Luận văn: Nghiên cứu định lượng kháng sinh β-lactam bằng phương pháp CE-C4D

Luận văn nghiên cứu định lượng kháng sinh β-lactam bằng phương pháp điện di mao quản CE-C4D, tối ưu hóa điều kiện và ứng dụng phân tích mẫu thực tế.

• Tác giả: Ngô Hữu Tuệ
• Người hướng dẫn: Nguyễn Thị Ánh Hường
• Trường học: Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Nghiên cứu định lượng một số kháng sinh β-lactam bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về kháng sinh β lactam và phương pháp định lượng

Kháng sinh β-lactam là một trong những nhóm thuốc quan trọng nhất trong y học hiện đại, được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn. Các kháng sinh này bao gồm penicillin, cephalosporin, carbapenems và các beta-lactamase inhibitors. Để đảm bảo chất lượng và hiệu quả điều trị, định lượng kháng sinh β-lactam là một yêu cầu bắt buộc trong kiểm định dược phẩm. Các phương pháp phân tích truyền thống như phổ hấp thụ UV-Vis và HPLC được sử dụng phổ biến, nhưng điện di mao quản CE-C4D (Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity Detection) là một phương pháp hiện đại hơn, cung cấp độ nhạy cao và khả năng phân tích đồng thời nhiều hoạt chất.

1.1. Cấu trúc và phân loại kháng sinh β lactam

Kháng sinh β-lactam được phân loại thành các nhóm chính: penicillin (amoxicillin, ampicillin), cephalosporin (cefotaxime, cefalexin, cefixime), và beta-lactamase inhibitors (sulbactam). Mỗi nhóm có đặc điểm cấu trúc riêng với vòng β-lactam đặc trưng, quyết định tính chất hoạt động và hiệu quả của chúng.

1.2. Ứng dụng của điện di mao quản trong kiểm định dược phẩm

CE-C4D cho phép phân tích đồng thời nhiều hoạt chất kháng sinh mà không cần sử dụng hệ thống dẫn điện phức tạp. Phương pháp này tiết kiệm thời gian, hóa chất và cung cấp kết quả chính xác, đáp ứng các tiêu chuẩn kiểm định quốc tế.

II. Nguyên lý và cấu tạo hệ thống điện di mao quản CE C4D

Hệ thống điện di mao quản CE-C4D dựa trên nguyên lý tách các ion và phân tử hóa học dựa trên sự khác biệt về điện tích và kích thước trong một mao quản có đường kính siêu nhỏ (50-100 µm). Detector đỡ dẫn không tiếp xúc (C4D) đo độ dẫn điện của các ion, cho phép phát hiện các hoạt chất kháng sinh β-lactam một cách nhạy cảm. Mao quản được phủ một lớp coating để tăng cường hiệu quả tách. Mặt cắt ngang của mao quản cho thấy sự hình thành lớp điện tích kép trên bề mặt, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tách điện. Các thông số quan trọng như pH của dung dịch đệm, nồng độ đệm điện di, chiều dài hiệu dụng của mao quản và thời gian bơm mẫu cần được tối ưu hóa để đạt hiệu quả phân tích tối đa.

2.1. Cấu tạo và hoạt động của hệ thống CE C4D

Hệ CE-C4D gồm: mao quản, hai điện cực, hệ thống bơm mẫu, cấp nguồn điện cao và detector C4D. Quá trình phân tích bắt đầu bằng bơm mẫu vào mao quản, sau đó áp dụng điện trường để tách các hoạt chất dựa trên khác biệt điện tích của chúng.

2.2. Detector đỡ dẫn không tiếp xúc C4D

C4D là một phương pháp phát hiện không tiếp xúc, không làm hỏng mẫu và có độ nhạy cao. Nó đo độ dẫn điện của các hợp chất trong mao quản, rất hiệu quả cho định lượng kháng sinh β-lactam vì các hợp chất này có độ dẫn điện khác nhau.

