Tổng quan luận án

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới và á nhiệt đới, là một trung tâm đa dạng sinh học với hơn 16.000 loài thực vật khác nhau (Biodivn, 2017). Trong hệ thực vật phong phú này, có nhiều nhóm thực vật xâm lược, cây họ đậu và cây dược liệu có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, các nghiên cứu nhằm đánh giá tính đối kháng thực vật (allelopathy) cũng như tách chiết, định danh các hoạt chất đối kháng từ các loài này để ứng dụng trong phòng trừ cỏ dại ngoài đồng ruộng còn rất hạn chế.

Cỏ dại là đối tượng cạnh tranh dinh dưỡng, ánh sáng, nước và không gian sinh trưởng, làm suy giảm nghiêm trọng năng suất và chất lượng cây trồng. Trên phạm vi toàn cầu, ước tính có khoảng 30.000 loài cỏ dại gây ảnh hưởng trực tiếp đến sản xuất nông nghiệp (Manisankar & cs., 2014); thiệt hại hàng năm do cỏ dại gây ra tại Hoa Kỳ ước tính khoảng 33 tỉ USD kèm 6,2 tỉ USD chi phí phòng trừ, trong khi tại Australia chi phí này là 3,3 tỉ AUD cùng mức sụt giảm 2,7 triệu tấn ngũ cốc (Chauhan, 2021). Tại Việt Nam, có khoảng 400 loài cỏ dại phổ biến, trong đó hai họ Hòa thảo (Poaceae) và Cói lác (Cyperaceae) gây tác hại nặng nề nhất (Chin, 1995). Các biện pháp quản lý cỏ truyền thống như làm cỏ thủ công bằng tay, điều tiết chế độ nước, làm đất hay kỹ thuật thâm canh đòi hỏi nhiều nhân công, phụ thuộc thời tiết và chịu áp lực lớn từ quá trình đô thị hóa. Để đối phó, việc sử dụng thuốc diệt cỏ tổng hợp tăng nhanh từ đầu thập niên 1990, đạt 42.000 tấn/năm vào năm 2013 (tương đương 300 triệu USD) và tiếp tục gia tăng trong các năm gần đây (Thanh & Tran, 2020). Tình trạng lạm dụng thuốc diệt cỏ hóa học đã dẫn đến ô nhiễm môi trường đất, phá vỡ cân bằng vi sinh vật, làm tồn dư chất độc hại trong nông sản, đe dọa sức khỏe cộng đồng và làm bùng phát các quần thể cỏ dại kháng thuốc. Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là việc thiếu hụt các nghiên cứu thực nghiệm có hệ thống từ quy mô phòng thí nghiệm đến đồng ruộng nhằm khai thác tiềm năng đối kháng của các loài thực vật bậc cao tại Việt Nam để làm cơ sở phát triển thuốc trừ cỏ sinh học (bioherbicide).

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể như sau:

  • Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu đánh giá hoạt tính đối kháng thực vật của cây lạc dại (Arachis pintoi Krapov.), liêm hồ đằng (Cissus sicyoides L.), tơ hồng xanh (Cassytha filiformis L.), lá gai (Boehmeria nivea (L.)), cỏ may (Chrysopogon aciculatus (Retz.)) đối với cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli L.) và một số cây chỉ thị khác, làm cơ sở để xác định nguồn vật liệu có tiềm năng khai thác tính đối kháng thực vật phòng chống cỏ dại.
  • Mục tiêu cụ thể:
    1. Thu thập và đánh giá hoạt tính đối kháng thực vật của cây lạc dại, cây liêm hồ đằng, cây tơ hồng xanh, cây gai, cây cỏ may trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng ruộng.
    2. Xác định được hoạt tính đối kháng từ dịch chiết của các cây thử nghiệm đến khả năng ức chế sự nảy mầm, sinh trưởng của hạt cỏ lồng vực nước và các hạt chỉ thị.
    3. Phân tích và xác định một số hoạt chất đối kháng thực vật từ chiết xuất của các cây thử nghiệm.

