Luận Văn Thạc Sĩ: Đánh Giá Hoạt Tính Chống Béo Phì Và Kháng Viêm Của Vi Sinh Vật Phân Lập Từ Thực Vật

• Tác giả: Hồ Lý Phương
• Người hướng dẫn: TS. Trần Thị Như Hằng
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Đánh Giá Hoạt Tính Chống Béo Phì Và Kháng Viêm Của Vi Sinh Vật Từ Thực Vật
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Nguyên vật liệu
• 2.2.1. Vật liệu thí nghiệm
• 2.2.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phân lập vi sinh vật
• 2.3.2. Lên men và thu dịch chiết
• 2.3.3. Xác định hoạt tính chống oxi hóa
• 2.3.4. Xác định hoạt tính kháng viêm
• 2.3.5. Xác định hoạt tính ức chế lipase
• 2.4. Định danh chủng vi sinh vật
• 2.4.1. Định danh theo hình thái
• 2.4.2. Định danh theo phương pháp phân tử
• 2.5. Kiểm tra độ an toàn của chủng vi sinh vật trong mô hình in vivo
• 2.6. Xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập các vi sinh vật cộng sinh thực vật
• 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa
• 3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm
• 3.3.1. Khả năng gây độc tế bào
• 3.3.2. Khả năng hạn chế sự tổng hợp NO
• 3.4. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế lipase
• 3.5. Kết quả định danh các chủng vi sinh vật
• 3.5.1. Kết quả định danh chủng C1 và C8
• 3.5.2. Kết quả định danh chủng C13
• 3.5.3. Kết quả định danh chủng C20
• 3.6. Kết quả xác định độ an toàn trên động vật thử nghiệm
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Đánh giá hoạt tính chống béo phì

Hoạt tính chống béo phì của vi sinh vật từ thực vật đã được nghiên cứu sâu rộng. Các vi sinh vật này có khả năng ức chế sự tích tụ mỡ trong cơ thể, từ đó giảm nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến béo phì. Nghiên cứu cho thấy rằng một số chủng vi sinh vật có thể làm giảm nồng độ triglyceride và cholesterol trong máu, nhờ vào khả năng ức chế enzyme lipase. Việc xác định các vi sinh vật có hoạt tính này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế sinh học mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị béo phì. Theo một nghiên cứu, các chủng vi sinh vật như Lactobacillus và Bifidobacterium đã cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc giảm mỡ máu và cải thiện tình trạng sức khỏe tổng thể. Điều này chứng tỏ rằng hoạt tính chống béo phì của vi sinh vật từ thực vật có thể được ứng dụng trong việc phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị béo phì.

1.1 Tác động của vi sinh vật đến sự tích tụ mỡ

Vi sinh vật có khả năng tác động đến quá trình chuyển hóa lipid trong cơ thể. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số vi sinh vật có thể làm giảm sự hấp thu lipid từ thực phẩm, từ đó giảm lượng mỡ tích tụ trong cơ thể. Hơn nữa, các vi sinh vật này còn có khả năng sản sinh ra các hợp chất sinh học có tác dụng kháng viêm, giúp cải thiện tình trạng viêm nhiễm liên quan đến béo phì. Việc phân lập và nghiên cứu các chủng vi sinh vật này từ thực vật không chỉ mang lại hiểu biết mới về cơ chế hoạt động của chúng mà còn mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm tự nhiên hỗ trợ điều trị béo phì. Các hợp chất sinh học từ vi sinh vật có thể được sử dụng để phát triển các loại thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe và giảm nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến béo phì.

