Luận văn thạc sĩ: Giải mã và phân tích hệ gen virus viêm gan vịt cường độc chủng Ninh Thuận

Luận văn thạc sĩ phân tích hệ gen virus viêm gan vịt cường độc chủng Ninh Thuận, cung cấp cái nhìn sâu sắc về dịch bệnh tại Việt Nam.

• Tác giả: Đỗ Thị Roan
• Người hướng dẫn: TS. Đoàn Thị Thanh Hương
• Trường học: Viện Công nghệ sinh học
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Giải mã và phân tích hệ gen virus viêm gan vịt cường độc chủng Ninh Thuận (NT) phân lập tại Việt Nam năm 2013
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS VIÊM GAN VỊT

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus viêm gan vịt cường độc tại Ninh Thuận

Virus viêm gan vịt cường độc (Duck Hepatitis Virus) là một trong những mối đe dọa lớn đối với ngành chăn nuôi gia cầm tại Việt Nam, đặc biệt là tại Ninh Thuận. Bệnh này chủ yếu ảnh hưởng đến vịt con, gây tỷ lệ tử vong cao, có thể lên đến 100% trong một số trường hợp. Việc hiểu rõ về hệ gen virus này là rất quan trọng để phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả. Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng virus viêm gan vịt có ba genotype chính, trong đó genotype III mới được phát hiện tại một số địa phương ở Việt Nam.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus viêm gan vịt

Virus viêm gan vịt thuộc họ Picornaviridae, có kích thước nhỏ và chứa RNA sợi đơn dương. Hệ gen của virus này dài khoảng 7600 đến 7700 nucleotide, với một khung đọc mở duy nhất. Đặc điểm này giúp virus dễ dàng nhân lên trong tế bào chủ, gây ra các triệu chứng nghiêm trọng cho vịt con.

1.2. Tình hình dịch bệnh viêm gan vịt tại Ninh Thuận

Tại Ninh Thuận, dịch bệnh viêm gan vịt đã gây ra thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi. Các chủng virus cường độc đã được phát hiện, làm tăng nguy cơ lây lan và ảnh hưởng đến kinh tế của người chăn nuôi. Việc theo dõi và nghiên cứu hệ gen virus là cần thiết để có biện pháp ứng phó kịp thời.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu virus viêm gan vịt

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về virus viêm gan vịt, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc giải mã hệ gen virus này. Các chủng virus khác nhau có thể có sự biến đổi gen, làm cho việc phát triển vaccine và phương pháp điều trị trở nên khó khăn. Đặc biệt, sự xuất hiện của genotype III tại Việt Nam đã đặt ra nhiều câu hỏi về khả năng lây lan và độc lực của virus.

2.1. Sự biến đổi gen của virus viêm gan vịt

Virus viêm gan vịt có khả năng biến đổi gen cao, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng mới. Điều này gây khó khăn trong việc phát triển vaccine hiệu quả và làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh.

2.2. Khó khăn trong việc phát hiện và phân lập virus

Việc phát hiện và phân lập virus viêm gan vịt cường độc gặp nhiều khó khăn do tính chất lây lan nhanh và tỷ lệ tử vong cao. Các phương pháp hiện tại cần được cải tiến để đảm bảo phát hiện kịp thời và chính xác.

III. Phương pháp giải mã hệ gen virus viêm gan vịt

Nghiên cứu giải mã hệ gen virus viêm gan vịt cường độc chủng Ninh Thuận được thực hiện bằng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại. Việc thu nhận trình tự nucleotide của toàn bộ hệ gen là bước quan trọng để hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của virus. Phân tích trật tự sắp xếp gen giúp xác định các đặc điểm phân tử của virus, từ đó có thể phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

3.1. Quy trình thu nhận trình tự nucleotide

Quy trình thu nhận trình tự nucleotide bao gồm các bước như phân lập virus, chiết xuất RNA và thực hiện phản ứng PCR. Các bước này cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác trong việc giải mã gen.

