrrsrgimarlgtlososiriiezoeresgzi 48 CHAPTER 5. CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS.2, Recommend Aton cegá6cs2g65cs266641032:65823800b82898048)GGBGMSGERLGEGS25830Sg858/010/66Sg0A1/00E09606 8g 0066 53 vi REFERENCES vii LIST OF ABBREVIATIONS AUC Area Under The Receiver Operating Curve AUPRC Area Under The Precision-recall Curve CNS Central nervous system DMP Differentially methylated position DMPs Differentially methylated probes DNMT DNA methyl transferases EFPTTs Encapsulated follicular-patterned thyroid tumors FA Follicular adenoma FFPE Formalin-fixed paraffin-embedded FTC Follicular thyroid cancer FT-UMP Follicular tumor of uncertain malignant potential FVPTC Follicular variant papillary thyroid carcinoma GEO Gene Expression Omnibus GO Gene Ontology H&E Hematoxylin and Eosin Hg19 Homo sapiens genome assembly GRCh37 Invasive encapsulated follicular variant papillary thyroid IEFVPTC carcinoma KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes NCBI National Center for Biotechnology Information Non invasive follicular thyroid neoplasm with papillary-like NIFTP nuclear features NOS Not otherwise specified PCA Principal components analysis PCA Princial component analysis PTC Papillary thyroid cancer RF Random forest ROC Receiver Operating Curve viii SNPs Single Nucleotide Polymorphisms TCGA The Cancer Genome Atlas TCGA The Cancer Genome Atlas TSH Thyroid-stimulating hormone UMP Uncertain malignant potential WDT-UMP Well-differentiated tumor of uncertain malignant potential LIST OF TABLES Table 2. Guideline for discriminating in EEPP TÏS. Molecular characteristics of EFP TỶ ÏS.

Remaining CpGs after prOC€SSITE. Clinical information of 178 sampÏes. Number of samples in testing and training data. Result after calling DMPs between tumors and normal.

DNA methylation status of 384 CpG. Results after the second calling DMPS. Results using CV method to choose the best combination CpGs. Results of using 4 models and 13 features (CpGs).

Parameters of the RF model with testdafa. --- 5-55 +-c+c+sc+eceerrrs 37 Table 4. Clinical information of 29 samples from TCGA cohort. Clinical information of 32 samples from Juan-cohort.

Position of 13 CpGs in the human genome (hg19). 3 CpGs were located in the promoter region of 3 genes .- 43 LIST OF FIGURES Figure 2. Criteria and examples for scoring nuclear feafur€s. Capsular/ vascular invasion.

Histologic images of EEP TÏÏÏS.--- 5 555 222222221 ££2E++zEeSzE+zreerreerreeree 8 Figure 2. Normal and cancer genomes exhibit different DNA methylation profiles 11 ETigtire 3. Worktlow forthe th 681 sc ccccseeesesecascssnsanuaeeccenenaeessasaeseessareawseumemar recess 15 Figure 3.2 [lumina Infintum HumanMethylation4S0 assay.3 Working principle of MU VĂ. Schematic of CpG annotations (A) and known gene annotations (B).

Steps to creating calibration SCOT©S.- -- 5 2 St se sisrrererrrrrke 25 Figure 4. Circle graphs showed the percentages of probes that were filtered in the BI /sa0s-1r. Bar graphs of the percentage overlap of DMPs with different genes annotations and CpG annOfafIOIS. Heatmap of 384 differentially methylated positions (DMPs) between EBERT Us arid a1 rita THỰ [0 ccs eo cos cree recess sven ve rausisermenresavas asctiss or are case mcesener sunememenwes 31 Figure 4.

Heatmap showing distinct DNA methylation amongst four subtypes. Principal component analysis (PCA) based on the number CpGs. Prediction of Random Forest model in Testing data. ROC curve and AUC values of adjustments by the Batch effects.

Prediction of Random Forest model in TCGA cohort. Prediction of Random Forest model in Juan cohort. Heatmap showing distinct DNA methylation between EFPTTs. Boxplot illustrated the difference in DNA methylation between four SI1]8h7s:sxt491fm] 0Ì ni Đi Mi ` nốốốố.

Visualization positions of 13 CpGs in 10 chromosomes (hg19). Cleveland Dot Plot plot of enriched KEGG pathways statistics.15: Gviz plot illustrated the position of CpGs in Chromosome with TNF gene transcription and Beta value of this CpG. Interface of a demo websIfe.- --- + +- + +2 s3 srrrrrrrrrrrrrrrreree 45 xi Figure 4. Cleveland Dot Plot plot of enriched KEGG pathways statistics with 384 DIR.

Gviz plot illustrated the position of DMR in Chromosome with ALX4 gene transcription and Beta value 6Í this DMR sáuiseesseoassiieise13101458833838 5585538435233 E00438882 48 Figure 4. The figure illustrated the position of cg11484872 and the additional iilormation sins UCSC data sccssecsrenencanmnenmra sone senarmmonmenaanmenemumemueenceens 52 Figure 4. TNFR1 mediated signaling pathways .:cccceceseeseeeeteeseeseeeeeeeeneees 52 xii CHAPTER 1. Overview The thyroid gland gives rise to the most common endocrine tumors - that occur in endocrine tissue - the tissue in the body that secretes hormones.

There are two main types of cells in the thyroid gland, consisting of Follicular and C cells. Thyroid tumors often arise from these cells, but follicular cell-derived tumors constitute the majority of thyroid neoplasms. Following the World Health Organization Classification of thyroid tumors in 2022, they are classified into many subtypes which are complex, based on classic histopathology and molecular pathogenesis. In these, there is a group called encapsulated follicular-patterned thyroid tumors (EFPTTs) which frequently pose diagnostic difficulties and challenges to pathologists in practice.

They are including follicular adenoma (FA) — benign tumor; noninvasive follicular thyroid neoplasm with papillary-like nuclear features (NIFTP), well-differentiated tumor of uncertain malignant potential (WDT-UMP), follicular tumor of uncertain malignant potential (FT- UMP) — borderline tumors; follicular carcinoma (FA), invasive encapsulated follicular variant papillary thyroid carcinoma (IEFVPTC/fvPTC) — malignant tumors (Baloch et al. All these subtypes tumors arise from the follicular cells in the thyroid gland. Nowadays, thyroid tumors in the EFPTTs group are diagnosed based on HE images by pathologists. Besides, gene mutations are examined to evaluate and determine subtypes of thyroid tumors.

However, in practice, pathologists must cope with difficulties in diagnosing EFPPTs because of overlapping morphologic features and poor interobserver agreement among doctors (Liu et al. Moreover, gene mutations are not enough evidence to classify an accurate class of thyroid tumors and the cost for the test is quite expensive. Unfortunately, an incorrect diagnosis of thyroid tumors causes serious consequences, for instance, overtreatment such as surgery, radiation therapy or chemotherapy.