Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét Plasmodium spp. và Hướng Ứng Dụng

• Tác giả: Trần Minh Quí
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Tiến Thắng
• Trường học: Trường Đại Học Công Nghệ TP. HCM
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét Plasmodium spp. và Hướng Ứng Dụng
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.4. Ý nghĩa khoa học
• 1.5. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.6. Tổng quan về bệnh sốt rét
• 1.6.1. Lịch sử phát hiện bệnh sốt rét
• 1.6.2. Định nghĩa bệnh sốt rét
• 1.6.3. Sơ lược về dịch tể học sốt rét
• 1.6.4. Tình hình dịch tể sốt rét trên thế giới
• 1.6.5. Tình hình dịch tể sốt rét tại Việt Nam
• 1.6.6. Tình hình dịch tể sốt rét tỉnh Bình Phước
• 1.6.7. Chu kỳ và hình thể của ký sinh trùng sốt rét
• 1.6.7.1. Giai đoạn phát triển trong cơ thể người
• 1.6.7.2. Giai đoạn phát triển trong cơ thể muỗi
• 1.6.8. Tình hình kháng thuốc hiện nay của ký sinh trùng sốt rét
• 1.6.8.1. Định nghĩa kháng thuốc
• 1.6.8.2. Trên thế giới
• 1.6.8.3. Tại Việt Nam
• 1.6.9. Tình hình nghiên cứu, bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét trên thế giới và Việt Nam
• 1.6.9.1. Trên thế giới
• 1.7. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.7.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài
• 1.7.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 1.7.2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.7.2.2. Thiết kế nghiên cứu
• 1.7.2.3. Phương pháp phân tích mẫu
• 1.7.2.3.1. Phát hiện KST Plasmodium spp. bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa
• 1.7.2.3.2. Xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật Nested – PCR
• 1.7.2.3.2.1. Giới thiệu khái quát về kỹ thuật PCR và phương pháp phát hiện KST SR bằng kỹ thuật PCR
• 1.7.2.3.2.2. Kỹ thuật tách chiết DNA KST SR Plasmodium spp.
• 1.7.2.3.2.3. Kỹ thuật Nested – PCR phát hiện KST SR
• 1.7.2.3.2.4. Kỹ thuật Nested – PCR để phát hiện điểm đột biến K13 liên quan đến kháng artemisinin
• 1.7.2.3.3. Đọc kết quả điện di
• 1.7.2.3.4. Xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật giải trình tự
• 1.7.2.3.4.1. Kỹ thuật tinh sạch sản phẩm DNA để giải trình tự
• 1.7.2.3.4.2. Kỹ thuật PCR giải trình tự
• 1.7.2.3.4.3. Phân tích kết quả giải trình tự
• 1.7.2.3.5. Kỹ thuật cất đông chủng ký sinh trùng sốt rét
• 1.7.2.3.6. Kỹ thuật nuôi cấy dài ngày để tạo chủng Plasmodium spp.
• 1.7.2.3.6.1. Kỹ thuật nuôi cấy chủng P.
• 1.7.2.3.6.2. Kỹ thuật nuôi cấy chủng P.
• 1.7.2.3.7. Môi trường nuôi cấy
• 1.7.2.3.8. Chuẩn bị hồng cầu lành
• 1.7.2.3.9. Chuẩn bị huyết thanh nuôi cấy
• 1.7.2.3.10. Phá đông chủng KST SR Plasmodium spp.
• 1.7.2.3.11. Điều kiện nuôi cấy
• 1.7.2.3.11.1. Điều kiện nuôi cấy in vitro Plasmodium spp.
• 1.7.2.3.11.2. Điều kiện trong lấy mẫu tại thực địa
• 1.7.2.3.12. Thống kê và xử lý số liệu
• 1.8. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 1.8.1. Kết quả xác thu thập mẫu và xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa
• 1.8.2. Kết quả xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật Nested – PCR
• 1.8.3. Kết quả giải trình tự Plasmodium spp.
• 1.8.4. Kết quả giải trình tự kháng K13
• 1.8.5. Kết quả nuôi cấy chủng Plasmodium spp. thuần bằng phương pháp nuôi cấy trong phòng nuôi cấy tại phòng thí nghiệm
• 1.8.6. Kết quả bảo tồn chủng sốt rét Plasmodium spp. và phát hiện kháng K13 liên quan đến kháng artemisinin
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Về Ký Sinh Trùng Sốt Rét Plasmodium spp