3.2. Phân tích trật tự sắp xếp gen

Phân tích trật tự sắp xếp gen giúp xác định các vùng gen quan trọng và mối quan hệ giữa các chủng virus khác nhau. Việc so sánh trình tự nucleotide của chủng Ninh Thuận với các chủng khác trên thế giới cung cấp thông tin quý giá cho nghiên cứu.

IV. Ứng dụng thực tiễn từ nghiên cứu virus viêm gan vịt

Kết quả nghiên cứu về hệ gen virus viêm gan vịt cường độc có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Việc phát triển vaccine và các phương pháp điều trị hiệu quả là một trong những ứng dụng quan trọng nhất. Ngoài ra, nghiên cứu cũng giúp nâng cao nhận thức về bệnh và các biện pháp phòng ngừa cho người chăn nuôi.

4.1. Phát triển vaccine hiệu quả

Nghiên cứu về hệ gen virus giúp xác định các kháng nguyên tiềm năng cho việc phát triển vaccine. Vaccine hiệu quả có thể giúp giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh gây ra cho ngành chăn nuôi.

4.2. Nâng cao nhận thức về bệnh viêm gan vịt

Thông qua nghiên cứu, người chăn nuôi có thể được trang bị kiến thức cần thiết để phòng ngừa dịch bệnh. Việc nâng cao nhận thức về bệnh và các biện pháp phòng ngừa là rất quan trọng để bảo vệ đàn vịt.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu virus viêm gan vịt

Nghiên cứu về hệ gen virus viêm gan vịt cường độc tại Ninh Thuận đã mở ra nhiều hướng đi mới cho việc phòng ngừa và điều trị bệnh. Tương lai của nghiên cứu này phụ thuộc vào việc tiếp tục phát triển các phương pháp sinh học phân tử và tăng cường hợp tác giữa các nhà nghiên cứu. Việc hiểu rõ hơn về virus sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại cho ngành chăn nuôi và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Hướng đi mới trong nghiên cứu virus

Nghiên cứu cần tiếp tục tập trung vào việc phát hiện và phân lập các chủng virus mới. Điều này sẽ giúp nâng cao hiểu biết về virus và phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

5.2. Tăng cường hợp tác nghiên cứu

Hợp tác giữa các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước là cần thiết để chia sẻ thông tin và kinh nghiệm. Việc này sẽ giúp đẩy nhanh tiến độ nghiên cứu và ứng dụng các kết quả vào thực tiễn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck Hepatitis Virus - DHV) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trong ngành chăn nuôi gia cầm, đặc biệt ảnh hưởng nghiêm trọng đến vịt con dưới 6 tuần tuổi với tỷ lệ chết có thể lên đến 95-100%. Tại Việt Nam, bệnh đã được phát hiện từ năm 1978 và gây thiệt hại lớn về kinh tế, đặc biệt khi các giống vịt nhập khẩu chưa thích nghi tốt với môi trường. Virus viêm gan vịt thuộc họ Picornaviridae, gồm ba genotype chính: DHAV-1, DHAV-2 và DHAV-3. Trong đó, DHAV-1 là genotype phổ biến và được sử dụng làm nguồn vaccine chính, còn DHAV-3 mới được phát hiện gần đây tại Việt Nam và một số quốc gia châu Á.