(Văn bản luận án không tách riêng mục câu hỏi hay giả thuyết nghiên cứu mà cụ thể hóa qua hệ thống 3 mục tiêu nêu trên).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: 05 loài thực vật thử nghiệm gồm cây lạc dại (Arachis pintoi Krapov.), liêm hồ đằng (Cissus sicyoides L. – phân chia thân, rễ, lá), tơ hồng xanh (Cassytha filiformis L.), cây gai (Boehmeria nivea (L.) – phân chia thân, lá), cỏ may (Chrysopogon aciculatus (Retz.)). Cỏ dại kiểm tra và thực vật chỉ thị gồm cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli L.), thóc (Oryza sativa L.), đỗ xanh (Vigna radiata L.), rau xà lách (Lactuca sativa L.).
  • Phạm vi không gian (địa điểm thực hiện): Bộ môn Bệnh cây (Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam); Bộ môn Kỹ thuật Di truyền (Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam); Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật và Hóa sinh (Trường Sau đại học về Hợp tác và Phát triển Quốc tế, Đại học Hiroshima, Nhật Bản).
  • Phạm vi thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu sinh tiến hành thu thập mẫu, bố trí thí nghiệm và phân tích dữ liệu trong giai đoạn từ tháng 10/2016 đến tháng 05/2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Thuật ngữ "Đối kháng thực vật" (allelopathy) được Hans Molisch đề xuất năm 1937, có gốc từ tiếng Hy Lạp gồm allelon (lẫn nhau) và pathos (chịu đựng), mô tả tương tác sinh hóa mà qua đó thực vật giải phóng các hợp chất thứ cấp gây ảnh hưởng ức chế hoặc kích thích đối với sinh vật lân cận (Molisch, 1937; Rice, 1974, 1984; Rizvi & Rizvi, 1992). Năm 1996, Hiệp hội Allelopathy Quốc tế (International Allelopathy Society) hoàn thiện định nghĩa: allelopathy là bất kỳ quá trình nào liên quan đến các chất chuyển hóa thứ cấp do thực vật, vi sinh vật, virus và nấm tạo ra, gây ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các hệ thống nông nghiệp và sinh học (Torres & cs., 1996).

Trên thế giới, các hướng nghiên cứu về tính đối kháng của thực vật bậc cao được phát triển rộng rãi:

  • Sàng lọc quy mô lớn nguồn thực vật tự nhiên: Ndam & cs. (2014) khảo sát hơn 300 loài thực vật bậc cao tại Nhật Bản và Cameroon, phân lập 26 loài họ Đậu và 19 loài xâm thực có hoạt tính đối kháng mạnh. Rehman & cs. (2018) thử nghiệm các loài vùng Địa Trung Hải (Calamintha nepta, Hypericum hircinum, Artemisia arborescens, Euphorbia rigida, Vicia villosa, Brassica). Hàng trăm loài thực vật bậc cao tại Nhật Bản, Ấn Độ, Hoa Kỳ như cỏ linh lăng (Medicago sativa), kiều mạch (Fagopyrum esculentum), sầu đâu (Azadirachta indica), keo dậu (Leucaena glauca), cỏ hôi (Ageratum conyzoides) được chứng minh có khả năng ức chế cỏ dại 70-80% và gia tăng năng suất lúa trên 20% khi bón 1-2 tấn/ha (Xuan & cs., 2005). Các nghiên cứu khác ghi nhận hoạt tính đối kháng ở chi Bìm bìm (Ipomoea) với hơn 600 loài (Shen & cs., 2018), cây họ Liễu Populus nigra (Muhammad & cs., 2019), cúc gai Centaurea solstitialis (Irimia & cs., 2016), cây cốt khí củ Fallopia japonica và keo dậu Leucaena leucocephala (Kato-Noguchi, 2022).
  • Khảo sát tính đối kháng ở cây trồng chính họ Hòa thảo: Dilday & cs. (1998, 2000) đánh giá hàng ngàn dòng/giống lúa tại Hoa Kỳ và châu Âu, phát hiện 412 giống ức chế cỏ chân vịt (Monochoria vaginalis), 95 giống ức chế cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli). Nghiên cứu của Olofsdotter & cs. (1999) tại Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) chọn lọc được 45 giống lúa ức chế cỏ lồng vực. Tại Ai Cập, Hasan & cs. (2012) ghi nhận 20-40% trong 1.000 giống lúa khảo sát có hoạt tính đối kháng. Fujii (1992) tại Nhật Bản và Ahn & cs. (2005) tại Hàn Quốc nhận thấy các giống lúa cổ truyền Japonica hoặc lúa bản địa châu Phi (Oryza glaberrima) biểu hiện tính đối kháng cao hơn các giống lúa cải tiến năng suất cao.
  • Nghiên cứu cơ chế và hoạt chất đối kháng: Hiện nay có khoảng 100.000 hợp chất thứ cấp liên quan đến tính đối kháng thực vật được phát hiện (Latif & cs., 2017). Các hợp chất tiêu biểu đã được ứng dụng làm chất diệt cỏ tự nhiên gồm glucosinolate, sorgoleone, momilactones, artemisinin, leptospermone tách chiết từ Brassica sp., Sorghum bicolor, Artemisia annua, Callistemon citrinus (Rice, 1984; Bertin & cs., 2003; Kato-Noguchi & Peters, 2013). Các nhóm chất chính bao gồm phenolic acids (p-hydroxybenzoic, vanillic, p-coumaric, ferulic), terpenoids, coumarins, fatty acids (Kong & cs., 2006).

