Xác Định Chữ Ký Methyl hóa DNA Trong U Tuyến Giáp Hình Thái Nang Đóng Kín

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học identification of dna methylation signatures in encapsulated, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải pháp cụ

• Tác giả: Nguyen Minh Hoang
• Người hướng dẫn: Nguyen Vu Phong, Ph.D
• Trường học: Nong Lam University
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Khám Phá Chữ Ký Methyl Hóa DNA Trong U Tuyến Giáp Hình Thái Nang Đóng Kín
• Loại tài liệu: graduation thesis
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thu Duc

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENTS
• CONFIRMATION AND ASSURANCE
• 1. CHAPTER 1: INTRODUCTION
• 1.1. Overview of encapsulated follicular-patterned thyroid tumors (EFPTTTs)
• 1.2. Challenges in the pathological diagnosis of EFPTTs
• 2. MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Discovery data - Gene Expression Omnibus (GEO)
• 2.2. TCGA Cohort
• 2.3. Data cohort from Juan
• 2.4. Introduction measurement of DNA methylation
• 2.5. PROCESSING CALA
• 2.6. Calling differential methylation positions (DMPs)
• 2.7. Feature importances - Random forest. Classification algorithm in machine learning. Validation of two cohorts
• 2.8. Analysis of position, genes and pathways of specific CpGs. Creating a demo shiny app as a tool for application
• 3. RESULTS AND DISCUSSION
• 3.1. Determine the significantly different DNA methylation positions (DMPs)
• 3.2. The first calling DMPs - between tumors and normal
• 3.3. The second calling DMPs - amongst FA, NIFTP, FC and fvPTC
• 3.4. Apply feature selection methods to collect CpGs
• 3.5. Classification Algorithm in Machine Learning
• 3.6. Validation
• 3.7. Analysis of position, genes and pathways of specific CpGs
• 3.8. DNA methylation level of 13 CpGs
• 3.9. Creating a demo shiny app as a tool for the clinical application
• 3.10. Calling DMR regression
• 4. CHAPTER 4: DISCUSSION
• 5. CHAPTER 5: CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS
• 5.1. Recommendations
• REFERENCES
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Chữ Ký Methyl Hóa DNA Trong U Tuyến Giáp

U tuyến giáp hình thái nang đóng kín (EFPTTs) là một trong những loại u thường gặp trong thực hành bệnh lý tuyến giáp. Chúng bao gồm các loại u lành tính, u có khả năng ác tính không rõ ràng và u ác tính. Việc phân loại và chẩn đoán chính xác các loại u này gặp nhiều khó khăn do sự chồng chéo về hình thái và sự biến đổi trong biểu hiện gen. Nghiên cứu này nhằm phát triển một phương pháp chẩn đoán mới dựa trên chữ ký methyl hóa DNA để phân biệt các loại u này.

1.1. Đặc Điểm Của U Tuyến Giáp Hình Thái Nang

U tuyến giáp hình thái nang bao gồm nhiều loại như adenoma nang, NIFTP, và carcinoma. Mỗi loại có đặc điểm hình thái và sinh học riêng, gây khó khăn trong việc chẩn đoán chính xác.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Methyl Hóa DNA Trong Chẩn Đoán

Methyl hóa DNA đã được chứng minh là một chỉ số sinh học tiềm năng trong việc phân loại các loại u tuyến giáp. Nghiên cứu cho thấy sự khác biệt trong mức độ methyl hóa giữa các loại u có thể giúp cải thiện độ chính xác trong chẩn đoán.

II. Thách Thức Trong Chẩn Đoán U Tuyến Giáp Hình Thái Nang

Chẩn đoán u tuyến giáp hình thái nang đóng kín gặp nhiều thách thức do sự chồng chéo về hình thái và thiếu sự đồng thuận giữa các bác sĩ. Các phương pháp hiện tại như xét nghiệm gen không đủ để phân loại chính xác. Điều này dẫn đến nguy cơ chẩn đoán sai và điều trị không cần thiết.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Phân Loại U

Sự chồng chéo về hình thái giữa các loại u khiến cho việc phân loại trở nên khó khăn. Các bác sĩ thường phải dựa vào hình ảnh mô học, điều này có thể dẫn đến sai sót.