Nghiên cứu này tập trung giải mã và phân tích toàn bộ hệ gen của chủng virus viêm gan vịt cường độc phân lập tại tỉnh Ninh Thuận năm 2013 (ký hiệu chủng NT), nhằm làm rõ đặc điểm phân tử, vị trí phân loại và mối quan hệ phả hệ của chủng virus này với các chủng trên thế giới. Mục tiêu cụ thể là thu nhận trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen, phân tích cấu trúc gen, so sánh với các chủng virus khác và xây dựng cây phả hệ. Nghiên cứu có phạm vi từ mẫu bệnh phẩm thu thập tại Ninh Thuận năm 2013, sử dụng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại để giải mã hệ gen. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển vaccine phù hợp, nâng cao hiệu quả phòng chống bệnh viêm gan vịt tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về sinh học phân tử virus thuộc họ Picornaviridae, đặc biệt là cấu trúc và chức năng của hệ gen RNA sợi đơn dương. Hệ gen virus viêm gan vịt có kích thước khoảng 7.7 kb, chứa một khung đọc mở (ORF) mã hóa polyprotein tiền thân, sau đó được phân cắt thành các protein cấu trúc (VP0, VP3, VP1) và không cấu trúc (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D). Các protein này đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên, độc lực và kháng nguyên của virus. Lý thuyết về phân loại virus dựa trên trình tự nucleotide và amino acid, cũng như phân tích phả hệ bằng phần mềm MEGA và GeneDoc được áp dụng để xác định genotype và mối quan hệ tiến hóa.

Ba khái niệm chính được sử dụng gồm:

• Genotype: Phân loại virus dựa trên trình tự gen, gồm DHAV-1, DHAV-2, DHAV-3.
• Polyprotein: Protein tiền thân được mã hóa bởi ORF, sau đó phân cắt thành các protein chức năng.
• Phân tích phả hệ: Xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các chủng virus dựa trên trình tự nucleotide.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là mẫu nước trứng vịt chứa virus viêm gan vịt cường độc chủng NT phân lập tại Ninh Thuận năm 2013. RNA tổng số được tách chiết bằng bộ kit QIAamp Viral Mini kit, sau đó chuyển đổi thành cDNA sử dụng enzyme Maxima Reverse Transcriptase. Phản ứng PCR đa mồi được thiết kế để thu nhận từng phân đoạn gen, bao gồm gen VP1 và toàn bộ hệ gen virus với 7 phản ứng PCR khác nhau, mỗi đoạn dài từ 1.2 đến 1.8 kb.

Sản phẩm PCR được tinh sạch, dòng hóa vào vector pJET1.2 hoặc pCR®2.1TOPO, chuyển nạp vào vi khuẩn E. coli để nhân bản. Plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI hoặc BglII, sau đó gửi giải trình tự tại công ty chuyên nghiệp. Chuỗi nucleotide thu nhận được được biên tập và phân tích bằng phần mềm GeneDoc và MEGA 6.0 để so sánh trình tự, xác định genotype và xây dựng cây phả hệ.

Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm 40 chủng virus viêm gan vịt trên thế giới được lựa chọn từ Ngân hàng gen để so sánh với chủng NT. Phương pháp chọn mẫu dựa trên các chủng đại diện cho ba genotype khác nhau, phân lập từ nhiều quốc gia và thời điểm khác nhau. Phân tích dữ liệu tập trung vào độ tương đồng nucleotide, sự khác biệt amino acid và vị trí cắt protein trong polyprotein.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Xác định genotype chủng NT: Gen VP1 của chủng NT có chiều dài 720 nucleotide, tương đương với các chủng DHAV-3 trên thế giới. Phân tích BLAST cho thấy độ đồng nhất nucleotide từ 93-100% với các chủng DHAV-3, khẳng định chủng NT thuộc genotype III.

2. Giải mã toàn bộ hệ gen: Hệ gen chủng NT dài 7790 nucleotide, bao gồm 652 bp vùng 5’UTR, 366 bp vùng 3’UTR và 16 nucleotide polyA. ORF dài 6756 bp mã hóa 2251 amino acid, cấu trúc gen gồm các tổ hợp P1 (VP0, VP3, VP1), P2 (2A1, 2A2, 2B, 2C) và P3 (3A, 3B, 3C, 3D). Thành phần nucleotide gồm A 27.5%, T 29.6%, G 22.4%, C 20.5%.