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về tính đối kháng thực vật bậc cao còn khá tản mạn:

  • Hong & cs. (2003, 2004, 2013) bước đầu sàng lọc hơn 60 loài thực vật bậc cao bản địa, ghi nhận hoạt tính ở các loài như Ageratum conyzoides, Azadirachta indica, Leucaena glauca, Eupatorium cannabinum, Bidens pilosa, Cuscuta hygrophilae.
  • Xuan & cs. (2009) sàng lọc 73 giống lúa cải tiến Việt Nam và xác định được 15 giống có tính kháng cỏ lồng vực; Nguyễn Lê Vân & cs. (2019) khảo sát 08 giống lúa OM và ghi nhận giống OM5930 có khả năng ức chế trực tiếp, trong khi dịch chiết methanol của OM4498 cho hiệu quả ổn định.
  • Ngô Chí Nam & cs. (2018) nghiên cứu dịch chiết methanol của 06 loài cây họ Cúc (Asteraceae), xác định cây sao nháy (Cosmos bipinnatus) có hàm lượng phenolic tổng số (4,51 mg/g) và flavonoid tổng số (1,58 mg/g) cao nhất, ức chế chiều dài thân và rễ cỏ lồng vực ở nồng độ 1 g/ml lần lượt là 88,15% và 99,99%.
  • Các nghiên cứu khác ghi nhận tiềm năng đối kháng của thân lá dưa leo Cucumis sativus (Ho & cs., 2008), 5 loài cây họ Bìm bìm Convolvulaceae (Trương Trọng Khôi & cs., 2021) và dịch chiết methanol của cỏ đậu phộng (Phan Khánh Linh & cs., 2021).

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Mặc dù đã có một số nghiên cứu bước đầu, song tại Việt Nam chưa có công trình nào đánh giá một cách toàn diện và đồng bộ tiềm năng đối kháng của các loài thực vật như lạc dại (A. pintoi), liêm hồ đằng (C. sicyoides), tơ hồng xanh (C. filiformis), cây gai (B. nivea) và cỏ may (C. aciculatus) xuyên suốt từ quy mô phòng thí nghiệm, nhà lưới đến ngoài đồng ruộng. Đặc biệt, luận án tập trung giải quyết khoảng trống về việc định lượng nồng độ ức chế IC50 của các phân đoạn dịch chiết phân cực khác nhau, xác định hàm lượng phenolic, flavonoid tổng số và phân tích nhận diện thành phần hoạt chất thứ cấp bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) trên các vật liệu triển vọng nhất.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của luận án dựa trên các nguyên lý sinh thái hóa học (chemical ecology) và sinh lý học thực vật:

  • Các con đường giải phóng hoạt chất đối kháng: Dựa trên luận điểm của Rice (1984), Putnam (1985) và Mushtaq & Siddiqui (2018), các hợp chất allelochemicals thâm nhập môi trường thông qua 04 cơ chế: (1) Sự bay hơi vào không khí; (2) Sự rửa trôi từ thân, lá qua nước mưa hoặc sương; (3) Sự tiết dịch qua hệ rễ vào đất; (4) Sự giải phóng thông qua phân hủy tàn dư thực vật dưới tác động của vi sinh vật đất.
  • Cơ chế can thiệp sinh lý - sinh hóa: Các chất đối kháng tác động lên cây nhận thông qua việc làm suy giảm hấp thu khoáng chất và ion (Baar & cs., 1994; Akemo & cs., 2000); ức chế quá trình phân chia tế bào vùng đỉnh rễ; can thiệp cân bằng nội tiết tố thực vật IAA, GA, ethylene, ABA (Chou, 1982; Bogatek & cs., 2003); thay đổi tính thấm màng tế bào (Galindo & cs., 1999); cản trở quang hợp và hô hấp (Baziramakenga & cs., 1994; Batish & cs., 2006); ức chế tổng hợp protein do các axit amin phi protein (Bertin & cs., 2007); và làm biến đổi hoạt tính enzyme catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) cùng sự tích lũy proline (Rice, 1984; Singh & cs., 2009; Hayat & cs., 2012).
  • Khung phân tích tách biệt giữa cạnh tranh tài nguyên (competition) và đối kháng sinh hóa (allelopathy) theo các mô hình sàng lọc sinh học có kiểm soát (Wu & cs., 2000, 2001).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế kết hợp giữa đánh giá sinh học định lượng và phân tích hóa lý:

  • Phương pháp thu thập và xử lý vật liệu: 05 loài thực vật thử nghiệm được thu thập, làm sạch, tách riêng các bộ phận (thân, lá, rễ đối với liêm hồ đằng; thân, lá đối với cây gai), phơi khô tự nhiên trong bóng râm, sấy ở nhiệt độ thích hợp và nghiền mịn thành dạng bột.
  • Thí nghiệm sinh học sàng lọc bột thực vật ở 3 cấp độ:
    1. Phòng thí nghiệm (LAB): Bột các loài cây thử nghiệm được xử lý ở các dải nồng độ (bao gồm các mức 25 g/l và 50 g/l) trong đĩa petri để đánh giá tỷ lệ nảy mầm, chiều dài thân và rễ của các hạt chỉ thị (thóc Oryza sativa, đỗ xanh Vigna radiata, cỏ lồng vực nước E. crus-galli).
    2. Nhà lưới (NL): Thí nghiệm trồng chậu đánh giá sự sinh trưởng mầm cỏ lồng vực nước dưới tác động của bột vật liệu ở các liều lượng khác nhau.
    3. Ngoài đồng ruộng (ĐR): Bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (Randomized Complete Block Design - RCBD) với 03 lần nhắc lại. Đánh giá tác động của bột vật liệu lên sự sinh trưởng của hạt cỏ lồng vực cấy nhân tạo, quần thể cỏ dại mọc tự nhiên và các chỉ tiêu sinh trưởng, năng suất của cây lúa, so sánh đối chứng với công thức không làm cỏ (ĐC), làm cỏ bằng tay (LCBT) và sử dụng thuốc trừ cỏ hóa học (TDC).
  • Phương pháp phân hạng giá trị ức chế trung bình (ƯCTB %): Tổng hợp điểm ức chế sinh trưởng từ các thí nghiệm LAB, NL, ĐR để xếp hạng và chọn lọc các loài có tiềm năng đối kháng cao nhất đưa vào phân tích chuyên sâu.
  • Phương pháp chiết xuất và xác định hoạt tính dịch chiết: Bột thực vật của các loài được chọn lọc được chiết xuất phân đoạn tuần tự bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexan, ethyl acetate (EtOAc) và methanol (MeOH). Đánh giá nồng độ ức chế 50% (IC50) của các cao chiết ở các nồng độ từ 1.000 đến 10.000 ppm đối với sự nảy mầm và sinh trưởng thân, rễ của cỏ lồng vực nước (E. crus-galli) và xà lách (L. sativa).
  • Phương pháp hóa học định lượng:
    • Xác định hàm lượng phenolic tổng số (TPC): Sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu với đường chuẩn gallic acid, đo độ hấp thụ quang (OD), kết quả biểu thị bằng mg Gallic Acid Equivalent trên gam khối lượng khô (mg GAE/g DW).
    • Xác định hàm lượng flavonoid tổng số (TFC): Sử dụng dung dịch chuẩn rutin, kết quả biểu thị bằng mg Rutin Equivalent trên gam khối lượng khô (mg RE/g DW).
    • Đánh giá tương quan tuyến tính giữa hoạt tính đối kháng thực vật với hàm lượng TPC và TFC.
  • Phương pháp phân tích hoạt chất bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS): Phân tích thành phần các hợp chất hữu cơ thứ cấp trong các cao chiết phân đoạn bằng hệ thống Gas Chromatography - Mass Spectrometry, định danh các pic phổ và tính tỷ lệ phần trăm diện tích đỉnh (peak area %).
  • Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê, tính toán giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (SD), sai số thí nghiệm chuẩn (SE).

Nguồn tư liệu và dữ liệu: Số liệu sơ cấp thu thập trực tiếp từ các chuỗi thí nghiệm sinh học, sinh hóa thực hiện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Viện Di truyền Nông nghiệp và Đại học Hiroshima (Nhật Bản) trong thời gian từ 2016 đến 2021.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này trình bày hệ thống hóa cơ sở lý luận về hiện tượng đối kháng thực vật, các nghiên cứu trong và ngoài nước, đặc điểm sinh vật học của các loài cỏ dại hại lúa và các phương pháp sàng lọc tiềm năng đối kháng.

Tác giả luận giải 04 phương thức phát tán chất đối kháng vào môi trường đất - nước - không khí, phân tích các quá trình liên kết gồm sự duy trì, sự chuyển đổi và vận chuyển của hợp chất trong đất (Cheng, 1992). Đồng thời, chương 1 tổng hợp các nghiên cứu về 10 nhóm chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính allelochemicals (khí độc tế bào, axit hữu cơ, axit thơm, lacton đơn không bão hòa, coumarin, quinon, flavonoid, tannin, alkaloid, terpenoid và steroid).

Về thực trạng cỏ dại hại lúa tại Việt Nam, chương 1 dẫn liệu điều tra cho thấy vùng Đồng bằng sông Hồng có 60 loài cỏ dại thuộc 19 họ, trong đó Poaceae chiếm 35% (21 loài) và Cyperaceae chiếm 18% (11 loài) (Chin & Ho, 2010). Tác giả mô tả chi tiết hình thái học và mức độ gây hại của các loài cỏ chính:

  • Cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli): Là đối tượng nguy hại nhất, sinh sản tới 40.000 hạt/cây; ở mật độ 25 cây/m2 làm giảm 50% năng suất lúa, vụ hè thu làm giảm năng suất tới 79,8% và làm lẫn tạp tới 314 hạt cỏ/kg thóc.
  • Cỏ đuôi phụng (Leptochloa chinensis (L.) Nees): Thân bụi, cao tới 1 m, bông dài 10-40 cm, sinh sản hạt mạnh ở ruộng sạ thẳng.
  • Cỏ lông (Brachiaria mutica (Forsk.)): Thân bò cứng, dài tới 6 m, phát hoa chùm tụ tán màu tím.
  • Cỏ cháo (Cyperus difformis L.): Thân 3 cạnh mềm, rễ sợi đỏ, hoa tán bất định có 10-60 bông xòe hình sao.
  • Rau mác bao (Monochoria vaginalis (Burm.) Presl): Bán thủy sinh, thân ngầm, cụm hoa 3-25 bông màu tím.

