Đặt vấn đề Trong nền kinh tế của nước ta nền nông nghiệp luôn giữ vai trò chủ đạo, đặc biệt là trồng trọt. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, bệnh hại cây trồng đã và đang tiếp tục gây thiệt hại đến mùa màng ở Việt Nam cũng như các nước trên thế giới. Sự bùng phát dịch bệnh trên các loại cây trồng có giá trị kinh tế đã gây tác đ ộng lớn đến những người nông dân. Nhiều bệnh do nấm trong đất gây ra ảnh hưởng trực tiếp đến cây trồng, làm giảm năng suất và chất lượng nông sản dẫn đến thu nhập của người nông dân giảm sút đáng kể.
Ngoài ra, các chi phí cho các biện pháp phòng trừ nấm bệnh càng làm giảm mức thu nhập của họ. Hiện nay, bệnh hại cây trồng được kiểm soát bằng cách áp dụng nhiều biện pháp khác nhau. Trong đó, biện pháp hóa học vẫn được xem là hữu hiệu nhất và được áp dụng nhiều nhất. Tuy nhiên, việc sử dụng quá nhiều các loại thuốc hóa học làm cho đất đai ngày càng bị thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng hệ sinh thái trong đất, hệ vi sinh vật trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất độc ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy ngày càng nhi ều.
Ngoài ra, việc lạm dụng quá mức phương pháp hóa học làm cho các tác nhân gây bệnh trở nên kháng thuốc dẫn đến phát sinh một số dịch hại không dự báo trước được. Đặc biệt, các loại thuốc hóa học có thể ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe của nông dân và gây ô nhiễm nguồn nước. Chính vì thế, xu hướng hiện nay là dùng các tác nhân sinh học như các vi sinh vật, côn trùng có ích hoặc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ tự nhiên để kiểm soát dịch bệnh trên cây trồng. Các chế phẩm sinh học đang được khuyến khích sử dụng nhằm khắc phục một số hạn chế của phương pháp hóa học và hướng đến sự phát triển nông nghiệp theo hướng sinh thái bền vững trong tương lai.
Ưu thế của việc sử dụng biện pháp sinh học là kiểm soát được các tác nhân gây bệnh cùng với cải thiện năng suất cây trồng và tránh được việc gây ô nhiễm môi trường như các loại thuốc hóa học gây ra. Hiện nay, ứng dụng của chế phẩm sinh học từ Pseudomonas sp. vào nông nghiệp có thể nói là bước đầu đã đáp ứng căn bản các yêu cầu trên. Ngoài ra, Pseudomonas sp.
2 được xem là vi khuẩn có tiềm năng về điều hòa tăng trưởng thực vật. Có nhiều chủng Pseudomonas tác động lớn đến sự sinh trưởng và phát triển cây trồng thông qua các cơ chế sinh học khác nhau như kích thích sự tăng trưởng và phát triển cây trồng, đối kháng tác nhân gây bệnh như nấm bệnh, vi khuẩn, tuyến trùng… và kích thích các cơ chế tự vệ của vật chủ. Tuy nhiên, cho đến nay, ở Việt Nam có rất ích nghiên cứu về Pseudomonas sp. trong vấn đề này.
Dựa trên những cơ sở đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng đối kháng một số loại nấm gây bệnh trên cây trồng của một số chủng Pseudomonas sp. Mục tiêu của đề tài - Đánh giá khả năng kiểm soát nấm bệnh của một số chủng Pseudomonas sp. - Chọn lọc chủng có khả năng năng đối kháng tốt nhất và chọn lọc một số điều kiện nhân sinh khối của chủng chọn lọc. Nội dung thực hiện - Xác định hiệu quả đối kháng của 4 chủng Pseudomonas sp.
