MỞ ĐẦU Nấm linh chi là một loại dược liệu quý với những tác dụng sinh học nổi bật, và luôn được xem là “thượng dược”. Loài này được gọi với nhiều tên rất đẹp như: Bất lão thảo, Vạn niên nhung, Thần tiên thảo, Mộc linh chi, Đoạn thảo,…Nhưng tên linh chi có lẽ là tiêu biểu và mang tính lịch sử vì đã được chính thức sử dụng cách đây hơn 2000 năm, ghi trong sách “Thần nông bản thảo” 1. Đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng trị liệu của nấm linh chi bao gồm tác dụng chống ung thư, điều hòa miễn dịch, điều trị hạ đường huyết, tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, tim mạch, chống vi khuẩn, virus,. Tỉnh Quảng Nam (Việt Nam) thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có các vùng núi với những khu rừng già nguyên sinh rộng lớn, nhiều cây cổ thụ, là đặc điểm thích hợp cho sự phát triển tự nhiên của nấm linh chi.
Tại vùng Tiên Phước thuộc tỉnh Quảng Nam, cây nấm linh chi mọc trên gốc và rễ của cây lim xanh nên thường được gọi là nấm lim xanh. Tuy nhiên, hiện nay, do việc khai thác bừa bãi và phân bố nấm trong tự nhiên ngày càng ít cùng với nhu cầu ngày càng tăng, người dân tỉnh Quảng Nam đã bắt đầu nuôi trồng nấm linh chi với mục đích vừa bảo tồn nguồn giống vừa đem lại nguồn lợi kinh tế cao. Để thực hiện thành công mục tiêu này, rất cần thiết định danh chính xác loài nấm linh chi và dựa trên kết quả này, các nghiên cứu tiếp theo sẽ tiến hành kiểm tra thành phần, tác dụng sinh học,…của nấm. Định danh nấm linh chi có thể dựa trên phân tích hình thái nhưng gặp khó khăn do nhiều nguyên nhân như: có nhiều loài nấm có đặc điểm hình thái gần giống nhau, hình thái ở mỗi giai đoạn phát triển cũng khác nhau, hoặc do hình thái nấm không còn nguyên vẹn khi thu hái.
Hiện nay, để định danh nấm linh chi thường sử dụng mã vạch DNA – là trình tự nucleotid đặc hiệu của loài. Tuy nhiên, một khảo sát > 600 trình tự Ganoderma trên GenBank cho thấy 65% trình tự chưa được xác định đúng hoặc không rõ 6. Với sự phát triển của công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới, việc xác định trình tự bộ gen của các loài nấm linh chi đã được thực hiện với chi phí phù hợp và tỷ lệ sai sót nhỏ. Điều này đã đem lại nhiều lợi ích.
Thứ nhất, trình tự bộ gen cung cấp thông tin về trình tự DNA đặc hiệu, cho phép định danh nấm ở mức độ. Thứ hai, giải trình tự bộ gen có chi phí hợp lý để phát hiện các gen mã hoá hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cũng như làm sáng tỏ con đường sinh tổng hợp của chúng. Thứ ba, so sánh bộ gen các loài giúp thiết lập cây tiến hoá theo thời gian của các gen mã hoá enzym ligninolytic (LiP, MnP, Lac,…). Đây là những thông tin quan trọng trong sàng lọc các loài nấm mới có đặc điểm sinh trưởng tốt, có khả năng chống lại mầm bệnh 7.
Nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn trong khai thác, bảo tồn, nuôi trồng nấm linh chi cũng như nghiên cứu thành phần hoá học, hoạt tính sinh học và kiểm định chất lượng các loài nấm, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Giải trình tự bộ gen một số loài nấm linh chi thu hái ở Quảng Nam bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới trên thiết bị Illumina Miseq” với mục tiêu sau: - Khảo sát đặc điểm đại thể và vi thể một số mẫu nấm linh chi thu hái ở Quảng Nam. - Tách chiết DNA bộ gen và giải trình tự gen vùng ITS bằng phương pháp Sanger. - Giải trình tự bộ gen một số mẫu nấm linh chi bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới trên thiết bị Illumina Miseq. - Phân tích các trình tự gen.1 Tổng quan về nấm linh chi 1.1 Phân loại Nấm linh chi thuộc họ Nấm lim (Ganodermataceae), bộ Polyporales, lớp Agaricomycetes, ngành nấm đảm Basidiomycota, giới nấm Fungi.