Chương 1 cũng tổng hợp các phương pháp sàng lọc tiềm năng đối kháng gồm: thử nghiệm dịch chiết đĩa petri, thử nghiệm chậu cát thạch anh 3 giai đoạn của Wu & cs. (2001), phương pháp hộp cây (Plant Box Method - PBM), phương pháp gieo tiếp sức (Relay Seeding Technique - RST), phương pháp thạch ngăn bằng nhau (Equal Compartment Agar Method - ECAM) và thử nghiệm bố trí ngoài đồng ruộng.

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thu thập và chuẩn bị vật liệu của 05 loài thực vật thử nghiệm (A. pintoi, C. sicyoides, C. filiformis, B. nivea, C. aciculatus) cùng các loài nhận (E. crus-galli, O. sativa, V. radiata, L. sativa). Chương này trình bày chi tiết thiết kế thí nghiệm theo từng quy mô:

  • Sàng lọc bột vật liệu: Quy trình đo đếm chiều dài thân mầm, rễ mầm sau thời gian ủ; bố trí chậu nhà lưới; và bố trí ô thí nghiệm đồng ruộng theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD) với diện tích và chế độ chăm sóc đồng nhất.
  • Quy trình chiết xuất: Sơ đồ chiết hồi lưu phân đoạn với dung môi hexane, ethyl acetate và methanol từ mẫu bột khô.
  • Quy trình phân tích hóa học: Đo quang học xác định TPC theo phản ứng tạo phức màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu ở bước sóng đặc trưng; xác định TFC qua phản ứng tạo phức màu nhôm clorid với chuẩn rutin.
  • Quy trình phân tích GC-MS: Thiết lập các thông số nhiệt độ lò, cột mao quản, khí mang heli, chế độ ion hóa EI và đối chiếu khối phổ để định danh các hoạt chất thứ cấp.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 tập trung trình bày các dữ liệu thực nghiệm thu được qua các giai đoạn nghiên cứu:

  1. Đánh giá ảnh hưởng của bột cây thử nghiệm ở 3 điều kiện và phân hạng giá trị ức chế: Bột các mẫu cây thử nghiệm thể hiện mức độ ức chế sinh trưởng khác nhau đối với hạt thóc, đỗ xanh và cỏ lồng vực nước ở nồng độ 25 g/l và 50 g/l. Kết quả phân hạng giá trị ức chế trung bình (ƯCTB) tổng hợp qua các môi trường LAB, NL và ĐR được xác định:
  • Lá gai (Boehmeria nivea): Đạt 54 điểm (xếp hạng cao nhất).
  • Thân gai (Boehmeria nivea): Đạt 46 điểm.
  • Cây lạc dại (Arachis pintoi): Đạt 45 điểm.
  • Các mẫu thân liêm hồ đằng, rễ liêm hồ đằng, lá liêm hồ đằng, cỏ may và tơ hồng xanh đạt điểm phân hạng thấp hơn.

Từ kết quả phân hạng, 03 mẫu có hoạt tính ức chế mạnh nhất là lá gai, thân gai và lạc dại được chọn lựa để tiếp tục chiết xuất phân đoạn và phân tích hóa sinh. Trên đồng ruộng, bột lá gai và lạc dại làm suy giảm rõ rệt mật độ cỏ lồng vực và cỏ tự nhiên, giúp cây lúa sinh trưởng thuận lợi và duy trì năng suất tương đương với công thức làm cỏ bằng tay (LCBT) và dùng thuốc trừ cỏ (TDC).

  1. Khảo sát hoạt tính dịch chiết và xác định nồng độ ức chế 50% (IC50): Thử nghiệm dịch chiết phân đoạn cho thấy hiệu lực ức chế nảy mầm và kéo dài thân, rễ mầm của thực vật chỉ thị phụ thuộc vào bản chất dung môi và liều lượng xử lý (1.000 - 10.000 ppm).
Loài cây thử nghiệm Phân đoạn dịch chiết Thực vật chỉ thị IC50 chiều dài rễ (mg/ml) IC50 chiều dài thân (mg/ml)
Lá gai (B. nivea) Ethyl acetate (EtOAc) Xà lách (L. sativa) 1,19 1,10
Lá gai (B. nivea) Ethyl acetate (EtOAc) Cỏ lồng vực nước (E. crus-galli) 3,96 9,30
Lạc dại (A. pintoi) Hexan Cỏ lồng vực nước (E. crus-galli) 4,08 8,40

Cao chiết ethyl acetate từ lá gai thể hiện hiệu lực ức chế mạnh nhất đối với cỏ lồng vực nước, đạt giá trị IC50 ở chỉ tiêu chiều dài rễ là 3,96 mg/ml và chiều dài thân là 9,30 mg/ml. Đối với cây lạc dại, cao chiết phân đoạn hexan thể hiện hoạt tính mạnh nhất với IC50 rễ đạt 4,08 mg/ml và thân đạt 8,40 mg/ml.