III. Quy trình tối ưu hóa phương pháp phân tích định lượng kháng sinh β lactam

Để đạt hiệu quả phân tích cao nhất cho định lượng kháng sinh β-lactam bằng CE-C4D, cần tiến hành khảo sát và tối ưu hóa nhiều thông số. Đầu tiên, lựa chọn loại đệm và pH là bước quan trọng, với các đệm như Tris/Acetic (Tris/Ace), Arginine/Ascorbic (Arg/Ascobic) được khảo sát để tìm điều kiện tối ưu. Tiếp theo, nồng độ đệm điện di được điều chỉnh để cải thiện độ phân biệt giữa các hoạt chất. Chiều dài hiệu dụng của mao quản ảnh hưởng đến thời gian phân tích và hiệu quả tách. Thời gian và chiều cao bơm mẫu cũng được tối ưu hóa để đảm bảo lượng mẫu đủ cho phát hiện nhưng không gây quá tải.

3.1. Khảo sát loại đệm và điều chỉnh pH

Việc lựa chọn buffer Tris/Ace ở pH tối ưu cho phép tách tốt nhất các hoạt chất kháng sinh như cefalexin, cefotaxime, sulbactam và cefixime. Điện di đồ cho thấy độ phân biệt rõ ràng giữa các peak khi sử dụng điều kiện buffer phù hợp.

3.2. Xây dựng đường chuẩn và đánh giá phương pháp

Đường chuẩn tuyến tính được xây dựng cho các hoạt chất kháng sinh, với giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định. Độ chụm (lặp lại) và độ đúng (thu hồi) của phương pháp được đánh giá, thường đạt 95-102% thu hồi.

IV. Ứng dụng thực tế và so sánh với các phương pháp khác

Định lượng kháng sinh β-lactam bằng CE-C4D đã được áp dụng thành công trong phân tích các mẫu dược phẩm thực tế, bao gồm các thuốc chứa hoạt chất nhóm 1 (cefalexin, cefotaxime, sulbactam, cefixime) và nhóm 2 (amoxicillin, ampicillin, cefoperazone, sulbactam). Phương pháp này cho phép phân tích đồng thời nhiều hoạt chất trong một mẫu, tiết kiệm thời gian phân tích so với các phương pháp truyền thống. Kết quả phân tích bằng CE-C4D được so sánh với phương pháp LC-MS/MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry), một phương pháp tham chiếu, và cho thấy độ tương quan cao, xác nhận độ tin cậy của CE-C4D. Phương pháp này có ưu điểm: tiêu tốn ít dung môi, chi phí hoạt động thấp, tốc độ phân tích nhanh và không gây ô nhiễm môi trường.

4.1. Phân tích các mẫu dược phẩm thực tế

Các mẫu thuốc chứa kháng sinh β-lactam được xử lý và phân tích bằng CE-C4D sau khi tối ưu hóa điều kiện. Kết quả cho thấy hàm lượng hoạt chất được xác định chính xác, phù hợp với các yêu cầu kiểm định dược phẩm.

4.2. Ưu điểm của CE C4D so với phương pháp truyền thống

Phương pháp CE-C4D có ưu điểm vượt trội: phân tích đồng thời nhiều hoạt chất, tiêu thụ mẫu ít, tốc độ nhanh, chi phí thấp và bảo vệ môi trường. So với HPLC và UV-Vis, CE-C4D cung cấp hiệu quả phân tách tốt hơn và độ nhạy cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Kháng sinh là những chất kháng khuẩn đƣợc chiết xuất từ các chủng vi sinh vật, nấm, đƣợc tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng ức chế vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn khác một cách đặc hiệu. Nhờ có thuốc kháng sinh đã giúp kiểm soát đƣợc nhiều dịch bệnh nguy hiểm do vi khuẩn gây ra. Kháng sinh là nhóm thuốc thiết yếu trong y học, quan trọng nhất là nhóm β-lactam gồm các kháng sinh có cấu trúc hóa học chứa vòng β-lactam. Sự liên kết của vòng này với các cấu trúc khác sẽ hình thành các phân nhóm khác nhau nhƣ: penicilin, cephalosporin và các β-lactam khác.

