LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn nhƣ thực vật, vi sinh vật, động vật có xƣơng sống và không xƣơng sống là những nguồn có giá trị của các hợp chất hoạt tính sinh học. Một số lƣợng lớn các loại thuốc đã đƣợc phát triển trong ngành y từ các sản phẩm tự nhiên. Kể từ khi phát hiện và thành công trong việc điều trị của peniciline, các vi sinh vật đã đƣợc sử dụng nhƣ một nguồn đặc biệt của các tác nhân hoạt tính sinh học có cấu trúc đa dạng.
Các ứng dụng điều trị của các chất chuyển hóa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát hiện ra kháng sinh (ví dụ peniciline, erythromycin…), ức chế miễn dịch trong cấy ghép, các tác nhân giảm cholesterol (ví dụ lovastain và mevastatin) và tác nhân chống ung thƣ (ví dụ doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin). Từ khi nền khoa học hiện đại bắt đầu, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đƣợc chiết xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ,… đã đƣợc sử dụng trong việc làm thuốc đông y, mỹ phẩm, thực phẩm,. Nhƣng sau đó, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đã đƣợc nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hóa học cũng nhƣ cách tổng hợp bằng phƣơng pháp hóa học, bởi ngƣời ta cho rằng chúng bền hơn, có thể sản xuất trên quy mô lớn và chi phí sản xuất thấp. Tuy nhiên, các vấn đề ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hóa học đã bắt đầu đƣợc chú ý đến.
Chính vì thế so với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh vật ngày càng đƣợc quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự nhiên và an toàn dễ sử dụng, sản xuất đƣợc quanh năm trong các điều kiện địa lý khác nhau và do sự tăng trƣởng nhanh chóng của vi sinh vật nên sẽ làm giảm thời gian sản xuất xuống còn chỉ một vài ngày. So với các nguồn khác từ thực vật hoặc động vật thì hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật có thể dễ dàng đƣợc kiểm soát và dự đoán sản 9 Đồ án tốt nghiệp lƣợng (Francis, 1987; Taylor, 1984). Trong những sắc tố từ vi sinh vật thì hợp chất prodigiosin đƣợc biết đến với ý nghĩa quan trọng. Một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia marcenscens có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N30 = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996; Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005).
Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút đƣợc nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lãnh vực bảo vệ thực vật cũng nhƣ hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Sớm nhận thấy đƣợc lợi rất quan trọng của hợp chất prodigiosin đƣợc tách từ việc nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, Nguyễn Hoàng Anh Kha đã thu nhận sắc tố đỏ prodigiosin từ việc nuôi cấy trong môi trƣờng peptone glycerol đạt 10,575 mg/ml sắc tố ( ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2014). Sau đó ĐATN Trần Lâm Tú Quyên (2014) đã khảo sát trong quá trình lên men thu prodigiosin, môi trƣờng huyền phù đậu phộng MT1 (10%) cho hàm lƣợng prodigiosin là 248,4% so với môi trƣờng peptone glycerol là 100%. Cũng trong ĐATN Trần Lâm Tú Quyên (2014) kết luận môi trƣờng MT3 chứa 10% huyền phù đậu phộng 5% pepton và 1% dầu hƣớng dƣơng, tỉ lệ cấy giống 3%, lắc 180 vòng phút trong 24 giờ đầu sau đó giảm còn 150 vòng/phút là môi trƣờng và điều kiện tối ƣu nhất để tổng hợp sắc tố đỏ prodigiosin.
Nhƣng quá trình lên men còn ở quy mô sản xuất nhỏ 20 ml/bình và còn nhiều yếu tố cần cải thiện. Dựa trên cơ sở này đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Serratia mercescens SH1 VÀ PHƢƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ CANH TRƢỜNG” đƣợc tiến hành nhằm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp. Mục tiêu đề tài Cải tiến điều kiện lên men Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin, cũng nhƣ phƣơng pháp thu hồi sắc tố thô. Nội dung đề tài Khảo sát chủng Serratia marcescens xem xét độ thuần khiết, khảo sát kháng sinh đồ.