  1. Hàm lượng phenolic tổng số (TPC), flavonoid tổng số (TFC) và tương quan: Kết quả định lượng quang phổ các cao chiết được trình bày trong bảng tổng hợp:
Loài cây và bộ phận Phân đoạn dung môi Hàm lượng TPC (mg GAE/g DW) Hàm lượng TFC (mg RE/g DW)
Thân gai (B. nivea) Ethyl acetate 0,35 0,14
Lá gai (B. nivea) Ethyl acetate 0,05 0,05
Lạc dại (A. pintoi) Methanol 2,67 1,01

Phân tích thống kê cho thấy sự tồn tại của mối tương quan thuận giữa hàm lượng phenolic tổng số, flavonoid tổng số với hoạt tính ức chế đối kháng thực vật trên các cây chỉ thị.

  1. Định danh hoạt chất thứ cấp bằng GC-MS: Phân tích GC-MS trên các phân đoạn cao chiết có hoạt tính cao đã xác định danh tính và tỷ lệ phần trăm diện tích đỉnh của các hợp chất đối kháng:
Mẫu phân tích Nhóm hợp chất chính Hợp chất đối kháng định danh Tỷ lệ diện tích đỉnh (%)
Thân gai (Cao chiết EtOAc) Phenols, Phenolic acids, Fatty acids 2-methoxy-4-vinylphenol 2,83
3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid 0,83
p-Coumaric acid, trans 1,55
n-Decanoic acid (axit capric) 2,00
Lá gai (Cao chiết EtOAc) Phenolic acids, Coumarins, Fatty acids Scopoletin 0,75
Benzeneacetic acid (axit phenylacetic) 2,16
Hexanoic acid 12,04
Pentanoic acid (axit valeric) 12,04
Lạc dại (Cao chiết MeOH) Fatty acids, Fatty acid methyl esters, Pyrroles Hexadecanoic acid, methyl ester 15,23
n-Hexadecanoic acid 10,20
n-Decanoic acid 10,20
Pyrrole 8,13
Lạc dại (Cao chiết Hexan) Fatty acids, Fatty acid methyl esters, Triterpenoids Ethanol, 2-[2-(2-butoxyethoxy) ethoxy]- 0,75
Hexadecanoic acid, methyl ester 24,04
n-Hexadecanoic acid (palmitic acid) 20,03
9,12-Octadecadienoic acid, methyl ester 16,12
Octadecanoic acid (stearic acid) 1,80
n-Decanoic acid 1,80
Stigmasterol 0,83
β-Sitosterol 1,89
Lupeol 1,66
Lạc dại (Cao chiết EtOAc) Pyranones, Benzofurans, Dialkyl ethers, Fatty acids Maltol 1,09
n-Hexadecanoic acid (palmitic acid) 6,43
Benzofuran, 2,3-dihydro- 1,11
Ethanol, 2-[2-(2-butoxyethoxy) ethoxy]- 1,52
Hexanedioic acid, bis(2-ethylhexyl) ester 0,65

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án tự nêu các đóng góp mới về mặt học thuật và thực tiễn:

  1. Về mặt học thuật và phương pháp luận: Lần đầu tiên tại Việt Nam, tính đối kháng thực vật của 05 loài thực vật bậc cao gồm lạc dại (A. pintoi), liêm hồ đằng (C. sicyoides), tơ hồng xanh (C. filiformis), cây gai (B. nivea) và cỏ may (C. aciculatus) được đánh giá một cách hệ thống và đồng bộ trên cả 3 điều kiện: phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng ruộng. Nghiên cứu đã xây dựng thang điểm phân hạng giá trị ức chế trung bình (ƯCTB), từ đó xác định và xếp loại chính xác 03 nguồn vật liệu có tiềm năng ức chế mạnh nhất là lá gai (54 điểm), thân gai (46 điểm) và cây lạc dại (45 điểm).
  2. Về mặt định lượng hoạt tính sinh học: Luận án đã xác định được nồng độ ức chế 50% (IC50) của các phân đoạn dịch chiết phân cực đối với sự nảy mầm và sinh trưởng của cỏ lồng vực nước (E. crus-galli) và xà lách (L. sativa). Trong đó, cao chiết ethyl acetate từ lá gai thể hiện hoạt lực ức chế mạnh nhất đối với cỏ lồng vực nước (IC50 rễ đạt 3,96 mg/ml, thân đạt 9,30 mg/ml), và cao chiết hexan từ lạc dại có IC50 rễ đạt 4,08 mg/ml, thân đạt 8,40 mg/ml.
  3. Về mặt hóa sinh và định danh hoạt chất: Luận án đã cung cấp bộ dẫn liệu khoa học về hàm lượng phenolic tổng số (TPC) và flavonoid tổng số (TFC) của các dịch chiết; đồng thời phát hiện và định danh thành công các hoạt chất thứ cấp đối kháng thực vật bằng phương pháp GC-MS:
    • 04 hợp chất trong cao chiết ethyl acetate của thân gai (thuộc nhóm phenols, phenolic acids, fatty acids).
    • 04 hợp chất trong cao chiết ethyl acetate của lá gai (thuộc nhóm phenolic acids, coumarins, fatty acids, tiêu biểu là scopoletin).
    • 04 hợp chất trong cao chiết methanol của lạc dại (thuộc nhóm fatty acids, fatty acid methyl esters, pyrroles).
    • 09 hợp chất trong cao chiết hexan của lạc dại (thuộc nhóm fatty acids, fatty acid methyl esters, triterpenoids và phytosterols).
    • 05 hợp chất trong cao chiết ethyl acetate của lạc dại (thuộc nhóm pyranones, benzofurans, dialkyl ethers, fatty acid esters).