3. So sánh trình tự nucleotide và amino acid: Chủng NT có sự khác biệt đáng kể với chủng vaccine DHAV-1 đang sử dụng tại Việt Nam, đặc biệt ở gen VP1 và các vị trí cắt protein trong polyprotein. Ví dụ, vị trí cắt giữa protein 3B và 3C ở chủng NT là E/S, khác với Q/S ở chủng DN2 (cùng genotype III) và E/N ở chủng vaccine VXXT (DHAV-1).

4. Phân tích phả hệ: Cây phả hệ dựa trên toàn bộ ORF phân chia các chủng virus thành ba nhóm genotype rõ ràng. Chủng NT nằm trong nhóm genotype III, gần gũi nhất với các chủng phân lập tại Trung Quốc năm 2011-2012, cho thấy khả năng nguồn gốc du nhập từ Trung Quốc qua biên giới.

Thảo luận kết quả

Sự xác định chủng NT thuộc genotype III với đặc điểm hệ gen tương đồng cao với các chủng DHAV-3 trên thế giới cho thấy sự đa dạng và biến đổi của virus viêm gan vịt tại Việt Nam. Sự khác biệt về trình tự nucleotide và amino acid so với vaccine DHAV-1 hiện hành có thể giải thích nguyên nhân dịch bệnh vẫn xảy ra dù đã tiêm phòng vaccine, do tính kháng nguyên không tương thích.

Phân tích vị trí cắt protein và thành phần amino acid cho thấy các biến đổi có thể ảnh hưởng đến độc lực và khả năng nhận diện miễn dịch của virus. Điều này nhấn mạnh nhu cầu phát triển vaccine mới dựa trên chủng DHAV-3 để nâng cao hiệu quả phòng bệnh.

Cây phả hệ minh họa rõ ràng sự phân bố địa lý và tiến hóa của các chủng virus, đồng thời cho thấy Việt Nam là điểm giao thoa của các chủng virus từ Trung Quốc và các quốc gia khác. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu quốc tế và cung cấp cơ sở khoa học cho việc kiểm soát dịch bệnh và quản lý nguồn gen virus.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cây phả hệ, bảng so sánh tỷ lệ nucleotide và amino acid, cũng như hình ảnh điện di sản phẩm PCR để minh chứng cho chất lượng mẫu và kết quả giải mã.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển vaccine mới dựa trên genotype III: Khẩn trương nghiên cứu và sản xuất vaccine viêm gan vịt dựa trên chủng DHAV-3, nhằm tăng cường hiệu quả bảo hộ cho đàn vịt, đặc biệt tại các vùng có lưu hành chủng này. Thời gian thực hiện dự kiến 2-3 năm, do các viện nghiên cứu và doanh nghiệp dược thú y phối hợp.

2. Tăng cường giám sát và phân tích hệ gen virus: Thiết lập hệ thống giám sát dịch tễ và giải mã hệ gen virus viêm gan vịt định kỳ tại các vùng trọng điểm để phát hiện sớm các biến chủng mới, hỗ trợ điều chỉnh chiến lược phòng chống kịp thời. Chủ thể thực hiện là các viện nghiên cứu và cơ quan thú y địa phương.

3. Cập nhật và đa dạng hóa nguồn vaccine trên thị trường: Khuyến khích nhập khẩu và sản xuất vaccine đa genotype, bao gồm cả DHAV-1 và DHAV-3, nhằm giảm thiểu nguy cơ dịch bệnh do đồng nhiễm hoặc biến chủng. Thời gian triển khai trong vòng 1-2 năm, phối hợp giữa Bộ Nông nghiệp và các doanh nghiệp.

4. Tuyên truyền và đào tạo kỹ thuật phòng bệnh: Nâng cao nhận thức của người chăn nuôi về đặc điểm bệnh viêm gan vịt, cách phòng ngừa và sử dụng vaccine đúng cách, góp phần giảm thiểu thiệt hại kinh tế. Chủ thể thực hiện là các trung tâm khuyến nông và tổ chức đào tạo trong 6-12 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học phân tử, vi sinh vật: Luận văn cung cấp dữ liệu hệ gen virus viêm gan vịt mới nhất, phương pháp giải mã và phân tích phả hệ, hỗ trợ nghiên cứu sâu về virus RNA và tiến hóa phân tử.