2.2. Hệ Quả Của Chẩn Đoán Sai

Chẩn đoán sai có thể dẫn đến các biện pháp điều trị không cần thiết như phẫu thuật hoặc hóa trị, gây ra gánh nặng cho bệnh nhân và hệ thống y tế.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Chữ Ký Methyl Hóa DNA

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để xác định chữ ký methyl hóa DNA trong các mẫu u tuyến giáp. Các mẫu được phân tích bằng cách sử dụng công nghệ methyl hóa DNA để xác định các vị trí methyl hóa khác nhau giữa các loại u.

3.1. Quy Trình Phân Tích Methyl Hóa DNA

Quy trình bao gồm thu thập mẫu, xử lý và phân tích dữ liệu methyl hóa. Các mẫu được chia thành nhóm huấn luyện và kiểm tra để xây dựng mô hình phân loại.

3.2. Sử Dụng Machine Learning Trong Phân Tích

Mô hình phân loại được xây dựng dựa trên các chữ ký methyl hóa và các thuật toán machine learning như Random Forest để cải thiện độ chính xác trong chẩn đoán.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Methyl Hóa DNA

Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt rõ rệt trong mức độ methyl hóa giữa các loại u tuyến giáp. Các vị trí methyl hóa cụ thể đã được xác định và có liên quan đến sự phát triển của khối u. Mô hình phân loại đạt độ chính xác cao trong việc phân biệt các loại u.

4.1. Các Vị Trí Methyl Hóa Quan Trọng

Nghiên cứu đã xác định 13 vị trí CpG có sự khác biệt đáng kể trong mức độ methyl hóa giữa các loại u, cung cấp thông tin quý giá cho việc phân loại.

4.2. Hiệu Quả Của Mô Hình Phân Loại

Mô hình phân loại dựa trên methyl hóa DNA cho thấy độ chính xác cao, với AUC đạt 0.7, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn.

V. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chữ ký methyl hóa DNA có thể là một công cụ chẩn đoán hữu ích trong việc phân loại u tuyến giáp hình thái nang đóng kín. Các kết quả cho thấy cần tiếp tục nghiên cứu để xác định rõ hơn các cơ chế sinh học liên quan.

5.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc sử dụng methyl hóa DNA như một chỉ số sinh học trong chẩn đoán u tuyến giáp.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu để xác định rõ hơn các con đường sinh học liên quan đến methyl hóa DNA và phát triển các phương pháp chẩn đoán mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES IDENTIFICATION OF DNA METHYLATION SIGNATURES IN ENCAPSULATED FOLLICULAR-PATTERNED THYROID TUMORS Major : BIOTECHNOLOGY Studentname : NGUYEN MINH HOANG Student ID : 18126053 Academic year : 2018-2022 Thu Duc city, 03/2022 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATION THESIS IDENTIFICATION OF DNA METHYLATION SIGNATURES IN ENCAPSULATED FOLLICULAR-PATTERNED THYROID TUMORS Advisors Student Nguyen Vu Phong, Ph.D Nguyen Minh Hoang Luu Phuc Loi, Ph.D 18126053 Thu Duc city, 03/2022 ACKNOWLEDGEMENTS Words cannot express my gratitude to my advisors - Luu Phuc Loi, Ph., and Nguyen Vu Phong, Ph.D, Nguyen Phan Xuan Truong, MD, Msc and my team — Le Nhat Thong, Le Van Hieu for their invaluable patience, feedback and support. I also could not have undertaken this journey without my defense committee, who generously provided knowledge and expertise. Additionally, this endeavor would not have been possible without the generous support from the VnPathoinformatics who gave me advices for my research. Lastly, I would be remiss in not mentioning my family, especially my parents, Their belief in me has kept my spirits and motivation high during this process.

CONFIRMATION AND ASSURANCE My name is Nguyen Minh Hoang, student ID: 18126053, class: DH18SHD (Phone: [phone], email: [e-mail]), of Biotechnology, Nong Lam University Ho Chi Minh city. The research work contained in this thesis has not been previously submitted for a degree or diploma at any other higher education institution. To the best of my knowledge and belief, the thesis contained no material previously published or written by another person except where due references are made. Thu Duc City, February 25", 2023 Student’s signature Nguyen Minh hoang ABSTRACT Encapsulated follicular-patterned thyroid tumors (EFPTTs) are commonly encountered in pathological thyroid practice.

They include benign (FA), borderline (NIFTP, WDT- UMP, FT-UMP), and malignant TEFVPTC/fvPTC, FC) tumors. Pathologic diagnosis of these entities can be made based on the histologic examination of capsular/vascular invasion and nuclear features of PTC. However, classifications of the numerous follicular-patterned neoplasms have received considerable attention due to high interobserver variability and demonstrated behavioral variation. Additionally, it also shares similar genetic lesions with different prevalences but these findings are not high enough to consistently guide diagnosis.