(Pseudomonas putida Ps01, Pseudomonas fluorescens Ps02, Pseudomonas stutzeri Ps03 và Pseudomonas aeruginosa BL2.2) với 7 chủng nấm bệnh (Sclerotium rolfsii NB01, Rhizoctonia solani NB02, Phytophthora capsici NB03, Fusarium oxysporum NBTn01, Fusarium ambrosium NBS05, Brachycladium papaveris NBT04, Gilbertella persicaria NBT01) trên môi trường thạch đĩa PGA bằng phương pháp nuôi cấy đồng thời để chọn lọc ra chủng Pseudomonas sp. có khả năng đối kháng cao với nấm bệnh. - Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình tăng sinh của chủng Pseudomonas sp. chọn lọc (pH ban đầu của môi trường, nguồn carbon bổ sung thích hợp, nồng độ nguồn carbon bổ sung thích hợp, nguồn nitrogen bổ sung thích hợp, nồng độ nguồn nitrogen bổ sung thích hợp, nồng độ chất khoáng bổ sung…) nhằm lựa chọn điều kiện tăng sinh thích hợp.
3 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về Pseudomonas Pseudomonas bao gồm các loài của một chi có khả năng sử dụng nhiều loại hợp chất vô cơ và hữu cơ dưới điều kiện môi trường sống thay đổi. Do đó, chúng tồn tại khắp mọi nơi trong hệ sinh thái đất, nước và đóng vai trò quan trọng trong các tương tác với động vật và thực vật. Tuy nhiên, một số chủng cũng là m ầm bệnh đối với con người.
Chi Pseudomonas được biết rộng rãi nhờ khả năng trao đổi chất và thông tin di truyền linh hoạt. Nói chung, các loài Pseudomonas có khả năng phát triển nhanh và được biết đến với khả năng sử dụng một số lượng lớn các loại cơ chất, bao gồm cả các chất hữu cơ độc hại, chẳng hạn như hydrocacbon thơm và chất béo. Một vài chủng đã đư ợc xác định tạo ra hợp chất chuyển hóa có tác dụng kích thích sự phát triển của cây trồng hoặc ngăn chặn các loài gây hại cho cây trồng [16]. Vị trí phân loại Theo Migula (1984), Pseudomonas có vị trí phân loại như sau: Giới : Bacteria Ngành : Proteobacteria Lớp : Gamma Proteobacteria Bộ : Pseudomonadales Họ : Pseudomonadaceae Chi : : Pseudomonas Loài : Pseudomonas sp.
Đặc điểm hình thái Pseudomonas là trực khuẩn gram âm có vách và màng tế bào mỏng, không sinh nội bào tử, có hình que hơi cong ho ặc thẳng, đường kính tế bào thường nhỏ hơn 1m và chiều dài 1,5-5 m (Pierre Cornelis, 2008). Tế bào của chúng đứng riêng rẽ, đứng thành đôi hoặc thành từng chuỗi ngắn. Tuy nhiên, trong thực tế thì tế bào của một số chủng có thể không đúng như miêu tả chung. Tế bào của P.
syringae có thể dài bất thường trong khi các chủng khác rất ngắn [16]. Khuẩn lạc Pseudomonas Hình 2. Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens trên thạch đĩa King’ B [44] aeruginosa trên thạch đĩa King’ B [46] Pseudomonas spp. có khả năng di động nhờ một hoặc nhiều tiên mao mọc ở đỉnh, hiếm khi không di động, hầu hết các loài Pseudomonas đều có nhiều hơn một tiên mao.
Tiên mao thường được gắn ở cực tế bào, tuy nhiên cũng có ngo ại lệ như ở P. Các loài khác nhau được phân biệt dựa trên kiểm tra hóa sinh và lai DNA. Tế bào của nhiều loài bị dung giải một cách dễ dàng trong dung dịch EDTA, điều này thường liên quan đến hàm lượng phosphoric cao của lớp màng ngoài [16]. Pseudomonas aeruginosa với Hình 2.
Pseudomonas fluorescens với một tiên mao ở cực [47] nhiều tiên mao ở cực [45] 5 2. Môi trường sống Nhóm vi khuẩn này có thể được tìm thấy rất nhiều nơi trong môi trường sống chung quanh ta như trong đất, nước (nhất là những nơi ẩm thấp), các hồ tắm nước nóng. Chúng còn được phát hiện sống bám trên bề mặt thực vật, động vật, kể cả trong bệnh viện (người ta còn phát hiện vi khuẩn P. aeruginosa trong các thiết bị dụng cụ được sử dụng thường xuyên như chụp thở oxy, các ống thông tiểu…).