II. Kháng viêm của vi sinh vật

Kháng viêm là một trong những hoạt tính quan trọng của vi sinh vật từ thực vật. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi sinh vật có thể sản sinh ra các hợp chất có khả năng ức chế sự tổng hợp các yếu tố gây viêm như cytokine và prostaglandin. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc điều trị các bệnh lý liên quan đến viêm, bao gồm viêm khớp, viêm dạ dày và các bệnh lý mãn tính khác. Việc xác định các chủng vi sinh vật có hoạt tính kháng viêm từ thực vật không chỉ giúp phát triển các liệu pháp điều trị mới mà còn có thể ứng dụng trong việc sản xuất thực phẩm chức năng. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng vi sinh vật như Lactobacillus và Bifidobacterium có khả năng làm giảm nồng độ nitric oxide (NO) trong cơ thể, từ đó giảm tình trạng viêm. Điều này chứng tỏ rằng kháng viêm là một trong những hoạt tính quan trọng của vi sinh vật từ thực vật.

2.1 Cơ chế kháng viêm của vi sinh vật

Cơ chế kháng viêm của vi sinh vật từ thực vật chủ yếu thông qua việc ức chế sự tổng hợp các yếu tố gây viêm. Các vi sinh vật này có khả năng sản sinh ra các hợp chất như polysaccharide và peptide có tác dụng kháng viêm. Những hợp chất này có thể tác động lên các tế bào miễn dịch, làm giảm sự sản sinh các cytokine gây viêm. Hơn nữa, một số vi sinh vật còn có khả năng điều chỉnh hoạt động của các tế bào miễn dịch, từ đó giúp giảm tình trạng viêm trong cơ thể. Việc nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ vi sinh vật có hoạt tính kháng viêm không chỉ mang lại lợi ích cho sức khỏe mà còn mở ra hướng đi mới trong việc điều trị các bệnh lý mãn tính.

III. Ứng dụng thực tiễn của vi sinh vật trong điều trị

Việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật từ thực vật trong điều trị béo phì và kháng viêm đang trở thành một xu hướng mới trong y học hiện đại. Các sản phẩm từ vi sinh vật có thể được phát triển thành thực phẩm chức năng, giúp hỗ trợ điều trị và phòng ngừa các bệnh lý liên quan đến béo phì và viêm nhiễm. Hơn nữa, việc sử dụng vi sinh vật tự nhiên không chỉ an toàn mà còn hiệu quả, giúp giảm thiểu các tác dụng phụ so với các phương pháp điều trị truyền thống. Nghiên cứu cho thấy rằng các sản phẩm từ vi sinh vật có thể cải thiện sức khỏe đường ruột, tăng cường hệ miễn dịch và giảm nguy cơ mắc các bệnh lý mãn tính. Điều này chứng tỏ rằng vi sinh vật từ thực vật có tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị mới.

3.1 Tiềm năng phát triển sản phẩm từ vi sinh vật

Tiềm năng phát triển sản phẩm từ vi sinh vật rất lớn, đặc biệt trong lĩnh vực thực phẩm chức năng và dược phẩm. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi sinh vật có thể sản sinh ra nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, từ đó tạo ra các sản phẩm hỗ trợ điều trị hiệu quả. Việc phát triển các sản phẩm này không chỉ giúp cải thiện sức khỏe mà còn mở ra cơ hội kinh doanh mới trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Hơn nữa, việc sử dụng vi sinh vật tự nhiên trong sản xuất sản phẩm cũng giúp bảo vệ môi trường và phát triển bền vững. Do đó, nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật từ thực vật trong điều trị béo phì và kháng viêm là một hướng đi đầy hứa hẹn cho tương lai.

Tổng quan nghiên cứu

Béo phì là một trong những vấn đề sức khỏe cộng đồng ngày càng gia tăng trên toàn cầu, với hơn 700 triệu người mắc bệnh vào năm 2015, trong đó có khoảng 107,7 triệu trẻ em và 603,7 triệu người trưởng thành. Tại Mỹ, béo phì gây ra khoảng 324 nghìn ca tử vong mỗi năm và chiếm tới 7% ngân sách chăm sóc sức khỏe, trở thành nguyên nhân tử vong đứng thứ hai có thể phòng tránh được. Béo phì không chỉ gây ra sự tích tụ mỡ mà còn kích hoạt các phản ứng viêm quá mức, dẫn đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng như tiểu đường, gan nhiễm mỡ không do rượu, bệnh tim mạch và ung thư. Hiện nay, các phương pháp điều trị béo phì như phẫu thuật, thuốc và thay đổi lối sống vẫn còn nhiều hạn chế và tác dụng phụ. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp an toàn và hiệu quả hơn là rất cần thiết.