Kiến nghị và giải pháp đề xuất:

  • Khai thác nguồn sinh khối bột lá gai, thân gai và cây lạc dại làm lớp phủ bề mặt hoặc vùi vào đất trong hệ thống canh tác lúa nhằm ức chế sự nảy mầm và phát triển của cỏ lồng vực nước và cỏ tự nhiên, thay thế một phần thuốc trừ cỏ hóa học.
  • Sử dụng các dữ liệu về cao chiết ethyl acetate từ lá gai và cao chiết hexan từ lạc dại làm căn cứ khoa học để tiếp tục nghiên cứu tinh chế, bán tổng hợp các hoạt chất tự nhiên (như scopoletin, p-coumaric acid, các axit béo mạch dài) phục vụ sản xuất thuốc trừ cỏ sinh học ở quy mô công nghiệp.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

  • Nghiên cứu tập trung khảo nghiệm trên 05 loài thực vật bậc cao thu thập và đánh giá hoạt tính chính trên đối tượng cỏ lồng vực nước (E. crus-galli); chưa mở rộng đánh giá đầy đủ trên các nhóm cỏ dại lá rộng, cỏ cói lác khác xuất hiện phổ biến trên ruộng lúa (như Cyperus difformis, Monochoria vaginalis).
  • Thí nghiệm đồng ruộng chịu sự chi phối của các yếu tố vi khí hậu theo mùa vụ; luận án chưa theo dõi động thái tồn dư, tốc độ phân hủy sinh học và cơ chế di chuyển của các hợp chất đối kháng trong môi trường nước và đất lúa qua nhiều chu kỳ canh tác liên tiếp.
  • Các hợp chất đối kháng mới được nhận diện danh tính và tỷ lệ diện tích đỉnh thông qua phân tích GC-MS trên cao chiết phân đoạn thô; chưa tiến hành phân lập tinh sạch từng hợp chất đơn lẻ để thử nghiệm liều độc độc lập và kiểm chứng tương tác cộng hưởng.

Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Mở rộng khảo sát phổ ức chế của cao chiết lá gai và lạc dại trên nhiều loài cỏ dại nguy hại khác trong các hệ thống cây trồng cạn và ngập nước.
  • Nghiên cứu quy trình công nghệ chiết tách, tinh sạch các hợp chất có tỷ lệ và hoạt tính cao (scopoletin, 2-methoxy-4-vinylphenol, axit palmitic...); đánh giá cơ chế tác động ở mức độ tế bào học và sinh học phân tử.
  • Thử nghiệm bào chế các dạng chế phẩm diệt cỏ sinh học (bioherbicide) thương phẩm, hoàn thiện công thức phụ gia phân tán và đánh giá tác động sinh thái lâu dài đối với hệ vi sinh vật đất.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo chuyên môn cho các nhóm đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Bảo vệ thực vật, Nông học, Sinh lý thực vật và Hóa học các hợp chất tự nhiên: Luận án cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn hóa từ khâu sàng lọc sơ bộ bằng bột thực vật (ở 3 cấp độ phòng thí nghiệm, nhà lưới, đồng ruộng) kết hợp phương pháp phân hạng ƯCTB, đến quy trình chiết xuất phân đoạn, định lượng TPC, TFC và phân tích GC-MS.
  • Giảng viên các trường đại học khối nông nghiệp và sinh học: Tài liệu phục vụ biên soạn bài giảng chuyên đề về quản lý cỏ dại tích hợp (Integrated Weed Management - IWM), sinh thái hóa học và các giải pháp bảo vệ thực vật theo hướng an toàn sinh học.
  • Cán bộ kỹ thuật, nhà quản lý nông nghiệp và doanh nghiệp nông dược: Cung cấp luận cứ khoa học thực nghiệm về tiềm năng thay thế thuốc trừ cỏ hóa học bằng các hợp chất tự nhiên từ cây gai và lạc dại, định hướng chiến lược nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học bảo vệ môi trường nông nghiệp.