Lƣợng kháng sinh β-lactam đang sử dụng trong y học là rất lớn và phổ biến với nhiều chế phẩm khác nhau trên thị trƣờng. Trên thế giới, nhu cầu sử dụng thuốc kháng sinh ngày càng tăng, đặc biệt ở các nƣớc đang phát triển, vì nhiễm khuẩn n m trong số những bệnh lý hàng đầu cả về tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong. Theo tổ chức y tế Thế giới (WHO), Việt Nam đƣợc xếp vào nhóm các nƣớc có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất và thuộc nhóm sử dụng nhiều kháng sinh nhất [3,8,20]. Yếu tố chính quyết định đến chất lƣợng thuốc kháng sinh là hàm lƣợng các hoạt chất chính có trong thuốc.

Nếu hàm lƣợng vƣợt quá mức cho phép sẽ gây ra tình trạng nhờn thuốc, kháng thuốc và làm mất tác dụng của thuốc. Nếu hàm lƣợng hoạt chất chính bị thiếu so với quy định sẽ không đủ hiệu lực để có thể kháng lại các vi khuẩn gây bệnh và cũng làm giảm hoặc mất tác dụng của thuốc. Do đó, việc kiểm nghiệm hàm lƣợng các hoạt chất trong mẫu thuốc đóng vai trò rất quan trọng. Một số phƣơng pháp đƣợc dùng để phân tích riêng rẽ hoặc đồng thời các hoạt chất kháng sinh trong mẫu thuốc nhƣ: Phƣơng pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis), phƣơng pháp điện hóa, phƣơng pháp sắc ký (HPLC), phƣơng pháp điện di mao quản (CE).

Để giảm chi phí và tiết kiệm thời gian phân tích thì việc xây dựng các phƣơng pháp định lƣợng đồng thời nhiều kháng sinh nhóm β-lactam là rất cần thiết. Nhận thấy phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE- C4D) có tiềm năng trong việc kiểm nghiệm thuốc, nguyên liệu và bán thành phẩm thuốc, cũng nhƣ các hoạt chất kháng sinh trong thuốc. Do có nhiều ƣu điểm nhƣ thời gian phân tích nhanh, chính xác, xử lý mẫu đơn giản, thiết bị nhỏ gọn phù hợp để phân tích ngay tại hiện trƣờng. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu định lượng một số kháng sinh β-lactam bằng phương pháp diện di mao quản sử dụng detector (CE-C 4D)” đƣợc lựa chọn, với hi vọng sẽ góp một phần nhỏ vào việc xây dựng quy trình kiểm nghiệm các hoạt chất kháng sinh trong một số mẫu thuốc đang lƣu hành trên thị trƣờng hiện nay.

1 Ngoài ra, cũng hƣớng đến mục tiêu áp dụng một cách linh hoạt, hiệu quả quy trình phân tích này vào các phòng kiểm nghiệm và/ hoặc ở các nhà máy sản xuất đồng thời nhiều loại kháng sinh, gồm các thuốc đơn hoạt chất và thuốc kết hợp các hoạt chất khác nhau. 2 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về kháng sinh Kháng sinh từ khi ra đời đã trở thành một loại thuốc thiết yếu, một công cụ hỗ trợ cho sức khỏe con ngƣời, góp phần đẩy lùi nhiều loại bệnh tật và cứu sống hàng trăm triệu ngƣời trên khắp thế giới. Sự kiện Alexander Fleming phát hiện ra penicillin (1928) đƣợc đánh giá là một trong những thành tựu vĩ đại nhất trong lịch sử y học hiện đại và mở ra một kỉ nguyên mới trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn [22].