This study aims to develop a new molecular biology diagnostic approach based on DNA methylation for distinguishing the EFPTTs group. Methylation arrays of 178 human thyroid tumor samples, including 6 NIFTP, 37 FA, 36 FC, 22 fvPTC, and 77 normal thyroid tissues were processed and normalized with the in-house established pipeline. They were divided into training (n=127) and testing datasets (n=51). Next, DNA methylation signatures among subtypes were determined and combined with machine learning to build a model for the classification of EFPTTs.

Finally, the model was validated by two independent cohorts to analyze performance and aberrant DNA methylation with related genes was investigated. As a result, after calling DMPs and features selection methods, 13 CpGs were identified and had significant differences in the methylation levels among NIFTP, FA, FC, and fvPTC. In particular, NIFTP was hypomethylated compared to normal samples and other subtypes, while FC was hypermethylated. Secondly, the classification model of four subtypes was carried out based on Random Forest algorithms by using the 13 features above (accuracy =0.7 and average AUC =0.

Thirdly, 29 samples from the TCGA cohort and 32 samples from the Juan cohort were applied for validation with AUC values of 0. Finally, aberrant DNA methylation in EFPTTs was relative to cell proliferation, immunity, and apoptosis. Moreover, cg11484872 located in the promoter region of TNF was a gene in four cancer-related pathways including MAPK, NF-kappa B, TNF signaling pathways, and apoptosis. In conclusion, the classification model was built successfully based on significant DNA methylation lever in the EFPTTs group and revealed the change in methylation among tumors had connected to some pathways.

This study provides a new diagnosis of EFP TT that could be validated in practice in the future, as well as new approaches to thyroid cancer treatment and research. Keywords: Encapsulated follicular-patterned thyroid tumors, DNA methylation NIFTP, FA, FC, IFFVPTC/fvPTC, TCGA, WDT-UMP, FT-UMP, TNF, machine learning, Random forest. TABLE OF CONTENTS Page ACKNOWLEDGEMENTS 15155. 1 CONFIRMATION AND ASSURANCCE.

HH HH ng rệt ii BÀI) ROA es rer eee 1H TABLE-OF CONTENTS nong 012 dc0x GA G3 5A GIšNgk aesessoem mazar V IIRSN9)00. vill Single Nucleotide Polymorphisms. x LIST OF FIGURES sunnesrraigrsosgiisnioigtesetbdikgsi3s3ibi3s6x8505352933g0154Gg8531213GGTĐESIIGEEESLLGGSA8L4k XI CHAPTER. 1: INTRODUCTION pe csserssnseseneussenspeesseaupsnrstaageenuses preemies marr eemesers 1 I9 2.

1 TD ON SGCES cscs span ces na ai Sw a ctr on one ean incl le 2 15: IRESCATCIITS GOTHIEGHEEE acu ae -ase-ann cawaes wou sarns cee abeneea nape yemeansanonns ea owen oaevmnatssen sew oneesmensees 2 2. Overview of encapsulated follicular-patterned thyroid tumors (EFPTTTs). Challenges in the pathological diagnosis of EEP T”S. MATERIALS AND METHODS.

Material be soxsxttsitsgiiDEIHEGIDGHIS L8 ESEREEGIGGE( Seine eR ERE Ee 14 3. Discovery data - Gene Expression Omnibus (GEO).cenncnsrnearsnecarensoncersensnsensensessangensensenconsenstansaisensanseneensentensenseannnciene 14 mia Ghd IE ol Cee ere ee ee er eee er ee ee 14 Dud Ae, GSH 12137 dT vccsraveessaye 156004066383 035021866<050183l66/0110303598835655 S80124633884230838532044863ExG208gE 14 3als2‹ Vala Oi Hỗ ss sncsnsceucsuesencsvessrencseeaeanneeanenswreeatener nex sunaxnensannaviesseunerenncunce eveeneasicats 14 3. TCGA Cohort na. Data cohort from Juan.