Các phần đáng tham khảo nhất trong luận án gồm: quy trình thiết kế thí nghiệm đồng ruộng RCBD đánh giá bột thực vật đối kháng; phương pháp tính toán điểm ức chế trung bình (ƯCTB); và bảng số liệu định danh khối phổ GC-MS các hoạt chất thứ cấp trong cây gai và lạc dại.

Câu hỏi thường gặp

  1. Trong 05 loài thực vật bậc cao thử nghiệm, mẫu vật liệu nào cho hiệu quả ức chế sinh trưởng cao nhất?
  • Dựa trên phương pháp phân hạng giá trị ức chế trung bình (ƯCTB) tổng hợp qua cả 3 môi trường thử nghiệm (phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng ruộng), bột lá gai (Boehmeria nivea) đạt điểm số cao nhất với 54 điểm, tiếp theo là thân gai đạt 46 điểm và cây lạc dại (Arachis pintoi) đạt 45 điểm.
  1. Hoạt tính ức chế của cao chiết ethyl acetate từ lá gai đối với cỏ lồng vực nước được định lượng như thế nào?
  • Cao chiết ethyl acetate từ lá gai có hoạt tính đối kháng mạnh nhất trên cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli), với nồng độ ức chế 50% (IC50) đối với chiều dài rễ mầm là 3,96 mg/ml và đối với chiều dài thân mầm là 9,30 mg/ml. Trên thực vật chỉ thị rau xà lách (Lactuca sativa), giá trị IC50 tương ứng ở chỉ tiêu chiều dài rễ là 1,19 mg/ml và chiều dài thân là 1,10 mg/ml.
  1. Những hợp chất đối kháng nào đã được phân tích và xác định trong cao chiết ethyl acetate của cây gai?
  • Phân tích GC-MS xác định: cao chiết ethyl acetate của thân gai có 04 hợp chất đối kháng gồm 2-methoxy-4-vinylphenol (2,83% diện tích đỉnh), 3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid (0,83%), trans-p-coumaric acid (1,55%) và n-decanoic acid (2,00%). Cao chiết ethyl acetate của lá gai có 04 hợp chất gồm scopoletin (0,75%), benzeneacetic acid (2,16%), hexanoic acid (12,04%) và pentanoic acid (12,04%).
  1. Hàm lượng phenolic tổng số (TPC) và flavonoid tổng số (TFC) trong các mẫu chiết xuất đạt mức độ nào?
  • Cao chiết methanol từ cây lạc dại đạt hàm lượng phenolic tổng số cao nhất là 2,67 mg GAE/g DW và flavonoid tổng số là 1,01 mg RE/g DW. Trong khi đó, cao chiết ethyl acetate từ thân gai có TPC đạt 0,35 mg GAE/g DW và TFC đạt 0,14 mg RE/g DW; cao chiết ethyl acetate từ lá gai có TPC đạt 0,05 mg GAE/g DW và TFC đạt 0,05 mg RE/g DW.
  1. Việc xử lý bột thực vật đối kháng ngoài đồng ruộng có làm giảm năng suất lúa không?
  • Kết quả thí nghiệm ngoài đồng ruộng bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD) cho thấy việc bón bột các cây thử nghiệm (đặc biệt là lá gai, thân gai và lạc dại) có tác dụng ức chế rõ rệt mật độ cỏ lồng vực và cỏ tự nhiên mà không gây hại cho sự sinh trưởng của lúa; năng suất lúa ở các công thức xử lý bột thực vật được bảo tồn ổn định, cao hơn rõ rệt so với đối chứng không làm cỏ và tương đương với công thức làm cỏ bằng tay hoặc sử dụng thuốc diệt cỏ hóa học.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Phan Trung Thắng đã khảo sát có hệ thống tiềm năng đối kháng thực vật của 05 loài thực vật bậc cao tại Việt Nam qua ba môi trường phòng thí nghiệm, nhà lưới và đồng ruộng. Công trình đã xác định được lá gai (Boehmeria nivea), thân gai và cây lạc dại (Arachis pintoi) là những nguồn vật liệu có hoạt tính ức chế cỏ lồng vực nước mạnh nhất, đồng thời định lượng chính xác các chỉ số ức chế IC50, hàm lượng TPC, TFC và xác định cấu phần các chất chuyển hóa thứ cấp bằng GC-MS như scopoletin, trans-p-coumaric acid, 2-methoxy-4-vinylphenol cùng các axit béo. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học thực nghiệm có giá trị, mở ra hướng ứng dụng nguồn sinh khối thực vật tự nhiên và nghiên cứu phát triển chế phẩm trừ cỏ sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp bền vững.