Waksman năm 1942 đã phát hiện ra streptomycin và đƣa ra định nghĩa: “Một chất kháng sinh hay một chất có tính kháng sinh là một chất do các vi sinh vật sản xuất ra, có khả năng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt các vi khuẩn khác”. Baron năm 1950 đã bổ sung nhƣ sau: “Kháng sinh là những chất đƣợc tạo ra bởi những cơ thể sống, có khả năng ức chế sự phát triển hay tồn tại của một hay nhiều chủng vi sinh vật ở nồng độ thấp”. Hiện nay quan niệm về kháng sinh đã mở rộng hơn: “Kháng sinh là các chất có nguồn gốc tự nhiên từ vi sinh vật, bán tổng hợp hoặc tổng hợp, ở liều điều trị có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật ở nồng độ thấp”. Kháng sinh đƣợc chia làm ba loại: Kháng sinh phổ rộng (có hoạt tính trên nhiều loại vi khuẩn khác nhau), kháng sinh phổ hẹp (có hoạt tính trên một số ít vi khuẩn), kháng sinh đặc hiệu (chỉ tác dụng trên một loại hoặc một nhóm vi khuẩn nhất định).

Chia theo nhóm gồm nhiều nhóm khác nhau nhƣ: β-lactam, Aminosid, Macrolid, Tetracyclin, Peptid … Trong số các nhóm chính đƣợc chia ra các phân nhóm nhỏ hơn nhƣ: β-lactam (penicillin, cephalosporin, carbapenem, monobactam), Peptid (glycopeptid, lipopeptid,…), … Trong đó nhóm quan trọng nhất là β-lactam. Tổng quan về các kháng sinh nhóm β-lactam Kháng sinh nhóm β-lactam là các kháng sinh mà phân tử chứa các dạng vòng β- lactam. Gồm các phân nhóm: Vòng có 5 cạnh bão hòa gồm các penicillin, vòng có 6 cạnh không bão hòa gồm các cephalosporin, vòng có 5 cạnh không bão hòa gồm các imipenem và ertapene, các monobactam không có vòng. Trong đó hai phân nhóm đƣợc sử dụng nhiều và phổ biến nhất là phân nhóm penicillin và cephalosporin.

+ Phân nhóm penicillin (penicillin G, procaine penicillin, benzathine penicillin, penicillin V), đƣợc Fleming tìm ra từ năm 1928 thu đƣợc từ nấm Penicillium hay đƣợc điều chế bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA). 3 + Phân nhóm cephalosporin đƣợc chiết xuất từ nấm Cephalosporium acremonium hoặc bán tổng hợp, đều là dẫn xuất của axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) có mang vòng β-lactam, tùy theo tác dụng kháng khuẩn chia thành 4 thế hệ [1,2,12]. Các kháng sinh này là các hoạt chất chính trong trong các mẫu dƣợc phẩm, có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn, nhờ đó mà ta điều trị và loại bỏ đƣợc nhiều dịch bệnh nguy hiểm do vi khuẩn gây ra, các hoạt chất chính này đƣợc công bố trên nhãn sản phẩm. Vì vậy, cần thiết phải định lƣợng các hoạt chất này nh m kiểm chứng chất lƣợng của sản phẩm kháng sinh, làm căn cứ cho việc điều trị.

Phân loại, cấu trúc của các kháng sinh nhóm β-lactam a) Các penicillin Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: Vòng β-lactam gắn kết với vòng thiazolidin và quyết định hoạt tính của kháng sinh, có 5 nhóm khác nhau. Sự kết hợp này làm cho vòng β-lactam hoạt động hơn so với từng vòng β-lactam riêng biệt. S R CO 4 CH 6 5 3 N 3 H 7 1 CH3 N 2 O COOM Hình 1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin Tên gọi chung của các penicillin khi chƣa có gốc R là: (2S,5R,6R3)3-dimethyl-7- oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay thế gốc R b ng các gốc khác nhau, thƣờng là các cation (K, Na, H), thì thu đƣợc các penicilin khác nhau có độ bền, dƣợc động học và phổ kháng khuẩn khác nhau [1,2].