Juan et al, 2022 }.-c c1 0100001161 182 sữa 15 Sele MIEUHDSaserznasssbioloesottolis285sg8:0N0i303nd33iaslsgSBnnstxtfqstzfifaoststthaatstelstoiRsib4S:ptiiaa 1 3. Introduction measurement of DNA methyÏatfIon. 22ie PROCESSING CALA sesnswcsvemsncssneaanaasnonsaawnse sists tu GG3ện we 0048046501638006/30853G5RS30009150250083868 17 3. NG†maHSSUOHS:sosssssssosissiniitsstbiig35648101031116331665018455195185845113985E5885335335885938E% 18 2/0 0t, Teri) se ss0926001553000E155G00030/B5H0535080/388)8/280038E4GHĐlS49d8Đ4OGSD5IESGSVAGG:05000002252000 19 3.

Calling differential methylation positions (DMPS).32, GIMTet PACA BES xscceseemeespewsrseesssnenwseaneepearatemsrmeemuese een eee: 21 3. Feature importances - Randomforest. Classification algorithm in machine learning. Validation of two COMOTtS 5.

Analysis of position, genes and pathways of specific CpGs. Creating a demo shiny app as a tool for appÏIcation. RESULTS AND DISSCUSION. Determine the significantly different DNA methylation positions (DMPs).

The first calling DMPs - between tumors and normal. The second calling DMPs - were amongst FA, NIFTP, FC and fvPTC. Apply feature selection methods to collect Cps. Classification Algorithm in Machine LearnIng.- --- --- 5+ +=+ec+ec+ecxerees 34 ALA.

Validation saysxsssseesgg0118113561344819135041365316334655950536153014114EGG14M. Analysis of position, genes and pathways of specific CpGs. DNA methylation level of 13 Cps. Analysis of position, genes and pathways of specific CpGs.

Creating a demo shiny app as a tool for the clinical application.7, Calling DMR regressiOn sua csay d2 1o 0 nhàn t6 A8ã55410ã1ã4940145448804355/4320904465E08108 46 DAD SCM SO HuaøsssuyssserseøtiavaorsielGutruosgrfbsiovg/Edouincblogi SuiuEbuigugrlfB-ieieitdEneoibgEdusrrsrgimarlgtlososiriiezoeresgzi 48 CHAPTER 5. CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS.2, Recommend Aton cegá6cs2g65cs266641032:65823800b82898048)GGBGMSGERLGEGS25830Sg858/010/66Sg0A1/00E09606 8g 0066 53 vi REFERENCES vii LIST OF ABBREVIATIONS AUC Area Under The Receiver Operating Curve AUPRC Area Under The Precision-recall Curve CNS Central nervous system DMP Differentially methylated position DMPs Differentially methylated probes DNMT DNA methyl transferases EFPTTs Encapsulated follicular-patterned thyroid tumors FA Follicular adenoma FFPE Formalin-fixed paraffin-embedded FTC Follicular thyroid cancer FT-UMP Follicular tumor of uncertain malignant potential FVPTC Follicular variant papillary thyroid carcinoma GEO Gene Expression Omnibus GO Gene Ontology H&E Hematoxylin and Eosin Hg19 Homo sapiens genome assembly GRCh37 Invasive encapsulated follicular variant papillary thyroid IEFVPTC carcinoma KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes NCBI National Center for Biotechnology Information Non invasive follicular thyroid neoplasm with papillary-like NIFTP nuclear features NOS Not otherwise specified PCA Principal components analysis PCA Princial component analysis PTC Papillary thyroid cancer RF Random forest ROC Receiver Operating Curve viii SNPs Single Nucleotide Polymorphisms TCGA The Cancer Genome Atlas TCGA The Cancer Genome Atlas TSH Thyroid-stimulating hormone UMP Uncertain malignant potential WDT-UMP Well-differentiated tumor of uncertain malignant potential LIST OF TABLES Table 2. Guideline for discriminating in EEPP TÏS. Molecular characteristics of EFP TỶ ÏS.

Remaining CpGs after prOC€SSITE. Clinical information of 178 sampÏes. Number of samples in testing and training data. Result after calling DMPs between tumors and normal.

DNA methylation status of 384 CpG. Results after the second calling DMPS. Results using CV method to choose the best combination CpGs. Results of using 4 models and 13 features (CpGs).

Parameters of the RF model with testdafa. --- 5-55 +-c+c+sc+eceerrrs 37 Table 4. Clinical information of 29 samples from TCGA cohort. Clinical information of 32 samples from Juan-cohort.

Position of 13 CpGs in the human genome (hg19). 3 CpGs were located in the promoter region of 3 genes .- 43 LIST OF FIGURES Figure 2. Criteria and examples for scoring nuclear feafur€s. Capsular/ vascular invasion.