2. Chuyên gia và kỹ thuật viên thú y: Thông tin về đặc điểm virus, genotype và mối liên quan với vaccine giúp cải thiện công tác chẩn đoán, phòng bệnh và phát triển vaccine phù hợp.

3. Doanh nghiệp sản xuất vaccine và thuốc thú y: Cơ sở dữ liệu gen và phân tích kháng nguyên giúp thiết kế vaccine thế hệ mới, nâng cao hiệu quả phòng chống dịch bệnh viêm gan vịt.

4. Người chăn nuôi và quản lý trang trại vịt: Hiểu rõ về bệnh, virus và các biện pháp phòng ngừa giúp giảm thiệt hại kinh tế, nâng cao năng suất chăn nuôi.

Câu hỏi thường gặp

1. Virus viêm gan vịt có mấy genotype chính?
   Virus viêm gan vịt gồm ba genotype chính: DHAV-1, DHAV-2 và DHAV-3. Trong đó, DHAV-1 phổ biến nhất và được sử dụng làm vaccine chính, còn DHAV-3 mới được phát hiện gần đây tại Việt Nam và một số nước châu Á.

2. Tại sao vaccine hiện tại không hiệu quả với chủng DHAV-3?
   Vaccine hiện tại chủ yếu dựa trên chủng DHAV-1, trong khi chủng DHAV-3 có sự khác biệt đáng kể về trình tự gen và kháng nguyên, dẫn đến khả năng bảo hộ thấp khi virus DHAV-3 lưu hành.

3. Phương pháp nào được sử dụng để giải mã hệ gen virus?
   Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật tách chiết RNA, chuyển đổi thành cDNA, PCR đa mồi để thu nhận các đoạn gen, dòng hóa vào vector, nhân bản trong vi khuẩn và giải trình tự DNA tự động.

4. Mối quan hệ phả hệ của chủng NT với các chủng khác như thế nào?
   Chủng NT thuộc genotype III, có quan hệ gần gũi nhất với các chủng phân lập tại Trung Quốc năm 2011-2012, cho thấy khả năng nguồn gốc du nhập từ Trung Quốc qua biên giới.

5. Làm thế nào để phòng chống hiệu quả bệnh viêm gan vịt hiện nay?
   Cần sử dụng vaccine phù hợp với genotype lưu hành, kết hợp giám sát dịch tễ, áp dụng biện pháp vệ sinh chăn nuôi và đào tạo người chăn nuôi về phòng bệnh để giảm thiểu thiệt hại.

Kết luận

• Chủng virus viêm gan vịt cường độc phân lập tại Ninh Thuận năm 2013 thuộc genotype III (DHAV-3), có hệ gen dài 7790 nucleotide, mã hóa 2251 amino acid.
• Chủng NT có sự khác biệt rõ rệt về trình tự nucleotide và amino acid so với vaccine DHAV-1 đang sử dụng tại Việt Nam, đặc biệt ở gen VP1 và vị trí cắt protein.
• Phân tích phả hệ cho thấy chủng NT có nguồn gốc gần với các chủng DHAV-3 phân lập tại Trung Quốc, phản ánh sự đa dạng và biến đổi của virus viêm gan vịt tại Việt Nam.
• Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho việc phát triển vaccine mới phù hợp với genotype lưu hành, nâng cao hiệu quả phòng chống bệnh.
• Đề xuất triển khai nghiên cứu vaccine DHAV-3, tăng cường giám sát và đào tạo phòng bệnh nhằm giảm thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi vịt.

