Đánh Giá Khả Năng Trung Hòa Độc Tố Nọc Rắn Hổ Mang (Naja Naja) Bằng Kháng Thể IgY

Luận văn phân tích khả năng trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang Naja naja bằng kháng thể lòng đỏ IgY, cung cấp thông tin hữu ích cho nghiên cứu.

• Tác giả: Nguyễn Văn Tâm
• Người hướng dẫn: TS. Lê Văn Phan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Đánh Giá Khả Năng Trung Hòa Độc Tố Nọc Rắn Hổ Mang Bằng Kháng Thể IgY
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
• 3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
• 4.1. Ý nghĩa khoa học
• 4.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 5. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 5.1. TÌNH HÌNH TAI NẠN DO RẮN ĐỘC CẮN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
• 5.1.1. Tình hình tai nạn do rắn độc cắn trên Thế giới
• 5.1.2. Tình hình tai nạn do rắn độc cắn ở Việt Nam
• 5.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI RẮN ĐỘC Ở VIỆT NAM
• 5.2.1. Các loài rắn độc ở Việt Nam
• 6. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 6.1. Địa điểm nghiên cứu
• 6.2. Thời gian nghiên cứu
• 6.3. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 6.3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 6.3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 6.4. Nội dung nghiên cứu
• 6.5. Phương pháp nghiên cứu
• 6.5.1. Phương pháp xác định liều gây chết 50% trên chuột (LD50)
• 6.5.2. Phương pháp gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn
• 6.5.3. Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà với kháng nguyên nọc rắn bằng phản ứng ELISA
• 6.5.4. Phương pháp xác định đặc tính và hàm lượng kháng thể lòng đỏ (IgY) kháng nọc rắn
• 6.5.5. Phương pháp đánh giá khả năng trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja) bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn
• 7. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 7.1. Kết quả xác định liều nọc rắn gây chết 50% trên chuột (LD50)
• 7.2. Kết quả đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn
• 7.3. Kết quả tách chiết kháng thể IgY
• 7.4. Kết quả định lượng hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn
• 7.5. Kết quả trung hòa độc tố nọc rắn bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn trên tế bào
• 7.6. Kết quả trung hòa độc tố nọc rắn bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn trên chuột
• 7.7. Đáp ứng miễn dịch của gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn hổ mang (Naja naja)
• 7.8. Đặc tính và hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn. Khả năng trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja) bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn
• 8. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Kháng Thể IgY Trung Hòa Nọc Rắn Hổ Mang

Rắn độc cắn là một vấn đề y tế nghiêm trọng, đặc biệt ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Theo WHO, mỗi năm có khoảng 3 triệu người bị rắn độc cắn. Tại Việt Nam, ước tính có khoảng 30 nghìn ca nhập viện mỗi năm do rắn cắn, chủ yếu do rắn hổ và rắn lục. Biện pháp điều trị hiệu quả nhất hiện nay là sử dụng huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR). Tuy nhiên, HTKNR truyền thống có thể gây ra các tác dụng phụ như dị ứng và bệnh huyết thanh. Kháng thể IgY từ trứng gà là một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn, với quy trình sản xuất đơn giản hơn và ít tác dụng phụ hơn. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá khả năng trung hòa độc tố của kháng thể IgY đối với nọc rắn hổ mang (Naja naja).

1.1. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu IgY kháng nọc rắn

Nghiên cứu về kháng thể IgY kháng nọc rắn có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm kiếm các phương pháp điều trị an toàn và hiệu quả hơn cho các nạn nhân bị rắn độc cắn. HTKNR truyền thống, thường được sản xuất từ huyết thanh ngựa, có thể gây ra các phản ứng dị ứng và các tác dụng phụ khác. IgY kháng nọc rắn hứa hẹn sẽ giảm thiểu các tác dụng phụ này, đồng thời đơn giản hóa quy trình sản xuất và giảm chi phí. Theo Thalley và Carroll (1990), kháng thể thu từ trứng của loài gia cầm gây miễn dịch với nọc độc rắn có khả năng chống lại nọc độc rắn.

1.2. Giới thiệu về rắn hổ mang Naja naja và độc tính

Rắn hổ mang (Naja naja) là một loài rắn độc nguy hiểm, phân bố rộng rãi ở Việt Nam và các nước châu Á khác. Nọc độc của rắn hổ mang chứa các độc tố thần kinh mạnh, có thể gây tê liệt, suy hô hấp và tử vong. Theo nghiên cứu, chất độc thần kinh có trong nọc rắn ngăn chặn hoạt động của hệ thống thần kinh và hệ thống thần kinh - cơ trong vòng 15 phút đến hai giờ, gây ra tình trạng buồn ngủ, tê liệt, mất ý thức, khó thở, tim ngừng đập dẫn đến chết. Việc nghiên cứu khả năng trung hòa độc tố của kháng thể IgY đối với nọc rắn hổ mang là rất cần thiết để phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

II. Thách Thức Trong Điều Trị Nọc Rắn Giải Pháp IgY

Điều trị rắn độc cắn gặp nhiều thách thức, bao gồm sự khan hiếm và giá thành cao của huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR), tác dụng phụ tiềm ẩn của HTKNR truyền thống, và sự khác biệt về độc tính nọc rắn giữa các loài và khu vực địa lý. HTKNR thường có tính chất đơn giá, nghĩa là chỉ hiệu quả đối với một loài rắn cụ thể. Kháng thể IgY nổi lên như một giải pháp tiềm năng, với khả năng sản xuất hàng loạt, chi phí thấp hơn và ít tác dụng phụ hơn so với HTKNR truyền thống. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá hiệu quả IgY trong việc trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang.

2.1. Hạn chế của huyết thanh kháng nọc rắn HTKNR truyền thống

HTKNR truyền thống, được sản xuất từ huyết thanh động vật (thường là ngựa), có một số hạn chế. Chúng có thể gây ra các phản ứng dị ứng, bệnh huyết thanh và các tác dụng phụ khác. Ngoài ra, quy trình sản xuất HTKNR đòi hỏi công nghệ cao và chi phí lớn. Theo Gold, Dart et al., HTKNR được sản xuất từ nguồn động vật khác khi được tiêm cho người bị rắn độc cắn có thể có các tác dụng phụ như gây di ứng, suy thận, bệnh huyết thanh ở người nhận. Điều này làm hạn chế khả năng tiếp cận điều trị của các nạn nhân, đặc biệt ở các vùng nông thôn nghèo.

2.2. Ưu điểm của kháng thể IgY so với HTKNR truyền thống

Kháng thể IgY có nhiều ưu điểm so với HTKNR truyền thống. Chúng có thể được sản xuất hàng loạt từ trứng gà, với chi phí thấp hơn và quy trình đơn giản hơn. IgY cũng ít gây ra các phản ứng dị ứng và tác dụng phụ hơn so với HTKNR từ huyết thanh động vật. Theo Warr, Magor et al. (1995), kháng thể lòng đỏ có trong trứng của một số loài chim, gia cầm, bò sát, lưỡng cư là một nguồn sản xuất kháng thể đa giá trong hơn một thập kỷ và có nhiều ứng dụng trong thực tiễn.

III. Phương Pháp Đánh Giá Khả Năng Trung Hòa Độc Tố Bằng IgY

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp in vitro và in vivo để đánh giá khả năng trung hòa độc tố của kháng thể IgY đối với nọc rắn hổ mang. Các phương pháp bao gồm xác định liều gây chết LD50 trên chuột, đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà mái bằng ELISA, và thử nghiệm trung hòa độc tố trên tế bào và trên chuột. Kết quả từ các thử nghiệm này sẽ cung cấp bằng chứng về hiệu quả của IgY trong việc trung hòa độc tố nọc rắn.

3.1. Xác định liều gây chết LD50 của nọc rắn hổ mang

Việc xác định liều gây chết LD50 (Lethal Dose 50) là bước quan trọng để đánh giá độc tính của nọc rắn hổ mang. LD50 là liều lượng nọc rắn cần thiết để giết chết 50% số lượng chuột thí nghiệm. Giá trị LD50 được sử dụng để chuẩn hóa các thử nghiệm trung hòa độc tố và so sánh độc tính của nọc rắn từ các nguồn khác nhau. Theo tài liệu, phương pháp xác định liều gây chết 50% trên chuột (LD50) được sử dụng trong nghiên cứu.

3.2. Đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà mái bằng ELISA

Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) được sử dụng để đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà mái sau khi tiêm nọc rắn. ELISA cho phép định lượng kháng thể IgY đặc hiệu với nọc rắn trong huyết thanh gà và lòng đỏ trứng. Kết quả ELISA cung cấp thông tin về mức độ đáp ứng miễn dịch của gà và hiệu quả của quá trình gây miễn dịch. Theo tài liệu, phương pháp ELISA được sử dụng để đánh giá hàm lượng kháng thể kháng nọc rắn có trong huyết thanh gà và kháng thể thụ động từ gà mẹ truyền sang trứng.

3.3. Thử nghiệm trung hòa độc tố nọc rắn trên tế bào và chuột

Các thử nghiệm trung hòa độc tố được thực hiện trên môi trường tế bào (in vitro) và trên chuột (in vivo) để đánh giá khả năng của IgY trong việc trung hòa độc tố nọc rắn. Trong thử nghiệm in vitro, tế bào được nuôi cấy và tiếp xúc với nọc rắn có hoặc không có IgY. Tỷ lệ tế bào sống sót được sử dụng để đánh giá hiệu quả trung hòa độc tố của IgY. Trong thử nghiệm in vivo, chuột được tiêm nọc rắn có hoặc không có IgY, và tỷ lệ sống sót của chuột được theo dõi. Theo tài liệu, các phản ứng trung hòa độc tố nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) được thực hiện trên môi trường tế bào và trên chuột thí nghiệm.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Hiệu Quả Trung Hòa Độc Tố Của IgY

Nghiên cứu đã chứng minh rằng kháng thể IgY thu được từ trứng gà được gây miễn dịch với nọc rắn hổ mang có khả năng trung hòa độc tố của nọc rắn. Kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy IgY có thể bảo vệ tế bào khỏi tác động gây độc của nọc rắn. Kết quả thử nghiệm in vivo cho thấy IgY có thể cải thiện tỷ lệ sống sót của chuột được tiêm nọc rắn. Những kết quả này khẳng định tiềm năng của IgY như một phương pháp điều trị thay thế cho HTKNR truyền thống.

4.1. Khả năng bảo vệ tế bào khỏi độc tính nọc rắn in vitro

Kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy kháng thể IgY có khả năng bảo vệ tế bào khỏi tác động gây độc của nọc rắn hổ mang. Khi tế bào được nuôi cấy với nọc rắn và IgY, tỷ lệ tế bào sống sót cao hơn đáng kể so với khi tế bào chỉ được nuôi cấy với nọc rắn. Điều này chứng tỏ rằng IgY có thể trung hòa độc tố của nọc rắn và ngăn chặn tác động gây hại của nó lên tế bào. Theo tài liệu, kết quả đánh giá khả năng trung hòa nọc rắn của kháng thể IgY trong lòng đỏ trứng gà cũng được tiến hành trên chuột Swiss và trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero, cho thấy kháng thể IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà của gà được gây miễn dịch với kháng nguyên là nọc rắn có khả năng trung hòa độc tố của nọc độc rắn (2LD50) trên chuột Swiss cũng như có khả năng trung hòa 5µg nọc rắn bổ sung vào môi trường nuôi cấy của 104 tế bào Vero.

4.2. Cải thiện tỷ lệ sống sót của chuột thí nghiệm in vivo

Kết quả thử nghiệm in vivo cho thấy kháng thể IgY có thể cải thiện tỷ lệ sống sót của chuột được tiêm nọc rắn hổ mang. Khi chuột được tiêm nọc rắn và IgY, tỷ lệ sống sót cao hơn so với khi chuột chỉ được tiêm nọc rắn. Điều này chứng tỏ rằng IgY có thể trung hòa độc tố của nọc rắn trong cơ thể chuột và bảo vệ chúng khỏi tử vong. Theo tài liệu, kết quả đánh giá khả năng trung hòa nọc rắn của kháng thể IgY trong lòng đỏ trứng gà cũng được tiến hành trên chuột Swiss và trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero, cho thấy kháng thể IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà của gà được gây miễn dịch với kháng nguyên là nọc rắn có khả năng trung hòa độc tố của nọc độc rắn (2LD50) trên chuột Swiss cũng như có khả năng trung hòa 5µg nọc rắn bổ sung vào môi trường nuôi cấy của 104 tế bào Vero.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Triển Vọng Của Kháng Thể IgY

Nghiên cứu này mở ra triển vọng ứng dụng kháng thể IgY trong điều trị rắn độc cắn, đặc biệt ở các vùng nông thôn nghèo, nơi HTKNR truyền thống khó tiếp cận. IgY có thể được sử dụng như một phương pháp điều trị thay thế hoặc bổ sung cho HTKNR truyền thống. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của IgY và tối ưu hóa quy trình sản xuất có thể giúp nâng cao hiệu quả và giảm chi phí điều trị.

5.1. Tiềm năng ứng dụng IgY trong y học và thú y

Kháng thể IgY có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong y học và thú y, không chỉ trong điều trị rắn độc cắn mà còn trong phòng ngừa và điều trị các bệnh nhiễm trùng khác. IgY có thể được sử dụng để tạo ra các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng có khả năng tăng cường hệ miễn dịch và bảo vệ cơ thể khỏi bệnh tật. Theo tài liệu, kháng thể lòng đỏ có trong trứng của một số loài chim, gia cầm, bò sát, lưỡng cư là một nguồn sản xuất kháng thể đa giá trong hơn một thập kỷ và có nhiều ứng dụng trong thực tiễn.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo để tối ưu hóa sản xuất IgY

Để tối ưu hóa sản xuất kháng thể IgY, cần có các nghiên cứu tiếp theo về các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của gà mái, quy trình chiết xuất và tinh chế IgY, và phương pháp bảo quản IgY. Nghiên cứu về cơ chế tác động của IgY trong việc trung hòa độc tố nọc rắn cũng rất quan trọng để phát triển các sản phẩm IgY có hiệu quả cao hơn. Theo tài liệu, cần có các nghiên cứu tiếp theo trong quá trình nghiên cứu và sản xuất kháng thể IgY kháng nọc độc rắn hổ mang (Naja naja).

VI. Kết Luận IgY Giải Pháp Tiềm Năng Cho Nọc Rắn Hổ Mang

Nghiên cứu này đã chứng minh khả năng trung hòa độc tố của kháng thể IgY đối với nọc rắn hổ mang. IgY có tiềm năng trở thành một phương pháp điều trị thay thế an toàn và hiệu quả hơn cho HTKNR truyền thống. Cần có thêm các nghiên cứu để tối ưu hóa sản xuất và ứng dụng IgY trong điều trị rắn độc cắn và các bệnh lý khác.

6.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu và ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đã thành công trong việc đánh giá khả năng trung hòa độc tố của kháng thể IgY đối với nọc rắn hổ mang. Kết quả cho thấy IgY có khả năng bảo vệ tế bào và cải thiện tỷ lệ sống sót của chuột thí nghiệm. Nghiên cứu này góp phần chứng minh tiềm năng của IgY như một phương pháp điều trị thay thế cho HTKNR truyền thống và mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực điều trị rắn độc cắn. Theo tài liệu, đề tài được thực hiện sẽ góp phần chứng minh khả năng trung hòa độc tố của kháng thể IgY với nọc độc rắn hổ mang (Naja naja).

6.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu và ứng dụng trong tương lai

Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất IgY, đánh giá hiệu quả của IgY trên các loài rắn độc khác, và thử nghiệm lâm sàng IgY trên người bị rắn độc cắn. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu về cơ chế tác động của IgY và phát triển các phương pháp bảo quản IgY hiệu quả hơn. Theo tài liệu, cần có các nghiên cứu tiếp theo trong quá trình nghiên cứu và sản xuất kháng thể IgY kháng nọc độc rắn hổ mang (Naja naja).

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Tai nạn do rắn độc cắn là một vấn đề y tế công cộng nghiêm trọng tại các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm toàn cầu ghi nhận khoảng 3 triệu trường hợp bị rắn độc cắn, cướp đi sinh mạng của khoảng 50.000 đến 60.000 nạn nhân. Tại Việt Nam, ước tính có khoảng 30.000 bệnh nhân bị rắn cắn phải nhập viện điều trị mỗi năm với khoảng 200 đến 300 ca tử vong. Trong đó, rắn hổ mang (Naja naja) phân bố rộng rãi tại các tỉnh miền núi phía Bắc là loài rắn nguy hiểm hàng đầu với độc tính nọc cực cao. Độc tố thần kinh có trong nọc rắn hổ mang làm tê liệt hệ thần kinh - cơ chỉ trong khoảng 15 phút đến 2 giờ, gây khó thở, ngừng tim và tử vong nhanh chóng. Thống kê tại Trung tâm Chống độc Bệnh viện Bạch Mai cho thấy rắn cắn đứng hàng thứ 5 trong các trường hợp ngộ độc cấp cứu, với 13% đến 14% bệnh nhân sống sót phải chịu di chứng cắt cụt chi hoặc một phần chi, chi phí hồi sức vô cùng tốn kém khi có ca bệnh phải truyền tới 46 lít máu và chế phẩm để duy trì sự sống.

Biện pháp điều trị đặc hiệu duy nhất hiện nay là sử dụng huyết thanh kháng nọc rắn có bản chất là kháng thể IgG tinh chế từ máu ngựa hoặc cừu. Tuy nhiên, nguồn kháng thể này tiềm ẩn nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng như dị ứng, suy thận, sốc phản vệ và bệnh huyết thanh do phản ứng thải trừ protein ngoại lai, đồng thời quy trình tinh sạch phức tạp đẩy giá thành lên rất cao. Nhằm tìm kiếm giải pháp thay thế an toàn và kinh tế, đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học của tác giả Nguyễn Văn Tâm tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam (thực hiện từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2017) đã tập trung đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của gà mái với kháng nguyên nọc rắn hổ mang (Naja naja) và xác định hiệu lực trung hòa độc tố của kháng thể lòng đỏ trứng (IgY). Nghiên cứu này tạo tiền đề vững chắc cho việc sản xuất sinh phẩm kháng nọc rắn quy mô lớn, an toàn sinh học và giảm thiểu gánh nặng chi phí y tế cho cộng đồng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng thuyết miễn dịch học dịch thể gia cầm, cơ chế truyền kháng thể thụ động từ mẹ sang phôi qua lòng đỏ trứng và cơ chế sinh bệnh học của độc tố thần kinh nọc rắn. Kháng thể lòng đỏ (IgY) là globulin miễn dịch chính ở gia cầm, có cấu trúc gồm 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ với tổng khối lượng phân tử khoảng 180 kDa, lớn hơn so với kháng thể IgG ở động vật có vú (khoảng 160 kDa). Điểm khác biệt mấu chốt là chuỗi nặng của IgY không có vùng bản lề linh hoạt, giúp phân tử này không kích hoạt hệ thống bổ thể của người, không gắn với thụ thể Fc của đại thực bào động vật có vú và không phản ứng chéo với yếu tố dạng thấp. Những đặc tính này giúp IgY triệt tiêu nguy cơ gây sốc phản vệ hay bệnh huyết thanh khi ứng dụng điều trị trên người. Về mặt năng suất sinh học, một con gà mái có thể sản sinh khoảng 80 đến 100 mg IgY trong mỗi quả trứng thu hoạch hằng ngày, đạt tổng sản lượng khoảng 22.500 mg kháng thể mỗi năm, vượt trội hoàn toàn so với mức 5.200 mg IgG mỗi năm thu được từ việc lấy máu định kỳ 2 tuần một lần trên ngựa (khoảng 200 mg/40 ml máu). Độc tố nọc rắn hổ mang chủ yếu là các neurotoxin tác động phong bế thụ thể acetylcholine tại màng sau xi-náp thần kinh - cơ; sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể IgY và các epitope độc tố sẽ vô hiệu hóa khả năng bám dính của nọc độc lên tế bào đích.

Phương pháp nghiên cứu

Về nguồn dữ liệu và đối tượng thực nghiệm, nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 10 con gà mái hậu bị giai đoạn 16 đến 18 tuần tuổi có trọng lượng đồng đều khoảng 1,8 kg để gây miễn dịch, đàn chuột Swiss khỏe mạnh có trọng lượng 18 đến 20 g chia thành các lô thí nghiệm (5 con mỗi lô) và dòng tế bào thận khỉ Vero với mật độ nuôi cấy chuẩn 10^4 tế bào/giếng trên đĩa 96 giếng. Phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên đồng nhất về thể trạng và độ tuổi được áp dụng nghiêm ngặt nhằm loại trừ các sai số sinh học ngoại cảnh.

Lý do lựa chọn các phương pháp phân tích chuyên sâu gồm:

• Phương pháp Reed và Muench (1938) được ứng dụng trên chuột Swiss để xác định chính xác liều gây chết 50% (LD50), làm cơ sở chuẩn hóa liều kháng nguyên tiêm cho gà và liều thử thách trung hòa độc lực.
• Quy trình gây miễn dịch đa mũi gồm 4 lần tiêm dưới da vùng cơ delta (mũi 1 sử dụng tá dược hoàn toàn Freund - FCA, 3 mũi nhắc lại sử dụng tá dược không hoàn toàn Freund - FIA cách nhau 14 ngày) nhằm kích thích tối đa đáp ứng miễn dịch dịch thể nguyên phát và thứ phát.
• Phương pháp tách chiết kết tủa phân đoạn bằng nước kết hợp ammonium sulfate 29% theo Akita và Nakai (1992) giúp thu hồi IgY với hiệu suất cao mà không làm biến tính protein.
• Điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12,5% để kiểm tra độ tinh sạch và xác định kích thước các chuỗi polypeptide phân tử IgY.
• Phản ứng ELISA gián tiếp được tối ưu hóa ở tỷ lệ pha loãng huyết thanh 1/12.800 để triệt tiêu hiện tượng dương tính giả từ nền protein.
• Phương pháp nhuộm Neutral Red đo quang phổ ở bước sóng 540 nm (OD540) để xác định nồng độ nọc rắn gây chết 50% tế bào Vero (CT50) và đánh giá khả năng bảo vệ tế bào in vitro, kết hợp thử nghiệm bảo hộ in vivo trên chuột Swiss trước liều độc 2xLD50.

Timeline thực nghiệm diễn ra liên tục trong 6 tháng tại phòng R&D Lab thuộc Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam và Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận các kết quả định lượng cụ thể qua từng giai đoạn thực nghiệm:

• Độc tính nọc rắn hổ mang Naja naja: Thử nghiệm trên chuột Swiss đã xác định giá trị LD50 của nọc rắn đạt 1,46 µg/g thể trọng chuột.
• Đáp ứng miễn dịch của gà mái: Sau mũi tiêm đầu tiên, 8/10 con gà có biểu hiện co giật và 10/10 con mỏi mệt bỏ ăn do độc tố thần kinh, nhưng các triệu chứng đã thuyên giảm nhanh sau 4 ngày. Sau mũi tiêm thứ 4, toàn bộ 10/10 con gà đều hoàn toàn khỏe mạnh, không xuất hiện triệu chứng bất thường, chứng minh gà đã thiết lập miễn dịch vững chắc. Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh gà tăng vọt sau các mũi tiêm nhắc lại, đạt giá trị quang học cao nhất vào ngày 49 đến ngày 56 và duy trì mức OD405 > 0,4 kéo dài đến ngày 111.
• Động thái tích lũy và đặc tính hóa sinh của IgY lòng đỏ: Kháng thể IgY tách chiết hiển thị rõ 3 băng điện di SDS-PAGE đặc trưng gồm chuỗi nhẹ khoảng 18 kDa, chuỗi nặng khoảng 65 kDa và mảnh Fab khoảng 45 kDa. Hàm lượng IgY kháng nọc rắn trong trứng xuất hiện từ ngày 35 (OD405 = 0,671), đạt đỉnh cực đại vào ngày 56 với OD405 = 1,379 (tăng hơn 105% so với ngày 35) và duy trì ổn định ở mức OD405 > 1,0 liên tục đến ngày 91, trước khi giảm nhẹ về OD405 = 0,978 tại ngày 111.
• Khả năng trung hòa độc tố in vitro và in vivo: Trên môi trường tế bào Vero (10^4 tế bào), liều nọc rắn 5 µg gây chết 54% tế bào (được xác định là giá trị CT50), trong khi các liều 8 đến 10 µg gây chết 97% đến 98% tế bào. Kháng thể IgY thu ở ngày 56 đã trung hòa hoàn toàn 5 µg nọc rắn, giúp phục hồi tỷ lệ sống của tế bào Vero tương đương lô đối chứng âm. Trên mô hình in vivo, kháng thể IgY đã bảo hộ sống sót 100% chuột Swiss trước liều tiêm thử thách gấp 2 lần liều gây chết (2xLD50).

Thảo luận kết quả

Cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch vượt trội ở gà mái bắt nguồn từ sự kích hoạt mạnh mẽ của các tế bào lympho B tại túi Fabricius khi tiếp xúc với kháng nguyên nọc rắn kết hợp tá dược Freund. Quá trình chọn lọc và vận chuyển tích cực phân tử IgY qua màng nang noãn vào lòng đỏ trứng diễn ra liên tục, tạo ra nguồn kháng thể thụ động dồi dào có ái lực gắn kết cao với các độc tố neurotoxin. Khi kháng thể IgY liên kết đặc hiệu với các phân tử độc tố, chúng ngăn chặn hoàn toàn vị trí gắn của nọc độc lên thụ thể nicotinic acetylcholine tại màng sau xi-náp, bảo vệ cấu trúc tế bào và ngăn chặn tình trạng liệt cơ hô hấp.

So sánh với các công bố quốc tế của Thalley và Carroll (1990) hay Almeida và cộng sự (1998, 2008), kết quả của luận văn khẳng định gà mái nuôi dưỡng tại điều kiện khí hậu Việt Nam hoàn toàn có khả năng tạo ra kháng thể IgY kháng nọc rắn hổ mang với hiệu giá cao và thời gian duy trì kéo dài trên 90 ngày. Về mặt trình bày dữ liệu khoa học, các kết quả này có thể được mô hình hóa trực quan thông qua:

• Đồ thị đường thể hiện động thái tăng trưởng và suy giảm hiệu giá kháng thể (OD405) trong huyết thanh và lòng đỏ trứng theo trục thời gian từ ngày 0 đến ngày 111.
• Biểu đồ cột so sánh tỷ lệ sống sót của tế bào Vero qua giá trị OD540 giữa các nồng độ nọc rắn từ 1 µg đến 10 µg và hiệu quả phục hồi tế bào sau khi bổ sung kháng thể IgY trung hòa.
• Bảng đối sánh các chỉ số hóa sinh và sinh học giữa IgG ngựa và IgY gà (khối lượng phân tử, sản lượng năm, phản ứng bổ thể).

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển hóa các kết quả nghiên cứu thành sản phẩm sinh phẩm y tế ứng dụng thực tế, các giải pháp cụ thể được đề xuất như sau:

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình chăn nuôi an toàn sinh học và phác đồ gây miễn dịch cho đàn gà mái hậu bị 16 đến 18 tuần tuổi. Đơn vị thực hiện là các Trung tâm Giống gia cầm phối hợp cùng Viện Kiểm nghiệm Vắc-xin và Sinh phẩm Y tế, tiến hành tiêm 4 mũi kháng nguyên kết hợp tá dược theo chu kỳ 14 ngày để thiết lập chu kỳ khai thác trứng đạt hàm lượng IgY đỉnh cao (từ ngày 56 đến ngày 91), hoàn thành bộ quy chuẩn kỹ thuật trong vòng 6 đến 12 tháng.

Thứ hai, thiết kế và tối ưu hóa dây chuyền tinh sạch kháng thể IgY quy mô pilot bán công nghiệp bằng công nghệ vi lọc màng tiếp tuyến (TFF) kết hợp kết tủa phân đoạn ammonium sulfate 29%. Chủ thể thực hiện là các doanh nghiệp dược phẩm sinh học và phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học trong lộ trình 12 đến 18 tháng, hướng tới mục tiêu nâng độ tinh sạch kháng thể đạt trên 95%, đồng thời giảm 30% đến 40% chi phí sản xuất so với công nghệ tách chiết huyết thanh ngựa truyền thống.

Thứ ba, triển khai các thử nghiệm tiền lâm sàng mở rộng trên các mô hình động vật linh trưởng và động vật có vú lớn nhằm đánh giá toàn diện dược động học, độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của chế phẩm IgY trước khi tiến hành thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 trên người. Đề xuất Bộ Y tế cấp kinh phí nghiên cứu và giao Trung tâm Chống độc Bệnh viện Bạch Mai phối hợp Bệnh viện Chợ Rẫy thực hiện trong thời gian 18 đến 24 tháng.

Thứ tư, mở rộng nghiên cứu phát triển chế phẩm kháng thể IgY đa giá có khả năng trung hòa đồng thời nhiều loài rắn độc nguy hiểm tại Việt Nam như rắn hổ chúa, rắn cạp nia, rắn cạp nong và rắn lục đuôi đỏ. Mục tiêu xây dựng ngân hàng kháng thể quốc gia sẵn sàng ứng phó với mọi tai nạn rắn cắn, do liên bộ Y tế - Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn chủ trì trong giai đoạn 2 đến 3 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu tham khảo giá trị cho 4 nhóm đối tượng chính:

Nhóm 1 - Các nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Thú y và Miễn dịch học: Luận văn cung cấp toàn bộ cơ sở lý thuyết về miễn dịch học gia cầm, phác đồ gây miễn dịch nọc độc không gây chết và kỹ thuật tinh sạch IgY lòng đỏ trứng bằng phương pháp hóa lý không xâm lấn, phục vụ giảng dạy và phát triển các đề tài nghiên cứu chuyên sâu.

Nhóm 2 - Đội ngũ bác sĩ lâm sàng, dược sĩ và chuyên gia Hồi sức cấp cứu - Chống độc: Cung cấp góc nhìn thực nghiệm về cơ chế trung hòa độc tố thần kinh, hiểu rõ bản chất an toàn sinh học của kháng thể IgY (không hoạt hóa bổ thể người) để ứng dụng đánh giá và phát triển các phác đồ điều trị thay thế huyết thanh ngựa, nhằm triệt tiêu biến chứng sốc phản vệ tại các trung tâm cấp cứu.

Nhóm 3 - Doanh nghiệp dược phẩm, viện sản xuất vắc-xin và sinh phẩm y tế: Bản luận văn là tài liệu phân tích tính khả thi kỹ thuật và hiệu quả kinh tế rõ nét, chứng minh sản lượng vượt trội 22.500 mg kháng thể/năm từ trứng gà giúp hạ giá thành sản phẩm, mở ra cơ hội đầu tư thương mại hóa các dòng huyết thanh kháng nọc rắn thế hệ mới.

Nhóm 4 - Học viên cao học và sinh viên đại học ngành Khoa học Sự sống: Tài liệu mang lại case study mẫu mực về thiết kế thí nghiệm sinh học, từ khâu tính toán LD50 theo Reed - Muench, chuẩn hóa phản ứng ELISA gián tiếp, điện di protein SDS-PAGE đến kỹ thuật nuôi cấy tế bào Vero đánh giá độc lực bằng thuốc nhuộm Neutral Red.

Câu hỏi thường gặp

Kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà có ưu điểm vượt trội nào so với kháng thể IgG từ ngựa? Kháng thể IgY có trọng lượng phân tử 180 kDa và không có vùng bản lề linh hoạt như IgG ngựa (160 kDa). Cấu trúc này giúp IgY hoàn toàn không hoạt hóa hệ thống bổ thể ở người, không bám thụ thể Fc của đại thực bào động vật có vú và không gây phản ứng miễn dịch dị ứng, giúp loại bỏ nguy cơ sốc phản vệ và bệnh huyết thanh nguy hiểm.

Giá trị LD50 của nọc rắn hổ mang Naja naja trong nghiên cứu được xác định là bao nhiêu? Thông qua phương pháp tính toán của Reed và Muench trên các lô chuột Swiss khỏe mạnh có trọng lượng 18 đến 20 g, giá trị liều gây chết 50% (LD50) của nọc rắn hổ mang Naja naja thu thập tại Việt Nam được xác định chính xác là 1,46 µg/g thể trọng. Đây là thông số cơ sở để tính liều gây miễn dịch an toàn cho gà và liều thử thách trung hòa.

Thời điểm nào thu hoạch trứng gà cho hàm lượng kháng thể IgY cao nhất? Phân tích ELISA định lượng cho thấy kháng thể IgY đặc hiệu xuất hiện trong trứng từ ngày thứ 35 (OD405 = 0,671), tăng vọt và đạt đỉnh cao nhất vào ngày 56 sau lần gây miễn dịch đầu tiên với OD405 = 1,379. Hàm lượng kháng thể duy trì ở mức cao ổn định (OD405 > 1,0) liên tục từ ngày 56 đến ngày 91, là khung thời gian vàng để thu gom trứng sản xuất.

Năng suất sản xuất kháng thể của gà mái so với ngựa chênh lệch như thế nào? Một con gà mái đẻ trứng có thể cung cấp từ 80 đến 100 mg kháng thể IgY trong mỗi quả trứng thu hoạch hằng ngày, đạt tổng sản lượng khoảng 22.500 mg kháng thể mỗi năm mà không gây đau đớn cho gia cầm. Trong khi đó, ngựa chỉ cho khoảng 200 mg IgG trên 40 ml máu rút định kỳ 2 tuần một lần, đạt tổng sản lượng khoảng 5.200 mg/năm và đòi hỏi quy trình chăm sóc phức tạp.

Kháng thể IgY đã chứng minh hiệu lực trung hòa nọc rắn trong điều kiện thực nghiệm ra sao? Trên môi trường in vitro, kháng thể IgY thu ở ngày 56 đã trung hòa hoàn toàn 5 µg nọc rắn (mức CT50 làm chết 54% tế bào) bổ sung vào 10^4 tế bào thận khỉ Vero, bảo vệ tế bào sống khỏe mạnh. Trên môi trường in vivo, kháng thể IgY đã trung hòa thành công liều độc thử thách 2xLD50, bảo vệ sống sót 100% chuột Swiss thí nghiệm sau 24 giờ theo dõi.

Kết luận

• Xác định chính xác độc tính nọc rắn hổ mang Naja naja tại Việt Nam với giá trị LD50 đạt 1,46 µg/g thể trọng chuột Swiss.
• Xây dựng thành công quy trình gây miễn dịch an toàn 4 mũi trên gà mái hậu bị 16 đến 18 tuần tuổi, kích hoạt kháng thể huyết thanh đạt đỉnh vào ngày 49 đến 56.
• Tách chiết thành công kháng thể IgY phân tử lượng 180 kDa từ lòng đỏ trứng, đạt nồng độ đỉnh cao nhất vào ngày 56 (OD405 = 1,379) và duy trì hiệu giá cao ổn định đến ngày 91.
• Chứng minh khả năng trung hòa in vitro hoàn toàn 5 µg nọc rắn trên 10^4 tế bào Vero bằng phương pháp nhuộm Neutral Red.
• Bảo vệ an toàn 100% chuột thí nghiệm in vivo trước liều độc thử thách gấp 2 lần liều gây chết (2xLD50).

Đóng góp lớn nhất của luận văn là chứng minh tính khả thi khoa học và hiệu quả thực tiễn của việc sử dụng công nghệ kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) để thay thế huyết thanh ngựa truyền thống trong điều trị rắn hổ mang cắn tại Việt Nam. Đây là giải pháp nhân đạo, chi phí thấp, năng suất cao và an toàn sinh học vượt trội. Trong lộ trình 2024 - 2026, việc đẩy mạnh hợp tác giữa các viện nghiên cứu, bệnh viện chống độc và doanh nghiệp sinh dược phẩm là bước đi then chốt nhằm sớm đưa chế phẩm IgY vào sản xuất quy mô công nghiệp, kịp thời cứu sống hàng ngàn nạn nhân tai nạn rắn cắn mỗi năm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN TÂM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TRUNG HÒA ĐỘC TỐ NỌC ĐỘC RẮN HỔ MANG (NAJA NAJA) BẰNG KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ (IGY) KHÁNG NỌC RẮN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Văn Phan TS. Nguyễn Hữu Đức NHÀ XUÂT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 1. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Văn Tâm i 2. LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của quý thầy cô, các anh chị và các bạn. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới các thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học, các thầy cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã chia sẻ tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.

Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS. Lê Văn Phan, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và thầy TS. Nguyễn Hữu Đức, Bộ mộn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, luôn giúp đỡ hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo cùng toàn thể các anh chị, các bạn trong Công ty TNHH Một Thành Viên AVAC Việt Nam, đặc biệt là các anh chị tại phòng R&D Lab nơi tôi công tác đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các bạn trong tập thể lớp CH24 CNSHC, những người luôn động viên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành tốt luận văn này. Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Văn Tâm ii 3. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. II MỤC LỤC.

III DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT. VI DANH MỤC BẢNG. VII DANH MỤC HÌNH. VIII TRÍCH YẾU LUẬN VĂN.

IX THESIS ABSTRACT. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu đề tài. Phạm vi nghiên cứu.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

Tình hình tai nạn do rắn độc cắn trên thế giới và việt nam. Tình hình tai nạn do rắn độc cắn trên Thế giới. Tình hình tai nạn do rắn độc cắn ở Việt Nam. Tổng quan về các loài rắn độc ở việt nam.

Các loài rắn độc ở Việt Nam. Độc tố nọc rắn độc. Các triệu chứng lâm sàng khi rắn độc độc cắn. Phương pháp sơ cứu và điều trị khi rắn độc cắn.

Tống quan về huyết thanh kháng nọc rắn (htknr). Cơ sở miễn dịch học. Kháng thể kháng nọc rắn. Kháng thể lòng đỏ (IgY) kháng nọc rắn.

Tình hình nghiên cứu HTKNR trên Thế giới và Việt Nam. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu.

Đối tượng và vật liệu nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp xác định liều gây chết 50% trên chuột (LD50). Phương pháp gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn. Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà với kháng nguyên nọc rắn bằng phản ứng ELISA.

Phương pháp xác định đặc tính và hàm lượng kháng thể lòng đỏ (IgY) kháng nọc rắn. Phương pháp đánh giá khả năng trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja) bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Kết quả xác định liều nọc rắn gây chết 50% trên chuột (LD50).

Kết quả đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn. Kết quả tách chiết kháng thể IgY. Kết quả định lượng hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn. Kết quả trung hòa độc tố nọc rắn bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn trên tế bào.