Vi sinh vật cộng sinh thực vật với sự đa dạng sinh học phong phú và khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học đang được xem là nguồn tiềm năng cho nghiên cứu phát triển thuốc chống béo phì và kháng viêm. Luận văn này tập trung phân lập và đánh giá hoạt tính chống béo phì và kháng viêm của một số chủng vi sinh vật phân lập từ thực vật tại Việt Nam trong mô hình in vitro. Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 10/2021 đến tháng 9/2022 tại Viện Hóa học Các hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả nghiên cứu không chỉ cung cấp dữ liệu khoa học cơ bản về hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật mà còn mở ra hướng ứng dụng tiềm năng trong điều trị các bệnh lý liên quan đến béo phì và viêm nhiễm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai khung lý thuyết chính: lý thuyết về hoạt tính sinh học của hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật cộng sinh thực vật và mô hình bệnh lý béo phì liên quan đến viêm mạn tính. Hợp chất thứ cấp là các phân tử không tham gia trực tiếp vào quá trình chuyển hóa cơ bản nhưng có vai trò quan trọng trong sinh lý và bảo vệ sinh vật, bao gồm peptide, polyketide, alkaloid, flavonoid và steroid. Các hợp chất này có thể ức chế enzyme lipase tuyến tụy, giảm tích tụ triglyceride và điều hòa các cytokine viêm như TNF-α, IL-6, góp phần làm giảm béo phì và viêm nhiễm.

Ba khái niệm chính được sử dụng trong nghiên cứu gồm:

• Vi sinh vật cộng sinh thực vật: vi khuẩn, nấm sống trong hoặc trên thực vật mà không gây hại, có khả năng tổng hợp các hợp chất sinh học.
• Hoạt tính chống béo phì: khả năng ức chế enzyme lipase tuyến tụy, giảm tích tụ mỡ và điều hòa các gene liên quan đến chuyển hóa lipid.
• Hoạt tính kháng viêm: khả năng ức chế sản xuất nitric oxide (NO) và các cytokine viêm trong tế bào đại thực bào RAW 264.7 khi kích thích bằng lipopolysaccharide (LPS).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là 19 chủng vi sinh vật phân lập từ lá chè, chè hoa vàng và rễ cây bần. Vi sinh vật được phân lập bằng phương pháp khử trùng bề mặt và cấy trên các môi trường PDA, LB, ISP. Các chủng được nuôi cấy trong môi trường dịch thể, chiết xuất bằng ethyl acetate để thu dịch chiết thô.

Phân tích hoạt tính sinh học bao gồm:

• Hoạt tính chống oxy hóa: đo khả năng loại bỏ gốc DPPH, tính SC% và SC50.
• Hoạt tính kháng viêm: đánh giá khả năng ức chế sản xuất NO trong tế bào RAW 264.7 kích thích bằng LPS, đồng thời kiểm tra độc tính tế bào bằng phương pháp MTT.
• Hoạt tính ức chế enzyme lipase tuyến tụy: sử dụng p-nitrophenyl butyrate làm cơ chất, đo quang phổ hấp thụ ở 405 nm để tính phần trăm ức chế enzyme.

Định danh vi sinh vật được thực hiện qua quan sát hình thái, phân tích đặc điểm sinh hóa và phương pháp phân tử (khuếch đại và giải trình tự ITS cho nấm, 16S rRNA cho vi khuẩn). Kiểm tra độ an toàn của chủng nấm được tiến hành trên chuột BALB/c bằng tiêm nội phúc mạc và tĩnh mạch, theo dõi sức khỏe trong 10 ngày.