Luận văn mở ra hướng nghiên cứu mới về đặc điểm phân tử virus viêm gan vịt tại Việt Nam, kêu gọi các nhà khoa học và doanh nghiệp phối hợp phát triển vaccine thế hệ mới, đồng thời nâng cao nhận thức phòng chống dịch bệnh trong cộng đồng chăn nuôi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ----------------------------------- ĐỖ THỊ ROAN GIẢI MÃ VÀ PHÂN TÍCH HỆ GEN VIRUS VIÊM GAN VỊT CƢỜNG ĐỘC CHỦNG NT PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM NĂM 2013 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 12/2014 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 2 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ----------------------------------------- ĐỖ THỊ ROAN GIẢI MÃ VÀ PHÂN TÍCH HỆ GEN VIRUS VIÊM GAN VỊT CƢỜNG ĐỘC CHỦNG NT PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM NĂM 2013 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn: TS. ĐOÀN THỊ THANH HƢƠNG Viện Công nghệ sinh học Hà Nội – 12/2014 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 3 MỞ ĐẦU Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck Hepatitis Virus) được coi là một bệnh cổ điển của ngành chăn nuôi gia cầm trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Bê ̣nh xảy ra ở vịt con từ 1 đến 6 tuần tuổi, và đặc biệt mẫn cảm với vịt con dưới 1 tuần tuổi, tố c đô ̣ lây lan nhanh với tỷ lệ chết rất cao, có khi lên đến 95 – 100% toàn đàn. Bệnh gây thiệt hại rất lớn về kinh tế, là mối lo ngại cho các nhà chăn nuôi.

Trên thế giới, mặc dù được phát hiện từ trước những năm 1950 nhưng chỉ trong vòng 10 năm gầ n đây virus viêm gan vịt được nghiên cứu sâu sắc ở mức độ sinh học phân tử gen và hệ gen, đặc biệt về ứng dụng sinh học phân tử trong giám định, nghiên cứu hệ gen, phân loại và tìm hiểu quan hệ sinh học trong họ Picornaviridae. Theo quan điểm phân loại hiện nay, virus viêm gan vịt gồm ba genotype khác nhau: genotype I (DHAV-1), genotype II (DHAV-2) và genotype III (DHAV-3). Tại Việt Nam, từ trước đến nay mới chỉ công bố sự phổ biến của virus viêm gan vịt thuộc genotype I, bao gồm cả các chủng cường độc và vaccine. Tuy nhiên trong những điều tra mới đây, virus viêm gan vịt thuộc genotype III đã phát hiện ở một số địa phương của Việt Nam.

Để làm sáng rõ về đặc điểm phân tử của virus thuộc genotype 3 mới phát hiện này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Giải mã và phân tích hệ gen virus viêm gan vịt cường độc chủng Ninh Thuận (NT) phân lập tại Việt Nam năm 2013”. Đề tài được thực hiện với những mục tiêu và nội dung sau: 1. Mục tiêu: - Thu nhận được trình tự nucleotide của toàn bộ hệ gen của một chủng virus viêm gan vịt cường độc mới phân lập tại Việt Nam năm 2013. - Phân tích được trật tự sắp xếp của từng vùng gen và đặc điểm phân tử của các phân đoạn gen trong hệ gen.

Nội dung: Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4 - Phân lập và thu thập một chủng virus cường độc viêm gan vịt mới phân lập tại tỉnh Ninh Thuận (Việt Nam) năm 2013 (Kí hiệu chủng: NT). - Giải mã toàn bộ hệ gen của virus viêm gan vịt chủng NT (có kích thước khoảng 7. - Phân tích trật tự sắp xếp của các gen theo từng vùng gen. - So sánh trình tự nucleotide của chủng NT với các chủng virus viêm gan vịt khác của Việt Nam và thế giới.

- Xây dựng cây phả hệ và vị trí phân loại. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS VIÊM GAN VỊT 1. Cấ u ta ̣o chung Virus viêm gan vịt (duck hepatitis virus) thuộc họ Picornaviridae, có kích thước nhỏ, khoảng 20-30 nm, không có vỏ bọc ngoài cùng.