Môi trường ẩm ướt rất thích hợp cho vi khuẩn này. Ở người, vi khuẩn có thể sống ở vùng da ẩm như nách, háng và một số ít sống trong ruột [6]. Đất vùng rễ cây ảnh hưởng nhiều đến cây trồng (Hiltner, 1904), khu vực này có sự hoạt động mạnh của các vi sinh vật. Pseudomonas là một trong những loài có khả năng cư trú tốt ở vùng rễ thực vật (Lugtenberg và cộng sự, 2001) nên có hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác ở rễ (Bianciotto và cộng sự, 1996) [16].
Pseudomonas được đặc trưng bởi nó có thể phát triển trên các môi trường đơn giản ở với nhiều loại thành phần hữu cơ khác nhau [28]. Môi trường sống Pseudomonas rất phong phú như đất, nước hay mô tế bào thực vật và động vật. Về cơ bản, bất kỳ môi trường sống nào ở nhiệt độ từ 4- 420C, pH từ 4-8 và có các chất hữu cơ đơn giản hay phức tạp đều là môi trường sống cho Pseudomonas [16]. Pseudomonas là loài hiếu khí, oxy là yếu tố quan trọng cho sự tồn tại của nó.
Trong thực tế, Pseudomonas sp. thường được tìm thấy trong đất và môi trường hiếu khí, có nhiệt độ trung bình và điều kiện pH trung tính [16]. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa Trong tự nhiên, các loài Pseudomonas tồn tại bằng cách hoại sinh hoặc ký sinh trên thực vật. Thường chúng không phù hợp với môi trường kị khí và chúng không thể cư trú với môi trường sống có nhiệt độ cao và quá acid.
Một số chủng Pseudomonas có thể kháng kháng sinh, thuốc tẩy, kim loại nặng và dung môi hữu cơ [16]. được chia làm 2 nhóm theo khả năng phát huỳnh quang: Pseudomonas spp. phát huỳnh quang (như P. syringae…) và Pseudomonas spp.
không phát huỳnh quang (như P. Cách phân chia không phải là sự phân nhóm chính thức, mà chỉ là sự phân nhóm theo tính chất có sản xuất hay không hợp chất thứ cấp đặc hiệu phát huỳnh quang pyoverdine. Tính đặc trưng của nhiều đại diện thuộc nhóm Pseudomonas spp. phát huỳnh quang là sinh ra sắc tố huỳnh quang được quan sát dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm, nhất là khi phát triển dưới nồng độ sắt bị giới hạn (Meyer và cộng sự, 2002) [16].
Ở một số loài, sắc tố khuếch tán vào môi trường, nhuộm môi trường thành các màu tương ứng. Các sắc tố trên được sản xuất từ Pseudomonas bao gồm pyocyanin ( P. aeruginosa, màu xanh), pyorubin (P. aeruginosa, màu đỏ), oxycholororaphin (P.
chlororaphis, màu da cam), chlororaphin (P. chlororaphis, màu xanh lá cây)… (Hugh và Gilardi, 1980) [16]. Pseudomonas có khả năng oxy hóa nhưng không lên men đường, không sinh hơi trong môi trường lỏng có chứa các nguồn carbohydrate. Chúng phát triển tốt trên môi trường peptone, hầu hết các loài phát triển trên môi trường xác định trong đó glucose hoặc galactose là nguồn carbon duy nhất và ammonium phosphate là nguồn nitrogen duy nhất.
Acid được tạo thành từ glucose và galactose trong môi trường peptone, nhưng acid không hình thành từ manitol và glycerol (trừ P. Arginine dihydrolase có thể được tạo thành nhưng ornithine decarboxylase thì không đư ợc tạo thành (trừ P. Pseudomonas không phân giải tinh bột (ngoại trừ P. stutzeri), không tạo thành acetoin và không sử dụng cellulose và pectin.
phát triển trên môi trường chứa 10 đến 40% muối mật và trên môi trường 3 đến 5% NaCl. Pseudomonas có hệ enzyme catalase, có hệ thống cytochrom có khả năng phân giải H2O2 (trừ P. pavonacea), oxidase dương tính (trừ P.