Cỡ mẫu gồm 19 chủng vi sinh vật, mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần để đảm bảo độ tin cậy. Phân tích số liệu sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010 và TableCurve AISN Software.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và định danh vi sinh vật: 19 chủng vi sinh vật được phân lập từ các mẫu thực vật, bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn. Chủng C1 và C8 được định danh là Eurotium cristatum dựa trên trình tự ITS với giá trị bootstrap 1000, có đặc điểm hình thái và sinh hóa tương đồng.

2. Hoạt tính chống oxy hóa: 5 trong 19 dịch chiết có khả năng loại bỏ gốc DPPH trên 50% ở nồng độ 200 µg/mL. Mẫu C1 và C8 có SC% lần lượt là 85,36% và 80,54%, với giá trị SC50 tương ứng 96,07 µg/mL và 121,12 µg/mL. Các mẫu C13 và C20 cũng thể hiện hoạt tính đáng kể với SC% trên 70%. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu trước đây về hoạt tính chống oxy hóa của vi sinh vật cộng sinh thực vật.

3. Hoạt tính kháng viêm: Ở nồng độ 100 µg/mL, dịch chiết C1 ức chế sản xuất NO trong tế bào RAW 264.7 lên đến 61,34%, không gây độc tế bào với tỉ lệ sống trên 89%. Các mẫu khác có hoạt tính thấp hơn hoặc không đáng kể. So sánh với chất đối chứng cardamonin (87,42%), C1 thể hiện tiềm năng kháng viêm tốt trong mô hình in vitro.

4. Hoạt tính ức chế enzyme lipase tuyến tụy: Dịch chiết C1 có khả năng ức chế lipase với tỷ lệ 49,32% ở nồng độ 500 µg/mL, cao nhất trong số các mẫu thử. Các mẫu C8, C13 và C20 có mức ức chế từ 35-41%. Giá trị IC50 của C1 được xác định là 518,46 µg/mL. Mức độ ức chế này cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị béo phì thông qua cơ chế ức chế hấp thu lipid.

Thảo luận kết quả

Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết vi sinh vật cộng sinh thực vật góp phần trung hòa các gốc tự do, giảm stress oxy hóa – một yếu tố quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của béo phì và các bệnh chuyển hóa. Kết quả SC% cao của các mẫu C1, C8, C13 và C20 phù hợp với các nghiên cứu trước đây về hoạt tính chống oxy hóa của chi Eurotium và các chủng xạ khuẩn.

Khả năng ức chế sản xuất NO của dịch chiết C1 cho thấy tiềm năng kháng viêm, phù hợp với vai trò của NO và cytokine trong phản ứng viêm mạn tính liên quan đến béo phì. So sánh với các nghiên cứu về Eurotium amstelodami và các hợp chất peptide từ Streptomyces, kết quả này củng cố cơ sở khoa học cho việc phát triển các chất kháng viêm từ vi sinh vật cộng sinh thực vật.

Hoạt tính ức chế lipase của C1 và một số mẫu khác cho thấy khả năng giảm hấp thu triglyceride, từ đó hạn chế tích tụ mỡ và phát triển béo phì. Mức ức chế gần 50% ở nồng độ 500 µg/mL là kết quả đáng khích lệ, mặc dù còn thấp hơn so với orlistat (90,29%). Giá trị IC50 của C1 cho thấy cần nghiên cứu thêm để tối ưu hóa hoạt tính và xác định cơ chế phân tử.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột so sánh SC%, tỷ lệ ức chế NO và lipase của các mẫu, cũng như bảng tóm tắt đặc điểm định danh và hoạt tính sinh học. So sánh với các nghiên cứu quốc tế cho thấy kết quả phù hợp và bổ sung dữ liệu cho nguồn vi sinh vật tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tiếp tục nghiên cứu phân lập và tinh chế hợp chất hoạt tính cao từ các chủng vi sinh vật có hoạt tính chống béo phì và kháng viêm như C1, nhằm xác định cấu trúc hóa học và cơ chế tác động cụ thể. Thời gian: 12-18 tháng; Chủ thể: nhóm nghiên cứu sinh học thực nghiệm.