Hệ gen của virus viêm gan vịt chứa acid ribonucleic (RNA) sợi đơn dương có độ dài khoảng 7600 đến 7700 nucleotide và đuôi poly A ở đầu 3’, chứa duy nhất một khung đọc mở (open reading frame) mã hoá cho một protein chung (polyprotein). Protein này, sau khi tổng hợp phải trải qua nhiều lần phân cắt để tạo nên các sản phẩm protein độc lập. Hệ gen RNA của virus rất đặc biệt, có chứa một protein ở đầu 5’ có tác dụng như một primer của quá trình sao chép RNA nhờ RNA polymerase (www.com/EBchecked/topic/459528/Picornavirus). Các virus thuộc họ Picornaviridae rất đa dạng (có tới trên 200 genotype) và là loại virus được biết đến từ sớm nhất.

Bệnh do chúng gây ra rất đa dạng, có thể là bệnh cấp tính hay nhiễm trùng mãn tính, bao gồm cả nhiều bệnh nguy hiểm trên người và động vật. Picornavirus rất nhỏ bé, có thể xuyên qua được màng lọc thông thường (Levine, Fabricant, 1950). Qua kính hiển vi điện tử, virus là những hạt tròn, bề mặt xù xì, không có vỏ bọc ngoài cùng (hình 1. Hepatitis A virus - Picornavirus capsid Viral polypeptides 27 nm VPG ss RNA Hình 1.

Mô hình cấu trúc của một chủng virus thuộc họ Picornavirus (Hepatitis A virus ).com) Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Đặc điểm cấu trúc hệ gen của virus viêm gan vịt Trong họ Picornaviridae, tất cả virus đều bị thiếu cấu trúc mũ ở đầu 5’ mà thay vào đó là một protein (khoảng 23 amino acid) gọi là VPg (v irion protein genome-link). VPg này liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ thông qua một gốc tyrosine (Cheney et al. Ở cả hai đầu của hệ gen Picornavirus đều có vùng không dịch mã (UTR).

Vùng 5’UTR dài hơn, có độ dài khoảng từ 600 đến 1200 bp, trong khi vùng 3’UTR thường có độ dài chỉ từ 50 đến 100 bp. Vùng 5’UTR có vai trò quan trọng đối với quá trình sao mã và vùng 3’UTR có vai trò trong quá trình tổng hợp sợi âm. Tuy nhiên đầu 5’ cũng có thể có vai trò trong việc làm tăng cường độc lực của virus. Trong hệ gen của Picornavirus có một vùng nucleotide làm điểm khởi đầu để ribosome dịch mã, gọi là IRES – Internal Ribosome Entry Site, đó là một cấu trúc di truyền hoạt động phức tạp dạng cis với cấu trúc bổ sung thứ cấp khởi động cho quá trình dịch mã không phụ thuộc điểm mũ của hệ gen virus (Chard et al.

Nằm giữa hai vùng 5’ và 3’ là một khung đọc mở (open frame reading) lớn, mã hóa khoảng từ 2100 đến 2400 amino acid cho cả các protein cấu trúc và không cấu trúc. Đầu cuối 3’ của hệ gen virus có gắn thêm đuôi poly A, dài khoảng từ 16 đến18 nucleotide. Trong chuỗi polypeptide, phần protein đầu tiên là protein dẫn, ký hiệu là L (Leader protein), tiếp theo là 4 loại protein cấu trúc bao gồm VP4 (1A), VP2 (1B), VP3 (1C) và VP1 (1D), đoạn cuối cùng gồm 7 protein không cấu trúc là protein 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C và 3D. Tuy nhiên, ở các chi virus khác nhau thì trật tự này có sự thay đổi nhỏ.