Từ năm 1881, nhiều chi thuộc họ Ganodermataceae bắt đầu được phát hiện: Ganoderma P. (1889), Amauroderma Murrill (1905), Dendrophagus Murrill (1905), Tomophagus Murill (1905), Friesia Lázaro Ibiza (1916), Trachyderma Imazeki (1952), Haddowia Steyaert (1972), Humphreya Steyaert (1972), Archeterobasidium Koeniguer & Locq. Theo dược điển Việt Nam V, dược liệu Linh chi hay còn gọi là nấm lim, nấm trường thọ là thể quả hóa gỗ đã phơi hay sấy khô của Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.2 Đặc điểm hình thái - Cuống nấm: rất nhiều loài không có cuống (các loài đa niên đều không cuống) G. tornatum,… Kích thước cuống ở các loài rất khác nhau, từ rất ngắn (0,5 cm), rất mảnh (0,2 cm) cho đến dài từ 5-10 cm hoặc rất dài 20-25 cm, đường kính có thể tới 3,3 cm 1.
Cuống nấm khác nhau về hình dạng: hình trụ nếu kích thước ở các phần đều nhau, phình bụng nếu phần giữa cuống phình to hơn, dạng củ, dạng thoi,…Cuống nấm có thể đặc, xốp hay rỗng. Trên cuống có thể nhẵn hay có các phần phụ 10. - Mũ nấm có nhiều kiểu hình đa dạng. Có khi chỉ nhỏ như vảy cá khoảng 0,3 cm (Amauroderma macer), nhưng có những loài linh chi cổ (G.
applanatum,…) có thể tới 60 cm. Ngay cả các loài linh chi G. lucidum, mũ nấm cũng thay đổi từ vài cm tới > 30 cm hình quạt, thận, gần tròn,…với các màu sắc phong phú của lớp vỏ láng 1. 4 - Thịt nấm: thịt nấm bao gồm chất thịt, chất gỗ cứng, chất lie mềm,…Chúng có cấu trúc đồng nhất phân tầng gồm 2, 3 lớp.
Thịt nấm rất khác nhau về màu sắc, mùi, vị cũng như phản ứng khi tiếp xúc với không khí và các chất hóa học 10. - Bụi bào tử: bào tử được phóng thích vào không khí, có màu sắc đặc trưng khác nhau 10. - Cấu trúc hiển vi của nấm: những đặc điểm hiển vi có ý nghĩa trong phân loại. Hệ thống sợi nấm: các loài Ganodermataceae Donk được khảo sát đều cấu tạo từ hệ thống sợi trimitic: từ các sợi nguyên thủy, phát triển thành các bó sợi cứng màng dày, ít phân nhánh, được bện lại bởi các hệ thống sợi bện phân nhánh rất mạnh 1.
Bào tử khác nhau về hình dạng, kích thước, cấu trúc vỏ, lỗ nảy mầm, màu sắc,…và đặc trưng cho các phân loài. Ở phần lớn nấm, bào tử hay đảm bào tử là đơn bào. Cấu trúc bào tử ở họ Ganodermataceae có 2 lớp màng. Lớp màng trong thường xù xì dạng mụn hay có gai vươn ra nhập với lớp màng ngoài 10.
Bào tầng có cấu trúc thuần nhất với cấu trúc ống tròn hay gần tròn 1.1 biểu diễn hình ảnh quả thể một số loài nấm linh chi bao gồm G. Hình ảnh một số loài nấm linh chi 11 (a) G.3 Chu trình sống Chu trình sống điển hình của nấm linh chi cũng như của các nấm đảm có thể tóm tắt như sau: đảm bào tử khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm cho sợi đơn bội. Chúng thường hình thành vách ngăn, tạo nên những tế bào có một nhân. Dạng sợi này tồn tại rất ngắn, sự phối hợp nguyên sinh chất giữa hai sợi đơn bội xảy ra rất sớm.