2. Mở rộng thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của dịch chiết hoặc hợp chất tinh khiết trong điều trị béo phì và viêm nhiễm. Thời gian: 12 tháng; Chủ thể: phòng thí nghiệm sinh học phân tử và dược lý.

3. Phát triển quy trình lên men và sản xuất dịch chiết quy mô công nghiệp nhằm khai thác tiềm năng ứng dụng trong thực phẩm chức năng hoặc dược phẩm. Thời gian: 24 tháng; Chủ thể: đơn vị công nghệ sinh học và doanh nghiệp.

4. Xây dựng cơ sở dữ liệu về hoạt tính sinh học của vi sinh vật cộng sinh thực vật tại Việt Nam, làm nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo và hợp tác quốc tế. Thời gian: liên tục; Chủ thể: viện nghiên cứu và trường đại học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu sinh học thực nghiệm và vi sinh vật học: có thể sử dụng dữ liệu phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về hợp chất thứ cấp và cơ chế tác động.

2. Chuyên gia công nghệ sinh học và dược phẩm: khai thác tiềm năng vi sinh vật cộng sinh thực vật trong phát triển thuốc chống béo phì và kháng viêm, cũng như sản xuất thực phẩm chức năng.

3. Bác sĩ và chuyên gia y tế: tham khảo các giải pháp điều trị mới dựa trên hoạt tính sinh học tự nhiên, góp phần đa dạng hóa phác đồ điều trị béo phì và các bệnh viêm nhiễm liên quan.

4. Nhà quản lý và hoạch định chính sách y tế: sử dụng kết quả nghiên cứu để định hướng phát triển khoa học công nghệ và ứng dụng y sinh học trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

1. Vi sinh vật cộng sinh thực vật là gì?
   Vi sinh vật cộng sinh thực vật là các vi khuẩn hoặc nấm sống trong hoặc trên thực vật mà không gây hại, có thể tổng hợp các hợp chất sinh học có lợi cho thực vật và con người.

2. Tại sao hoạt tính ức chế lipase lại quan trọng trong điều trị béo phì?
   Lipase tuyến tụy phân giải triglyceride thành acid béo để hấp thu. Ức chế lipase giúp giảm hấp thu chất béo, hạn chế tích tụ mỡ và giảm cân hiệu quả.

3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm trong nghiên cứu là gì?
   Hoạt tính kháng viêm được đánh giá bằng khả năng ức chế sản xuất nitric oxide (NO) trong tế bào đại thực bào RAW 264.7 khi kích thích bằng lipopolysaccharide (LPS).

4. Các chủng vi sinh vật nào có hoạt tính sinh học nổi bật trong nghiên cứu?
   Chủng C1 (Eurotium cristatum) thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm và ức chế lipase cao nhất trong số 19 chủng được phân lập.

5. Nghiên cứu có thể ứng dụng thực tiễn như thế nào?
   Kết quả nghiên cứu mở ra hướng phát triển các sản phẩm thuốc hoặc thực phẩm chức năng từ vi sinh vật cộng sinh thực vật để hỗ trợ điều trị béo phì và các bệnh viêm nhiễm liên quan.

Kết luận

• Phân lập thành công 19 chủng vi sinh vật cộng sinh thực vật, trong đó chủng C1 và C8 được định danh là Eurotium cristatum.
• Dịch chiết C1 có hoạt tính chống oxy hóa cao (SC% 85,36%), ức chế sản xuất NO (61,34%) và ức chế lipase tuyến tụy (49,32%).
• Giá trị IC50 ức chế lipase của C1 là 518,46 µg/mL, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị béo phì.
• Nghiên cứu cung cấp dữ liệu khoa học cơ bản về hoạt tính sinh học của vi sinh vật cộng sinh thực vật tại Việt Nam, làm nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo.
• Đề xuất mở rộng nghiên cứu phân lập hợp chất tinh khiết, thử nghiệm in vivo và phát triển quy trình sản xuất công nghiệp.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp hợp tác để phát triển các sản phẩm ứng dụng từ vi sinh vật cộng sinh thực vật, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị béo phì và các bệnh viêm nhiễm liên quan.