Chuỗi polypeptide chung của Picornavirus thường bị phân giải bởi một, hai hoặc cả ba enzyme protease là 3Cpro, 2Apro và Lpro thành 10, 11 hoặc 12 chuỗi (Krumbholz et al. Toàn bộ chuỗi các protein liên tục này gồm 2249 amino acid, đươ ̣c mã hóa bởi 6747 nucleotide (Ding, Zhang, 2007). Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cấu trúc không gian của Picornavirus.

Các protein VP1, VP2 và VP3 nằm trên bề mặt vỏ kháng nguyên; protein VP4 lặn sâu vào bên trong (Nguồn: Swiss Institute of Bioinformatics, 2008). Vai trò, chƣ́c năng của các gen và các protein của virus viêm gan vịt Trong hệ gen virus, VPg – tuy là một protein nhỏ, chỉ khoảng 23 amino acid, nhưng có vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình sao mã. VPg là mồi cho quá trình tổng hợp sợi âm, trong khi VPgpUpUOH (một dạng chuyển hoá của VPg) là mồi cho quá trình tổng hợp sợi dương. Cấu trúc hệ gen của một loại virus họ Picornavirus (Kok, McMinn, 2009).

Hệ gen chia làm ba phần chính : P1, P2, P3 mã hóa cho chuỗi polyprotein chung, sau đó tự phân cắt thành các protein thành phần. Các protein VP1, VP2, VP3 và VP4 trong tổ hợp protein P1 có vai trò trong quá trình tạo vỏ capsid của virus. Ba loại protein đầu tiên nằm ở mặt ngoài của virus, protein VP4 ngắn hơn, nằm hoàn toàn ở bên trong vỏ capsid (Hình 1. Trong 4 loại protein này, VP1 có vai trò đặc biệt quan trọng, quyết định tính kháng nguyên và độc Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 8 lực của virus.

Bảy loại protein còn lại 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D là các protein không cấu trúc, tham gia vào các quá trình nhân lên của virus. Trong đó, Lpro chỉ xuất hiện trong các tế bào nhiễm Aphtovirus và Cardiovirus. Các enzyme này không chỉ phân cắt các chuỗi peptide của virus mà còn ức chế hoạt động tế bào của nhiều loại tế bào vật chủ khác nhau và gây ảnh hưởng đến chức năng nội bào. 3Cpro của Picornavirus có thể xâm nhập vào nhân thông qua tiền tố có mang trình tự định vị nhân (NLS) của chúng là 3CD’ hay 3CD (Amineva et al., 2004; Sharma et al.

3Cpro đồng thời có thể phân cắt phần lớn các yếu tố hoặc các nhân tố điều hoà liên quan đến RNA polymerase I, II, III của tế bào. Ngoài ra, 3Cpro còn liên quan đến quá trình ức chế phiên mã của tế bào vật chủ. 2Apro có khả năng phân cắt protein gắ n có cấ u trúc hô ̣p TATA in-vitro nhưng lại không có khả năng ức chế quá trình phiên mã của tế bào vật chủ (Yalamachili et al. Các protein khác của Picornavirus bao gồm 2B, 2BC, 3A và 3D liên quan đến quá trình sao chép RNA.

Cụ thể : Protein 2B/2BC Các protein 2B hay protein 2BC được giả thiết là có khả năng biến đổi màng của các tế bào bị nhiễm. Protein 2B và tiền thân của chúng là 2BC có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên và gắn dính vào màng của hệ thống Golgi và phức hợp mạng lưới nội chât (endoplasmic reticulum-ER) của tế bào vật chủ, từ đó hình thành nên các cấu trúc túi hạt trên màng tế bào vật chủ bị viêm nhiễm và hình thành phức hợp viroporin (Jong et al. Sự tích luỹ các protein 2B và 2BC trong mạng lưới Golgi dẫn đến thay đổi tính thấm của màng sinh chất (Jong et al., 2008) và làm cho cấu trúc thể Golgi trở nên lỏng lẻo, từ đó có thể gây chết tế bào (Kuppeveld et al.