Cải tiến điều kiện nuôi cấy Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin: tăng thể tích lên men, ảnh hƣởng của vận tốc lắc, pH nuôi cấy, nồng độ muối % NaCl, thử áp dụng phƣơng pháp đồng nuôi cấy tăng hợp chất thứ cấp, thử áp dụng bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn Gram âm chứa phân tử tín hiệu Quorum sensing. Thiết lập quy trình trích ly sắc tố thô từ canh trƣờng nuôi cấy. Ý nghĩa khoa học Áp dụng các kiến thức về công nghệ lên men sản xuất hợp chất thứ cấp vào tổng hợp prodigiosin. Xem xét khá năng sử dụng chủng Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến trùng EPN vào sản xuất prodigiosin qua kháng sinh đồ khác biệt với chủng phân lập từ bệnh phẩm.
Góp phần vào việc tăng quy mô và nồng độ sản phẩm prodigiosin tổng hợp bằng phƣơng pháp lên men. Ý nghĩa thực tiễn Cung cấp sản phẩm prodigiosin thô cho nghiên cứu tinh sạch và khảo sát hoạt tính sinh học. 11 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.
Hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp là chất đƣợc tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lƣợng phân tử nhỏ, thƣờng đƣợc gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trƣờng xung quanh. Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất đƣợc vi sinh vật tạo ra từ quá trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử sinh học nhƣ thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các thành phần tự nhiên.
Các thành phần, chẳng hạn nhƣ hợp chất thứ cấp, đƣợc xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học nhƣ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến cá, ví dụ nhƣ để tăng màu hồng của cá hồi nuôi. Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên có tiềm năng thƣơng mại để sử dụng nhƣ chất chống oxy hóa. Ngành công nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt.
Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh 12 Đồ án tốt nghiệp vật cung cấp một số lƣợng hợp chất rất lớn nhƣ: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng nhƣ có thể dễ dàng tối ƣu hóa quy trình công nghệ (Juailova và cộng sự, 1997). Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Williams và cộng sự, 1971a).
Các chi vi sinh vật khác nhƣ: Rhodotorula, Bacillus, Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lƣợng lớn hợp chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây chết hoặc kìm hãm vi sinh vật phát triển, đƣợc một số vi sinh vật nhƣ nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của mình.1 tóm tắt về một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật. Danh sách một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật Vi sinh vật Hợp chất thứ cấp Ứng dụng Kiểu tác động ức chế Penicillium Penicillin Ức chế tụ cầu khuẩn, Ức chế tạo polymer notatum, nhiễm trùng kỵ khí, vách tế bào vi khuẩn, giang mai, hen suyễn. ức chế hấp thu amino Penicillium acid và protein, ức chế chrysogenum tạo enzyme 13 Đồ án tốt nghiệp Streptomyces Streptomycin Ức chế vi khuẩn Ức chế ghép nối một griceus Gram âm và ram số amino acid vào dƣơng.
Trị bệnh lao, protein, tác động lên bệnh viêm màng não, hệ enzyme của vi ho gà khuẩn tham gia chuyển pyruvate vào chu trình Creb… Steptomyces Chloramphenicol Ức chế đối với bệnh Ức chế đặc hiệu sinh venezuelae lỵ, sốt cao, sốt phát tổng hợp protein vi ban khuẩn liên quan đến peptidyl transferase trong tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn không cho tạo liên kết peptide Streptomyces Tetracilin Ức chế phổ rộng vi Ức chế tổng hợp aureomycin khuẩn Gram âm, protein Gram dƣơng Streptomyces Erythromycin Chữa bệnh do tụ cầu ức chế vi khuẩn Gram erythraeus khuẩn streptococcal âm và Gram dƣơng gây ra 14 Đồ án tốt nghiệp Streptomyces Neomycin Tác dụng vi khuẩn Hơi độc fradiae Gram âm và Gram dƣơng Streptomyces Kanamycin Điều trị lao, ức chế vi Tác động giống nhƣ kanamycetius khuẩn Gram âm và streptomycin và neomycin Gram dƣơng Streptomyces Cycloserine Điều trị bệnh lao Cản trở tổng hợp vách lavendulae tế bào 1.2 Tổng quan prodigiosin 1. Khái niệm về prodigiosin Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991).
Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp, đƣợc sản xuất bởi các vi khuẩn nhƣ Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous, Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và các xạ khuẩn Gram dƣơng, chẳng hạn Streptoverticillium rubrireticuli và Streptomyces longisporus (Khanafari và cộng sự, 2006).1 trình bày cấu trúc hóa học của các hợp chất đại diện của prodigiosin. 15 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 1. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin đƣợc tổng hợp bởi Serrattia marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962).