Dựa vào nguần gốc có thể sắp xếp các penicillin thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau và đƣợc trình bày ở Bảng 1. Phân loại, cấu trúc một số penicillin Tên kháng sinh R Hoạt tính Gồm các Penicillin Nhóm penicillin tự CH2- nguồn gốc tự nhiên, nhiên (nhóm I) Penicillin G không kháng (PENG) Penicillinase. Phổ hẹp: Benzathin Vi khuẩn gram (+), đại Benzyl diện Penicillin G và Penicillin V CH3 Nhóm penicillin kháng penicilliiase (nhóm II) C- Oxacillin Gồm các Penicillin bán N O (OXA) tổng hợp. Phổ kháng 6-[(5-methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4- khuẩn hẹp hơn carbonyl)amino] Penicillin G, nhƣng có O khả năng kháng Cl N C- Penicilliiase, không tác động vào vòng Cloxacillin CH3 (CLO) β-lactam.

6-{[3-(2-chlorophenyl )-5-methyl- oxazole-4-carbonyl]amino} NH2 Gồm các Penicillin bán Nhóm penicillin phổ CH- rộng (nhóm III) tổng hợp phổ rộng, tác Ampicillin dụng cả khuẩn gram (+) (AMP) và (-) mà các Penicillin 6-([(2R)-2-amino-2- nhóm II ít tác dụng. phenylacetyl]amino) Không kháng 5 NH2 β-lactamase và CH- penicilliiase Amoxicillin HO (AMO) 6-{[(2R)-2-amino-2-(4-hydroxyphenyl)- acetyl]amino} b) Các cephalosporin Cephalosporin đƣợc Abraham và các cộng sự (1948) đã phân lập ra từ Cephalosporium acremonium, các Cephalosporin hiện nay đƣợc chia thành 4 thế hệ do sự thay đổi các nhóm thế khác nhau đã thu đƣợc các kháng sinh mới có hoạt tính tốt hơn. Tác dụng tốt trên các vi khuẩn gram (+) nhƣng tác dụng yếu trên vi khuẩn gram (-), đồng thời là nhóm kháng sinh đƣợc sử dụng nhiều nhất trên lâm sàng hiện nay và có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng 1 dị vòng 6 cạnh và vòng β-lactam 4 cạnh. R2 S R1 CO N 1 7 6 2 H 3 8N 5 4 R3 O COOM Hình 1.

Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin Tên gọi chung của các cephalosporin khi chƣa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5-thia- 1-azabicyclo[4.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Từ công thức ta thấy khi thay đổi các gốc R thì thu đƣợc các cephalosporin mới có đồ bền, dƣợc động học và tính kháng khuẩn khác nhau [1,2]. Tính chất, cơ chế, độc tính và phạm vi điều trị của các kháng sinh β-lactam a) Tính chất: Các kháng sinh β-lactam thƣờng kết tinh ở dạng bột màu trắng hoặc màu vàng (Cefixime), đa phần chứa đồng thời hai nhóm (–COOH) và (–NH 2), do đó dễ tan trong dung dịch axit và kiềm loãng, dạng axit ít tan trong nƣớc, ở dạng muối natri và kali dễ tan, tan đƣợc cả trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải. Các kháng sinh β-lactam nhóm axit (–COOH) có pK a= 2,5-2,8 tùy vào cấu trúc phân tử. Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác nhau làm cho dạng phổ thay đổi khác nhau.

6 b) Cơ chế: Các penicillin diệt khuẩn b ng cách can thiệp vào sự phát triển của vi khuẩn, làm cho quá trình tổng hợp peptidoglycan không đƣợc thực hiện. Khi vi khuẩn phân chia phát triển, chúng phải tạo ra màng tế bào nhờ một enzym xúc tác đặc biệt. Enzym này là một chuỗi amino axit và penicillin cắt đứt tiến trình hình thành, sinh tổng hợp vách tế bào bị ngừng lại. Do đó, penicillin đã tranh mất các vị trí phản ứng của tiền chất tạo enzym nên enzym sẽ không hình thành, có nghĩa là màng tế bào không đƣợc tái tạo, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt.