Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sản xuất nông nghiệp đối mặt với thách thức lớn khi áp lực gây hại từ các loài dịch hại thực vật gia tăng, đặc biệt là nhóm nhện hại trên các loại cây trồng như bông, chè, cây có múi (cam, quýt, bưởi), nhãn, vải, cây họ đậu, cà chua, khoai tây và cây cảnh. Nhện hại sử dụng kìm chích vào mô cây và hút dịch, phá hủy lục lạp với tốc độ 18 - 22 tế bào mỗi phút, làm cho cây còi cọc, chết điểm sinh trưởng, gây rụng lá, hoa, quả và truyền các bệnh virus nguy hiểm. Theo số liệu thống kê được tác giả dẫn giải, thiệt hại do nhện hại gây ra đối với cây táo có thể lên đến 50 - 60%, cây lê 90%, dâu tây 40 - 70%; riêng tại các quốc gia trồng sắn ở Châu Phi, mức thiệt hại ước tính lên tới 1,8 tỷ USD hàng năm (Nguyễn Văn Đĩnh, 2000).

Nhện đỏ hai đốm (Tetranychus urticae Koch, 1836) là loài dịch hại phổ biến toàn cầu với hơn 150 cây ký chủ có giá trị kinh tế và hơn 300 loài thực vật trong nhà kính. Chi phí phòng trừ loài này ước tính khoảng 4.500 USD/ha trên cây ăn trái và hoa cảnh, chiếm khoảng 30% tổng chi phí thuốc bảo vệ thực vật trên hoa trang trí và chiếm gần 62% giá trị thị trường toàn cầu dành cho việc kiểm soát dịch hại (Van Leeuwen và cs., 2008). Biện pháp kiểm soát hiện nay phụ thuộc chủ yếu vào thuốc trừ sâu hóa học tổng hợp. Tuy nhiên, do vòng đời ngắn (chỉ 8 - 12 ngày ở điều kiện nhiệt độ tối ưu 30 - 32°C), khả năng sinh sản nhanh (90 - 110 quả trứng/cá thể cái trong vòng đời khoảng 30 ngày) và phương thức sinh sản phong phú, T. urticae hình thành tính kháng thuốc rất nhanh. Việc lạm dụng thuốc hóa học còn tiêu diệt các loài thiên địch tự nhiên, gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe con người.

Xuất phát từ thực tiễn trên, tác giả Phạm Thị Phương Thảo thực hiện đề tài nhằm sàng lọc các chủng vi khuẩn và dịch chiết thực vật có hoạt tính sinh học cao, đánh giá tiềm năng kiểm soát nhện đỏ hai đốm theo hướng an toàn, tạo tiền đề cho sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp hữu cơ.

Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài được xác định qua 6 nội dung cụ thể:

  1. Thu nhận mẫu và nhân nuôi quần thể Tetranychus urticae.
  2. Thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật (hạt neem, thì là, ngải cứu).
  3. Thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch lên men một số chủng vi khuẩn tiềm năng.
  4. Thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của các chủng vi khuẩn được lên men trong dịch chiết thực vật.
  5. Thử nghiệm khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật kết hợp với vi khuẩn lên men.
  6. Đánh giá hiệu quả tiêu diệt nhện đỏ từ kết quả của các thử nghiệm trên cây đậu ở quy mô nhà lưới.
  • Đối tượng nghiên cứu: Nhện đỏ hai đốm (Tetranychus urticae); 9 chủng vi khuẩn tiềm năng gồm 8 chủng hình thái Bacillus (TD13, Q16, BT, TS3, KT2, LD5, LS6, PH3) và 1 chủng hình thái Pseudomonas (P20); 3 loài thực vật gồm cây ngải cứu (Artemisia vulgaris), cây thì là (Anethum graveolens), hạt neem (Azadirachta indica); cây đậu (Vigna angularis) làm ký chủ nhân nuôi và thử nghiệm.
  • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh 1, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh (cơ sở 3 Bình Dương). Mẫu ngải cứu được thu thập tại Xã Eatoh, Huyện Krông Năng, Tỉnh Đắk Lắk; mẫu thì là tại Thành phố Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương; mẫu hạt neem tại Tỉnh Tây Ninh; mẫu nhện đỏ thu nhận tại khuôn viên Trường Đại học Mở TP.HCM.
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được tiến hành từ tháng 5/2020 đến tháng 8/2020.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng phân loại học và cơ chế tác động sinh học của các tác nhân kiểm soát tự nhiên:

  • Cơ sở phân loại học: Khóa phân loại CABI (2019) đối với Tetranychus urticae; khóa phân loại Cohn và cộng sự (1872), GBIF (2019) đối với chi Bacillus; khóa phân loại ITIS (2012) đối với chi Pseudomonas.
  • Cơ sở sinh học và cơ chế tác động: Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus (như Bacillus thuringiensis) có khả năng sản sinh độc tố protein tinh thể (endotoxin) và các enzyme phá vỡ lớp biểu bì của nhện hại (Larrea và cs., 2015). Chi Pseudomonas (như Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida) tiết ra các enzyme ngoại bào như chitinase, protease, lipase và hydrolase nhằm thủy phân vỏ ngoài chitin của nhện đỏ, gây chết hoặc làm giảm tỷ lệ nở trứng (Aksoy và cs., 2008; Babu và cs., 2010). Đối với thực vật, hạt neem chứa hoạt chất chính azadirachtin (chiếm 40% trong dầu) tác động lên hormone của côn trùng mà không tác động trực tiếp lên hệ thần kinh nên hạn chế sự hình thành tính kháng (Isman và cs., 1990; Dennis, 1992); tinh dầu và dịch chiết từ ngải cứu và thì là chứa các hợp chất thứ cấp có đặc tính xua đuổi, ức chế sinh sản và gây độc trực tiếp lên nhện đỏ (Salman và cs., 1836; El-Gepaly và cs., 2016).

Phương pháp thực nghiệm được triển khai tuần tự theo các kỹ thuật phòng thí nghiệm và quy mô bán tự nhiên:

  • Hoạt hóa và nhận diện vi sinh vật: Hoạt hóa 9 chủng vi khuẩn trên đĩa thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar - NA) ở 37°C trong 24 - 48 giờ. Quan sát hình thái khuẩn lạc (đại thể). Kiểm tra hình thái tế bào, cách sắp xếp và sự hiện diện của nội bào tử thông qua kỹ thuật nhuộm Gram, soi kính hiển vi quang học độ phóng đại 100X với các thuốc nhuộm crystal violet, dung dịch lugol, cồn 96° và safranin O. Thử nghiệm sinh hóa catalase bằng dung dịch $H_2O_2$ 3% (đối chứng dương Staphylococcus aureus).
  • Tách chiết thảo mộc: Nguyên liệu thực vật được phơi, sấy khô đến khối lượng không đổi, nghiền nhỏ và chiết xuất bằng phương pháp đun sôi hồi lưu với nước cất cho đến khi thể tích còn 1/4 thể tích ban đầu (Handa, 2008). Dịch chiết lọc qua giấy lọc Whatman để thu dung dịch gốc (100%), sau đó pha loãng thành các nồng độ thử nghiệm (3%, 6%, 12% và dải nồng độ thấp 0,5%, 1%, 2%).
  • Lên men vi khuẩn: Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn trong môi trường lỏng Nutrient Broth (NB) ở 37°C trong 24 - 48 giờ để đạt mật độ ban đầu $1 \times 10^9\text{ CFU/ml}$, sau đó pha loãng thành các dải nồng độ $1 \times 10^6$, $2 \times 10^6$, $3 \times 10^6\text{ CFU/ml}$ và dải mật độ cao $5 \times 10^6$, $10^7$, $5 \times 10^7$, $10^8\text{ CFU/ml}$. Quá trình lên men trong dịch chiết thực vật được thực hiện bằng cách phối trộn môi trường NB với dịch chiết (tỷ lệ 1:1), tiệt trùng ở 121°C trong 10 phút, làm nguội và cấy 1% giống vi khuẩn, ủ ở 37°C trong 3 ngày (Schaffner và cs., 1986). Thí nghiệm phối trộn trực tiếp thực hiện bằng cách trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch chiết thực vật vô trùng theo tỷ lệ 1:1.
  • Bố trí thử nghiệm sinh học (in vitro): Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa petri có lót lớp bông thấm nước giữ ẩm cho lá đậu (Vigna angularis). Thử nghiệm bằng hai phương pháp: ngâm lá trong dung dịch thử nghiệm 20 giây và phun trực tiếp bằng bình phun 5 ml ở khoảng cách 25 - 30 cm. Mỗi đĩa thả 10 cá thể nhện đỏ trưởng thành, lặp lại 3 lần cho mỗi nghiệm thức. Ghi nhận tỷ lệ nhện chết tại các mốc thời gian 6, 24, 48, 72 và 96 giờ (nhện được xem là sống nếu còn cử động hoặc di chuyển khi chạm nhẹ bằng cọ nhỏ).
  • Thử nghiệm trên cây đậu ở quy mô nhà lưới (in vivo): Sử dụng cây đậu trên 2 tuần tuổi sinh trưởng đồng đều, trồng trong chậu đất đã khử trùng nhiệt. Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 5 nghiệm thức với 3 lần lặp lại: Đối chứng - ĐC (nước cất), VK (đơn chủng vi khuẩn), TV (dịch chiết thực vật), LM (vi khuẩn lên men trong dịch chiết), TV+VK (vi khuẩn phối trộn với dịch chiết). Phun 7 ml dịch thử nghiệm/chậu ở cự ly 20 - 30 cm, kiểm tra và ghi nhận mật số nhện sau 96 giờ.
  • Xử lý số liệu: Hiệu lực tiêu diệt nhện được tính toán theo công thức Abbott (Abbott, 1925): $$E (%) = \frac{C - T}{C} \times 100$$ Trong đó $E$ là hiệu lực tiêu diệt nhện (%), $C$ là số nhện sống ở nghiệm thức đối chứng, $T$ là số nhện sống ở nghiệm thức thử nghiệm. Số liệu được phân tích phương sai (ANOVA) và so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức bằng phép kiểm định Duncan ở mức ý nghĩa $p < 0,05$.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp hệ thống cơ sở lý luận về nhện đỏ hai đốm, các nhóm vi sinh vật đối kháng và các loài thực vật có tiềm năng trừ sâu sinh học:

  • Tổng quan về Tetranychus urticae: Mô tả phân loại, cấu tạo giải phẫu gồm hai phần chính (gnathosoma và idiosoma), chu kỳ vòng đời qua 5 giai đoạn (trứng, ấu trùng 3 đôi chân, protonymph, deutonymph và nhện trưởng thành 4 đôi chân). Tác giả dẫn chứng số liệu về tốc độ gây hại, khả năng thích nghi trong điều kiện khô nóng mùa hè, tập tính đan xen qua đông và sự bùng phát quần thể nhanh chóng khi gặp nồng độ thuốc BVTV dưới ngưỡng gây chết (Hoy, 2016).
  • Vai trò của chi Bacillus: Cung cấp thông tin phân loại 266 loài Bacillus, đặc tính tạo nội bào tử bền vững, khả năng sinh enzyme công nghiệp (amylase, protease) và lipopeptide. Đánh giá các bằng chứng thực nghiệm về hiệu lực của Bacillus thuringiensis trong việc phá vỡ lớp biểu bì nhện hại, làm giảm tỷ lệ sống của cá thể cái và ức chế tỷ lệ nở của trứng nhện từ 59,4% đến 97,2% (Chapman và cs., 1991; Larrea và cs., 2015).
  • Vai trò của chi Pseudomonas: Mô tả 191 loài trực khuẩn Gram âm không sinh bào tử, có phản ứng catalase và oxidase dương tính, khả năng phát huỳnh quang dưới bước sóng 254 nm. Tổng kết các nghiên cứu về việc ứng dụng Pseudomonas putida và Pseudomonas fluorescens phân lập từ đất gây tỷ lệ tử vong lên tới 100% đối với nhện đỏ và ấu trùng qua cơ chế tiết chitinase thủy phân khung xương ngoài (Aksoy và cs., 2008; Babu và cs., 2010; Roobakkumar và cs., 2011).
  • Đặc tính các loài thực vật: Trình bày đặc điểm hình thái và thành phần dược tính của cây thì là (Anethum graveolens họ Apiaceae), cây ngải cứu (Artemisia vulgaris họ Asteraceae) và cây neem (Azadirachta indica họ Meliaceae). Nêu bật khả năng diệt nhện đỏ của dịch chiết thì là (đạt 100% sau 6 ngày theo Salman và cs.), ngải cứu (gây chết 61,56% theo El-Gepaly và cs., 2016) và cơ chế tác động điều hòa sinh trưởng, xua đuổi của azadirachtin trong hạt neem.

Phần 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, hệ thống trang thiết bị (nồi hấp tiệt trùng, tủ cấy vô trùng, kính hiển vi quang học, tủ ấm 37°C) và dụng cụ thủy tinh tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh 1. Tác giả thiết lập sơ đồ khối tiến trình nghiên cứu từ khâu thu thập mẫu vật liệu, kiểm tra các đặc tính sinh học vi sinh vật, xây dựng các công thức tách chiết và lên men, đến khâu thiết kế các lô thử nghiệm sinh học có đối chứng trong phòng thí nghiệm và mở rộng trên cây đậu ở nhà lưới. Mọi bước thao tác như nồng độ pha loãng, thời gian ngâm (20 giây), cự ly phun (20 - 30 cm) và công thức toán học Abbott đều được quy chuẩn hóa nhằm đảm bảo tính lặp lại của dữ liệu thực nghiệm.

Phần 3. Kết quả và biện luận

Tác giả trình bày các số liệu và nhận xét thực nghiệm theo 8 nội dung chính:

  • Nhận diện hình thái và sinh hóa vi sinh vật: 9 chủng vi khuẩn được kiểm tra đại thể trên NA và vi thể qua nhuộm Gram và thử nghiệm catalase. Kết quả xác định 8 chủng thuộc nhóm vi khuẩn trực khuẩn Gram dương, có nội bào tử, catalase dương tính (TD13, Q16, BT, TS3, KT2, LD5, LS6, PH3) phù hợp mô tả của chi Bacillus; 1 chủng trực khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, catalase dương tính, sinh sắc tố xanh khuếch tán vào môi trường (P20) tương đồng với chi Pseudomonas.
STT Mã chủng Hình thái khuẩn lạc (Đại thể) Nhuộm Gram Hình thái vi thể & Sắp xếp Bào tử Thử nghiệm Catalase Nhóm vi khuẩn tương đồng
1 TD13 Bờ răng cưa, trắng ngà, nhẵn, dẹt + Trực khuẩn mảnh, xếp đôi Có + Bacillus
2 Q16 Bờ không đều, trắng đục, tâm nhăn + Trực khuẩn mảnh, xếp chuỗi Có + Bacillus
3 BT Bờ không đều, trắng ngà, nhẵn + Trực khuẩn, xếp chuỗi Có + Bacillus
4 TS3 Tròn, bờ răng cưa, trắng đục, tâm nhăn nhỏ + Trực khuẩn, đơn Có + Bacillus
5 KT2 Bờ răng cưa, trắng, tâm nhăn + Trực khuẩn mảnh, xếp đôi Có + Bacillus
6 LD5 Bờ không đều, trắng đục, khô, tâm nhẵn + Trực khuẩn, đơn Có + Bacillus
7 LS6 Bờ không đều, trắng ngà, tâm nhẵn + Trực khuẩn mảnh, đơn Có + Bacillus
8 PH3 Tròn, bờ răng cưa, trắng ngà, tâm nhăn + Trực khuẩn, đơn Có + Bacillus
9 P20 Tròn, nhỏ, lồi, trắng trong, sinh sắc tố xanh - Trực khuẩn mảnh, đơn Không + Pseudomonas
  • Khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch chiết thực vật đơn lẻ: Thử nghiệm tại các nồng độ 3%, 6% và 12% ghi nhận hiệu lực diệt nhện tăng dần theo nồng độ và thời gian phơi nhiễm. Tại nồng độ 12% sau 96 giờ, dịch chiết ngải cứu thể hiện hiệu lực vượt trội đạt $87,79 \pm 21,10%$, cao hơn có ý nghĩa thống kê so với hạt neem ($69,47 \pm 28,98%$) và thì là ($59,00 \pm 3,83%$). Khảo sát bổ sung dịch chiết ngải cứu ở các nồng độ thấp (0,5%, 1%, 2%) cho thấy nồng độ 2% chỉ đạt hiệu lực tối đa $41,07 \pm 8,92%$ sau 72 - 96 giờ. Do đó, mức nồng độ 12% của ngải cứu được lựa chọn cho các thử nghiệm tiếp theo.
Loại dịch chiết Nồng độ Hiệu lực diệt nhện sau 6h (%) Hiệu lực diệt nhện sau 24h (%) Hiệu lực diệt nhện sau 48h (%) Hiệu lực diệt nhện sau 72h (%) Hiệu lực diệt nhện sau 96h (%)
Thì là 3% $6,16 \pm 10,62$ $21,94 \pm 20,00$ $37,22 \pm 3,48$ $40,78 \pm 12,65$ $45,00 \pm 5,77$
Ngải cứu 3% $6,16 \pm 10,62$ $6,16 \pm 10,16$ $35,22 \pm 3,48$ $43,08 \pm 12,65$ $47,01 \pm 8,95$
Neem 3% $6,16 \pm 10,62$ $19,93 \pm 17,55$ $28,78 \pm 3,48$ $43,08 \pm 3,33$ $50,85 \pm 6,00$
Thì là 6% $8,87 \pm 15,32$ $27,79 \pm 28,40$ $43,08 \pm 18,73$ $45,00 \pm 18,44$ $51,14 \pm 12,10$
Ngải cứu 6% $6,16 \pm 10,62$ $17,72 \pm 15,32$ $34,23 \pm 31,99$ $45,29 \pm 16,00$ $53,15 \pm 12,50$
Neem 6% $12,30 \pm 10,62$ $26,07 \pm 7,04$ $30,29 \pm 10,70$ $45,00 \pm 11,79$ $53,85 \pm 23,98$
Thì là 12% $11,09 \pm 19,16$ $35,22 \pm 3,48$ $45,00 \pm 5,77$ $46,92 \pm 3,33$ $59,00 \pm 3,83$
Ngải cứu 12% $26,56 \pm 0,00$ $36,93 \pm 9,43$ $85,58 \pm 24,94$ $85,58 \pm 24,94$ $87,79 \pm 21,10$
Neem 12% $15,01 \pm 13,59$ $21,94 \pm 20,00$ $32,30 \pm 12,01$ $61,40 \pm 33,53$ $69,47 \pm 28,98$
  • Khả năng tiêu diệt nhện đỏ của dịch lên men vi khuẩn: Sàng lọc 9 chủng vi khuẩn ở 3 mức mật độ ($10^6$, $2 \times 10^6$ và $3 \times 10^6\text{ CFU/ml}$) cho thấy hiệu quả diệt trừ biến thiên rõ rệt theo chủng và mật độ:
    • Ở nồng độ $10^6\text{ CFU/ml}$: Chủng LD5 đạt hiệu lực $99,98 \pm 0,00%$ sau 48 giờ; chủng BT đạt $99,98 \pm 0,00%$ sau 72 giờ.
    • Ở nồng độ $2 \times 10^6\text{ CFU/ml}$: Chủng TD13 đạt hiệu lực $99,98 \pm 0,00%$ sau 72 giờ; chủng Q16 đạt $99,98 \pm 0,00%$ sau 96 giờ.
    • Ở nồng độ $3 \times 10^6\text{ CFU/ml}$: Chủng BT cho tốc độ diệt nhện nhanh nhất, đạt $99,98 \pm 0,00%$ ngay sau 6 giờ; chủng PH3 đạt $99,98 \pm 0,00%$ sau 72 giờ.
    • Thử nghiệm chuyên sâu dải mật độ cao ($5 \times 10^6$ đến $10^8\text{ CFU/ml}$) đối với hai chủng triển vọng nhất là BT (BT1) và PH3: Cả hai chủng đều đạt hiệu lực tiêu diệt tuyệt đối $99,98 \pm 0,00%$ chỉ sau 24 giờ ở mật độ $5 \times 10^7\text{ CFU/ml}$.
Chủng vi khuẩn Mật độ khuẩn Hiệu lực diệt nhện sau 6h (%) Hiệu lực diệt nhện sau 24h (%) Hiệu lực diệt nhện sau 48h (%) Hiệu lực diệt nhện sau 72h (%) Hiệu lực diệt nhện sau 96h (%)
LD5 $10^6\text{ CFU/ml}$ - - $99,98 \pm 0,00$ - -
TD13 $2 \times 10^6\text{ CFU/ml}$ $83,57 \pm 28,41$ $85,58 \pm 24,94$ $90,50 \pm 16,41$ $99,98 \pm 0,00$ $99,98 \pm 0,00$
Q16 $2 \times 10^6\text{ CFU/ml}$ $60,00 \pm 13,61$ $63,93 \pm 7,39$ $71,56 \pm 0,00$ $90,50 \pm 16,40$ $99,98 \pm 0,00$
BT (BT1) $3 \times 10^6\text{ CFU/ml}$ $99,98 \pm 0,00$ $99,98 \pm 0,00$ $99,98 \pm 0,00$ $99,98 \pm 0,00$ $99,98 \pm 0,00$
PH3 $3 \times 10^6\text{ CFU/ml}$ $68,85 \pm 4,70$ $68,85 \pm 4,70$ $90,50 \pm 16,41$ $99,98 \pm 0,00$ $99,98 \pm 0,00$
BT1 $5 \times 10^7\text{ CFU/ml}$ $81,04 \pm 10,65$ $99,98 \pm 0,00$ $99,98 \pm 0,00$ $99,98 \pm 0,00$ $99,98 \pm 0,00$
PH3 $5 \times 10^7\text{ CFU/ml}$ - $99,98 \pm 0,00$ $99,98 \pm 0,00$ $99,98 \pm 0,00$ $99,98 \pm 0,00$
  • Khả năng tiêu diệt nhện đỏ của vi khuẩn lên men trong dịch chiết thực vật: Ở nồng độ pha loãng 3% của dịch lên men kết hợp, chủng PH3 cho hiệu lực diệt nhện cao nhất đạt $99,98 \pm 0,00%$ sau 48 giờ. Các chủng BT và P20 cũng đạt hiệu lực $99,98 \pm 0,00%$ sau 96 giờ nuôi cấy tiếp xúc.

Kết luận và kiến nghị

Tác giả đúc kết lại các công thức tối ưu qua thực nghiệm: dịch chiết ngải cứu nồng độ 12% và hai chủng vi khuẩn BT, PH3 ở mật độ $5 \times 10^7\text{ CFU/ml}$ có tiềm năng ứng dụng cao nhất. Khóa luận kiến nghị tiếp tục mở rộng quy mô khảo nghiệm đồng ruộng, nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân giải của enzyme và hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học thương phẩm.

Kết quả và đóng góp nghiên cứu

Nghiên cứu mang lại các kết quả định lượng cụ thể, đóng góp cơ sở dữ liệu thực nghiệm về phòng trừ sinh học nhện đỏ hai đốm:

  • Số liệu thực nghiệm cốt lõi:
    • Tuyển chọn được dịch chiết ngải cứu (Artemisia vulgaris) nồng độ 12% là thảo mộc có hoạt lực cao nhất trong 3 loài khảo nghiệm, đạt tỷ lệ tiêu diệt nhện đỏ $87,79 \pm 21,10%$ sau 96 giờ, vượt trội so với neem (69,47%) và thì là (59,00%).
    • Xác định được chủng vi khuẩn BT (thuộc nhóm Bacillus) có tác động diệt nhện nhanh nhất: đạt hiệu lực $99,98 \pm 0,00%$ chỉ sau 6 giờ ở nồng độ $3 \times 10^6\text{ CFU/ml}$.
    • Xác định mật độ tối ưu cho hai chủng tiềm năng BT1 và PH3 là $5 \times 10^7\text{ CFU/ml}$, đều đạt tỷ lệ tiêu diệt nhện tuyệt đối $99,98 \pm 0,00%$ sau 24 giờ.
    • Quá trình lên men vi khuẩn trong môi trường dịch chiết thực vật giúp tăng tốc hoạt tính: chủng PH3 lên men trong dịch chiết ở nồng độ 3% đạt hiệu lực tiêu diệt $99,98 \pm 0,00%$ sau 48 giờ.
  • Đóng góp so sánh với các công bố khoa học trước đó:
    • Hiệu lực tiêu diệt của dịch chiết ngải cứu trong nghiên cứu này ($87,79%$) cao hơn đáng kể so với kết quả công bố của El-Gepaly và cs. (2016) trên nhện đỏ trưởng thành ($61,56%$).
    • Hiệu lực tiêu diệt của các chủng Bacillus đạt mức tuyệt đối ($99,98%$), cao hơn so với kết quả của David Mendoza-Léon (2018) chỉ đạt $66,67 \pm 21,08%$.
    • Ngược lại, hiệu lực của dịch chiết thì là ($59,00%$) thấp hơn công bố của Salman và cs. ($100%$), và dịch chiết hạt neem ($69,47%$) thấp hơn kết quả của Knapp và cs. Sự chênh lệch này được tác giả biện giải là do sự khác biệt về nguồn gốc địa lý của mẫu thực vật, phương pháp trích ly (nấu hồi lưu dung môi nước so với chiết tinh dầu) và nồng độ hoạt chất thực tế.
  • Giải pháp và đề xuất ứng dụng: Cung cấp quy trình kết hợp công nghệ vi sinh và nguồn dược liệu thực vật sẵn có (ngải cứu, chủng vi khuẩn đối kháng BT, PH3) nhằm tạo ra giải pháp sinh học thay thế thuốc trừ sâu hóa học, hướng tới nền nông nghiệp sạch và giảm thiểu nguy cơ phát sinh tính kháng ở nhện hại.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Hạn chế của khóa luận:
    • Các chủng vi sinh vật mới chỉ được định danh sơ bộ dựa trên đặc điểm hình thái đại thể (khuẩn lạc), vi thể (nhuộm Gram) và thử nghiệm sinh hóa catalase; chưa tiến hành giải trình tự gen 16S rRNA để định danh chính xác đến mức loài.
    • Chưa phân tích, định tính và định lượng cụ thể các thành phần hoạt chất thứ cấp (như hàm lượng azadirachtin trong neem, cineol/thujone trong ngải cứu) cũng như chưa tinh sạch độc tố protein tinh thể hay enzyme ngoại bào (chitinase, protease) của các chủng vi khuẩn.
    • Các thử nghiệm mới dừng lại ở phạm vi đĩa petri trong phòng thí nghiệm và quy mô mô hình nhà lưới ngắn hạn (96 giờ) trên cây đậu non 2 tuần tuổi; chưa đánh giá tác động tồn dư trên diện rộng và sự tương tác phức tạp của các yếu tố khí tượng (nhiệt độ, ẩm độ cao, mưa gió tự nhiên).
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Ứng dụng sinh học phân tử (giải trình tự vùng gen 16S rRNA) để định danh chính xác tên loài của các chủng tiềm năng (BT, PH3, LD5, TD13, P20).
    • Nghiên cứu cơ chế tác động chi tiết ở mức độ tế bào và phân tử: giải mã độc lực enzyme chitinase, protease hoặc các lipopeptide kháng nhện do vi khuẩn tiết ra.
    • Mở rộng khảo nghiệm đồng ruộng diện rộng trên nhiều đối tượng cây trồng kinh tế cao (cây ăn trái, chè, sắn, rau màu).
    • Nghiên cứu công nghệ tạo chế phẩm sinh học thương phẩm (dạng lỏng hoặc bột hòa nước), đánh giá chất phụ gia bám dính, độ ổn định sinh học và hạn sử dụng của chế phẩm.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu hữu ích cho:

  • Đối tượng tham khảo: Giảng viên, học viên cao học và sinh viên các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Nông nghiệp, Môi trường, Bảo vệ thực vật; các kỹ sư nông học và cán bộ nghiên cứu tại các trung tâm khuyến nông, viện nghiên cứu sinh học ứng dụng.
  • Nội dung giá trị nhất:
    • Quy trình chi tiết về nhân nuôi tập trung quần thể nhện đỏ hai đốm (Tetranychus urticae) trên ký chủ cây đậu (Vigna angularis) phục vụ thử nghiệm sinh học.
    • Thiết kế thí nghiệm sàng lọc kép: kết hợp giữa thử nghiệm ngâm lá và phun sương bề mặt, đánh giá theo dõi động thái gây chết theo chuỗi thời gian (6, 24, 48, 72, 96 giờ).
    • Phương pháp kỹ thuật phối trộn và lên men vi khuẩn đối kháng trong môi trường cơ chất dịch chiết thảo mộc tự nhiên.
    • Dữ liệu so sánh đối chứng toàn diện về hiệu lực của các chủng Bacillus, Pseudomonas và dịch chiết ngải cứu, neem, thì là được xử lý thống kê bằng công thức Abbott và kiểm định Duncan.

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi khuẩn nào thể hiện khả năng tiêu diệt nhện đỏ nhanh nhất và đạt tỷ lệ bao nhiêu?
Chủng vi khuẩn BT (nhóm Bacillus) đạt hiệu lực tiêu diệt nhện đỏ nhanh nhất với tỷ lệ $99,98 \pm 0,00%$ chỉ sau 6 giờ thử nghiệm ở nồng độ dịch khuẩn $3 \times 10^6\text{ CFU/ml}$.

2. Trong ba loại thực vật khảo nghiệm, dịch chiết nào cho hiệu quả diệt nhện cao nhất và ở nồng độ nào?
Dịch chiết ngải cứu (Artemisia vulgaris) cho hiệu quả cao nhất ở nồng độ 12%, đạt tỷ lệ tiêu diệt nhện đỏ $87,79 \pm 21,10%$ sau 96 giờ thử nghiệm, cao hơn có ý nghĩa thống kê so với hạt neem ($69,47%$) và thì là ($59,00%$).

3. Khóa luận sử dụng công thức toán học nào để xác định hiệu lực tiêu diệt nhện qua các nghiệm thức?
Tác giả sử dụng công thức Abbott (1925):
$$E (%) = \frac{C - T}{C} \times 100$$
Trong đó $E$ là hiệu lực tiêu diệt nhện (%), $C$ là số lượng nhện sống ở mẫu đối chứng (nước cất), và $T$ là số lượng nhện sống ở mẫu thí nghiệm.

4. Hai chủng vi khuẩn BT1 và PH3 đạt hiệu lực diệt nhện tối đa ở mật độ nào khi khảo sát nồng độ cao?
Ở dải nồng độ cao ($5 \times 10^6$ đến $10^8\text{ CFU/ml}$), cả hai chủng vi khuẩn BT1 và PH3 đều đạt hiệu lực tiêu diệt nhện đỏ tối đa $99,98 \pm 0,00%$ sau 24 giờ thử nghiệm tại mật độ $5 \times 10^7\text{ CFU/ml}$. Mật độ này được chọn để đưa vào thử nghiệm trên cây đậu ở quy mô nhà lưới.

5. Điểm khác biệt về hình thái và sinh hóa giữa chủng vi khuẩn P20 so với 8 chủng vi khuẩn còn lại là gì?
Chủng P20 là trực khuẩn mảnh Gram âm, tế bào đứng đơn, không hình thành nội bào tử, khuẩn lạc tròn nhỏ lồi màu trắng trong và có khả năng sinh sắc tố xanh khuếch tán ra môi trường (đặc trưng của chi Pseudomonas). Ngược lại, 8 chủng còn lại (TD13, Q16, BT, TS3, KT2, LD5, LS6, PH3) đều là trực khuẩn Gram dương, có hình thành nội bào tử và mang đặc tính của chi Bacillus. Cả 9 chủng đều dương tính với thử nghiệm catalase.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Thị Phương Thảo đã hoàn thành việc sàng lọc, đánh giá hoạt lực phòng trừ sinh học nhện đỏ hai đốm (Tetranychus urticae) từ 9 chủng vi khuẩn và 3 loại dịch chiết thực vật trong điều kiện in vitro và in vivo. Công trình xác định được dịch chiết ngải cứu nồng độ 12% cùng hai chủng vi khuẩn tiềm năng thuộc chi Bacillus (BT1 và PH3) ở mật độ $5 \times 10^7\text{ CFU/ml}$ mang lại hiệu lực tiêu diệt nhện đỏ vượt trội (đạt từ 87,79% đến 99,98%). Những kết quả thực nghiệm này cung cấp cơ sở khoa học tin cậy cho việc phát triển các chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật an toàn, góp phần hạn chế việc sử dụng hóa chất và phát triển nền nông nghiệp bền vững.