5 và quá trình song hạch hóa diễn ra để tạo sợi song hạch. Quả thể là do các sợi song hạch liên kết lại tạo thành 10,12.2 mô tả chu trình phát triển ở nấm đảm. Chu trình phát triển ở nấm đảm 12 1.4 Thành phần hoá học 1.1 Polysaccharid Polysaccharid là những chuỗi phân tử đường liên kết với nhau bằng liên kết glycosid. Nhiều loại polysaccharid khác nhau với trọng lượng phân tử khác nhau từ 4.106 Da đã được tìm thấy trong quả thể và sợi nấm của G.
Hơn 200 Ganoderma polysaccharid (Ganopoly) đã được phân lập từ quả thể, bào tử, sợi nấm và dịch nuôi cấy của nấm linh chi. Các polysaccharid có hoạt tính sinh học là glucans, β-1-3 và β-1-6 D-glucans. Ganopoly bao gồm các polysaccharid trung tính, cấu tạo bởi các đơn vị glucose, khoảng 1/3 polysaccharid là (1->3)-β-D-glucan chứa nhánh β-(1->6)-D-glucosyl. Các nghiên cứu đã báo cáo hầu hết glucan có tác dụng chống ung thư chứa lõi glucan được phân nhánh với liên kết (1->3)-β-, (1->4)-β- và hoặc (1->6)- β- và có khối lượng phân tử trung bình là 1.
Tuy nhiên, có sự khác biệt đáng kể về hàm lượng (1->3)-β-D-glucan polysaccharid trong quả thể thu được từ phương pháp nuôi cấy trên môi trường rắn hay lên men lỏng. Hàm lượng của. 6 các polysaccharid khác nhau do phương pháp chiết xuất và bộ phận dùng khác nhau (sợi nấm, quả thể hoặc bột bào tử) 5.2 Triterpenoid Triterpenoid là một trong những thành phần có hoạt tính sinh học quan trọng nhất của nấm linh chi. Hai triterpenoid mới là acid ganoderic A và B lần đầu tiên được chiết xuất từ biểu bì khô của G.
lucidum bởi Kubota và cộng sự vào năm 1982. Sau đó, hơn 130 triterpenoid oxy hóa (hầu hết là triterpenoid loại lanostan) đã được phân lập từ quả thể, bào tử, sợi nấm và môi trường nuôi cấy nấm linh chi. Các triterpen này có thể được chia thành các hợp chất C30, C27, C24 theo số nguyên tử carbon và dựa vào cấu trúc và các nhóm chức. Phần lớn triterpenoid có trọng lượng phân tử 400-600 kDa và có cấu trúc phức tạp hơn nhóm lanostan 5.3 Protein, peptid và acid amin Một số protein hoạt tính đã được phân lập từ nấm linh chi, một số khác ở dạng phức polysaccharid-peptid.
Năm 1989, một protein mới đã được phân lập từ dịch chiết sợi nấm của G. lucidum được đặt tên là Ling zhi – 8 (LZ-8) 13. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng peptid của nấm linh chi là thành phần chính chống oxy hóa. Đến nay, một vài peptid hoạt tính đã được phân lập từ phần dịch tan trong nước của G.
Một số loại acid amin cần thiết cho cơ thể có giá trị dinh dưỡng và dược tính cao từ nấm linh chi cũng được báo cáo. Hàm lượng acid aspartic, acid leucin từ sợi nấm, quả thể và bột bào tử cao hơn acid amin khác. Hàm lượng acid amin khác nhau ở các loài nấm linh chi 5.4 Một số thành phần hoá học khác Cholesterol đã được phân lập từ dịch chiết cồn của G. lucidum bằng sắc ký cột.
Hợp chất này được xác định là 24-metyl-cholest-5, 22-dien-3b-ol bằng phương pháp quang phổ. Năm 2005, Hajjaj và cộng sự đã báo cáo việc phân lập và xác định 26-oxygenosterol ganoderol A, ganoderol B, ganoderal A, acid ganoderic Y và tác dụng sinh học của chúng đến tổng hợp cholesterol trên dòng tế bào gan người in vitro. Trong khi đó, các steroid như 5a-ergosta-7, 22-dien-3b-ol hoặc 5,8-perfioxy-5a, 8a- ergosta-6, 22-dien-3b-ol cũng được phân lập từ G. Một số hợp chất.
7 kháng khuẩn được phân lập từ linh chi, như acid applanoxidic A từ G.