Histologic images of EEP TÏÏÏS.--- 5 555 222222221 ££2E++zEeSzE+zreerreerreeree 8 Figure 2. Normal and cancer genomes exhibit different DNA methylation profiles 11 ETigtire 3. Worktlow forthe th 681 sc ccccseeesesecascssnsanuaeeccenenaeessasaeseessareawseumemar recess 15 Figure 3.2 [lumina Infintum HumanMethylation4S0 assay.3 Working principle of MU VĂ. Schematic of CpG annotations (A) and known gene annotations (B).

Steps to creating calibration SCOT©S.- -- 5 2 St se sisrrererrrrrke 25 Figure 4. Circle graphs showed the percentages of probes that were filtered in the BI /sa0s-1r. Bar graphs of the percentage overlap of DMPs with different genes annotations and CpG annOfafIOIS. Heatmap of 384 differentially methylated positions (DMPs) between EBERT Us arid a1 rita THỰ [0 ccs eo cos cree recess sven ve rausisermenresavas asctiss or are case mcesener sunememenwes 31 Figure 4.

Heatmap showing distinct DNA methylation amongst four subtypes. Principal component analysis (PCA) based on the number CpGs. Prediction of Random Forest model in Testing data. ROC curve and AUC values of adjustments by the Batch effects.

Prediction of Random Forest model in TCGA cohort. Prediction of Random Forest model in Juan cohort. Heatmap showing distinct DNA methylation between EFPTTs. Boxplot illustrated the difference in DNA methylation between four SI1]8h7s:sxt491fm] 0Ì ni Đi Mi ` nốốốố.

Visualization positions of 13 CpGs in 10 chromosomes (hg19). Cleveland Dot Plot plot of enriched KEGG pathways statistics.15: Gviz plot illustrated the position of CpGs in Chromosome with TNF gene transcription and Beta value of this CpG. Interface of a demo websIfe.- --- + +- + +2 s3 srrrrrrrrrrrrrrrreree 45 xi Figure 4. Cleveland Dot Plot plot of enriched KEGG pathways statistics with 384 DIR.

Gviz plot illustrated the position of DMR in Chromosome with ALX4 gene transcription and Beta value 6Í this DMR sáuiseesseoassiieise13101458833838 5585538435233 E00438882 48 Figure 4. The figure illustrated the position of cg11484872 and the additional iilormation sins UCSC data sccssecsrenencanmnenmra sone senarmmonmenaanmenemumemueenceens 52 Figure 4. TNFR1 mediated signaling pathways .:cccceceseeseeeeteeseeseeeeeeeeneees 52 xii CHAPTER 1. Overview The thyroid gland gives rise to the most common endocrine tumors - that occur in endocrine tissue - the tissue in the body that secretes hormones.

There are two main types of cells in the thyroid gland, consisting of Follicular and C cells. Thyroid tumors often arise from these cells, but follicular cell-derived tumors constitute the majority of thyroid neoplasms. Following the World Health Organization Classification of thyroid tumors in 2022, they are classified into many subtypes which are complex, based on classic histopathology and molecular pathogenesis. In these, there is a group called encapsulated follicular-patterned thyroid tumors (EFPTTs) which frequently pose diagnostic difficulties and challenges to pathologists in practice.

They are including follicular adenoma (FA) — benign tumor; noninvasive follicular thyroid neoplasm with papillary-like nuclear features (NIFTP), well-differentiated tumor of uncertain malignant potential (WDT-UMP), follicular tumor of uncertain malignant potential (FT- UMP) — borderline tumors; follicular carcinoma (FA), invasive encapsulated follicular variant papillary thyroid carcinoma (IEFVPTC/fvPTC) — malignant tumors (Baloch et al. All these subtypes tumors arise from the follicular cells in the thyroid gland. Nowadays, thyroid tumors in the EFPTTs group are diagnosed based on HE images by pathologists. Besides, gene mutations are examined to evaluate and determine subtypes of thyroid tumors.

However, in practice, pathologists must cope with difficulties in diagnosing EFPPTs because of overlapping morphologic features and poor interobserver agreement among doctors (Liu et al. Moreover, gene mutations are not enough evidence to classify an accurate class of thyroid tumors and the cost for the test is quite expensive. Unfortunately, an incorrect diagnosis of thyroid tumors causes serious consequences, for instance, overtreatment such as surgery, radiation therapy or chemotherapy.