Kết quả trung hòa độc tố nọc rắn bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn trên chuột. Đáp ứng miễn dịch của gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn hổ mang (Naja naja). Đặc tính và hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn. Khả năng trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja) bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 48 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO. DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt HTKNR Huyết thanh kháng nọc rắn LD50 Lethal Dose 50 FCA Freund’s complete adjuvant FIA Freund’s incomplete adjuvant PBS Phosphate buffered saline µl Microlit µg Microgarm IgY Yolk Immunoglobulin IgG Immuno Globulin G CT50 Killed 50% of the cell ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FBS Fetal bovine serum BSA Bovine serum albumin SDS Sodium dodecyl sulfate vi 5. DANH MỤC BẢNG Bảng 2.

Triệu chứng rắn độc cắn thuộc họ rắn hổ. So sánh một số đặc tính của kháng thể (KT) sản xuất từ huyết thanh động vật (IgG) và kháng thể sản xuất từ trứng gia cầm (IgY) (Schade, Calzado et al, 2005). Quy trình gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn. Tỷ lệ chết của chuột ở các lô chuột thí nghiệm được tiêm nọc rắn tại các nồng độ khác nhau.

Tỷ lệ của gà xuất hiện các triệu chứng sau gây miễn dịch gà với nọc độc rắn. Giá trị OD540 và tỷ lệ chết của tế bào khi sử dụng lượng nọc rắn khác nhau được đánh giá bằng phương pháp nhuộm Neutral Red. Giá trị OD540 và tỷ lệ chết của tế bào Vero khi trung hòa độc tố nọc rắn bằng kháng thể IgY – đối chứng và 56 ngày trên tế bào. Tỷ lệ chuột chết ở các lượng kháng thể IgY khác nhau trung hòa độc tố nọc rắn.

DANH MỤC HÌNH Hình 2. Sơ đồ cơ chê gây độc thần kinh qua xi-nap. Sự truyền các loại kháng thể từ huyết thanh sang trứng gà. Hình thái và cấu trúc kháng thể IgG và IgY.

Hình ảnh chuột chết trong các lô thí nghiệm. Giá trị OD405 của các mẫu ở các độ pha loãng khác nhau. Biến động hàm lượng kháng thể của gà sau khi gây miễn dịch với kháng nguyên là nọc độc rắn. Điên di SDS – PAGE kháng thể IgY sau tách chiết.

Hình thái tế bào Vero trong thí nghiệm khi nhuộm Neutral Red. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Văn Tâm Tên Luận văn: Đánh giá khả năng trung hòa độc tố nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) bằng kháng thể lòng đỏ (IgY) kháng nọc rắn. Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60620301 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của gà mái cũng như hàm lượng kháng thể thụ động từ gà mái truyền sang trứng đối với kháng nguyên là nọc độc rắn hổ mang Naja naja để làm cơ sở cho nghiên cứu sản xuất kháng thể IgY kháng nọc rắn từ lòng đỏ trứng gà. Phương pháp nghiên cứu Nọc độc rắn được gây miễn dịch cho gà mái giai đoạn hậu bị (16 – 18 tuần tuổi) với liều gây miễn dịch dựa vào cơ sở xác định liều gây chết 50% trên chuột thí nghiệm (LD50).

Phương pháp ELISA được sử dụng để đánh giá hàm lượng kháng thể kháng nọc rắn có trong huyết thanh gà và kháng thể thụ động từ gà mẹ truyền sang trứng. Các phản ứng trung hòa độc tố nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) được thực hiện trên môi trường tế bào và trên chuột thí nghiệm. Kết quả chính và kết luận Độc tính của nọc độc rắn hổ mang Naja naja được xác định trên chuột cho kết quả giá trị LD50 = 1,46µg/g. Kết quả đánh giá hàm lượng kháng thể có trong huyết thanh bằng phản ứng ELISA cho thấy nồng độ kháng thể của gà kháng nọc rắn đạt cao nhất vào ngày 49 và kéo dài đến ngày 111 sau khi gây miễn dịch.

Hàm lượng kháng thể thụ động từ gà mẹ truyền qua trứng giá trị cao nhất vào ngày 56 sau gây miễn dịch và kéo dài đến ngày 91. Kết quả đánh giá khả năng trung hòa nọc rắn của kháng thể IgY trong lòng đỏ trứng gà cũng được tiến hành trên chuột Swiss và trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero, cho thấy kháng thể IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà của gà được gây miễn dịch với kháng nguyên là nọc rắn có khả năng trung hòa độc tố của nọc độc rắn (2LD50) trên chuột Swiss cũng như có khả năng trung hòa 5µg nọc rắn bổ sung vào môi trường nuôi cấy của 104 tế bào Vero. Như vậy, với các kết quả trên cho thấy kháng thể IgY thu từ trứng của gà được gây miễn dịch với nọc rắn có khả năng trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja). THESIS ABSTRACT Master candidate: Nguyen Van Tam Thesis title: Evaluate the ability to neutralize cobra venom (Naja naja) with anti-venom antibody (IgY) Major: Biotechnology Code: 60620301 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives This study was conducted to evaluate the ability of the hen's immune response as well as the passive antibody content from hen to the egg for antigen Naja naja as the basis for the study.

Production of IgY antibody against snake venom from egg yolk. Materials and Methods Snake venom was immunized to hens at 16 to 18 weeks of age with a dose based on 50% lethal dose in mice (LD50). ELISA was used to evaluate the anti-venom antibody content of chicken serum and the passive antibody from broilers fed to the eggs. The reactions neutralizing snake venom (Naja naja) were carried out in the cell culture medium and in mice.

Main findings and conclusions The toxicity of Naja naja snake venom was determined on the mouse resulting in an LD50 value of 1. Results of serum antibody assay by ELISA showed that the antibody concentration of the antipyretic cock was highest on day 49 and lasted until day 111 after immunization. Passive antibody levels from the parental broodstock were highest at 56 days post-immunosuppressed and lasted until day 91.