Bệnh sốt rét do ký sinh trùng Plasmodium spp. gây ra, phổ biến ở vùng nhiệt đới. Bệnh lây truyền qua muỗi Anopheles. Hiện có 5 loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale, và P. knowlesi. P. falciparum và P. vivax là phổ biến nhất. Dù số ca bệnh giảm, sốt rét vẫn là vấn đề y tế toàn cầu, ảnh hưởng đến sức khỏe và kinh tế. Hàng năm, có hàng triệu ca mắc và tử vong, đặc biệt ở phụ nữ mang thai và trẻ em. WHO ước tính 40% dân số thế giới sống trong vùng nguy cơ. Việt Nam có khoảng 16% dân số sống trong vùng sốt rét lưu hành. Theo báo cáo, năm 2013 có 35.406 ca sốt rét, trong đó 17.128 ca nhiễm ký sinh trùng sốt rét và 6 ca tử vong.

1.1. Lịch Sử Phát Hiện và Dịch Tễ Học Bệnh Sốt Rét

Sốt rét là bệnh truyền nhiễm lâu đời, ảnh hưởng đến nhân loại. Dịch tễ học sốt rét phức tạp, liên quan đến vòng đời ký sinh trùng sốt rét, vector truyền bệnh sốt rét (muỗi Anopheles), và yếu tố môi trường. Tình hình dịch tễ sốt rét khác nhau giữa các khu vực trên thế giới và Việt Nam. Cần hiểu rõ dịch tễ học để kiểm soát và phòng ngừa bệnh hiệu quả. Theo tài liệu gốc, năm 2013, Việt Nam có 14,4 triệu người sống trong vùng sốt rét lưu hành.

1.2. Chu Kỳ Phát Triển Của Ký Sinh Trùng Sốt Rét

Vòng đời ký sinh trùng sốt rét phức tạp, gồm giai đoạn phát triển trong cơ thể người và muỗi. Trong cơ thể người, ký sinh trùng xâm nhập tế bào gan và hồng cầu, gây bệnh. Trong cơ thể muỗi, ký sinh trùng phát triển và lây truyền sang người khác khi muỗi đốt. Hiểu rõ chu kỳ này giúp xác định các điểm can thiệp để ngăn chặn sự lây lan của bệnh. Các giai đoạn phát triển trong cơ thể người bao gồm giai đoạn vô tính ở gan và giai đoạn hữu tính ở máu.

II. Thách Thức Sự Kháng Thuốc Của Ký Sinh Trùng Sốt Rét

Sự kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét là thách thức lớn trong điều trị và kiểm soát bệnh. Ký sinh trùng phát triển khả năng kháng lại các loại thuốc điều trị, làm giảm hiệu quả điều trị và tăng nguy cơ bệnh nặng và tử vong. Tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng trên toàn thế giới và Việt Nam, đòi hỏi phải có các biện pháp đối phó hiệu quả. Áp lực điều trị thuốc SR tăng, di biến động dân từ vùng dịch tể SR diễn biến phức tạp,. làm cho tình trạng kháng thuốc sốt rét ngày càng tăng cao, gia tăng nguy cơ thành dịch SR.

2.1. Tình Hình Kháng Thuốc Sốt Rét Trên Thế Giới

Kháng thuốc sốt rét là vấn đề toàn cầu, đặc biệt ở khu vực Đông Nam Á và châu Phi. Ký sinh trùng đã phát triển khả năng kháng lại nhiều loại thuốc, bao gồm chloroquine, sulfadoxine-pyrimethamine, và artemisinin. Kháng artemisinin là mối lo ngại lớn, đe dọa hiệu quả của các phác đồ điều trị hiện tại. Cần tăng cường giám sát và nghiên cứu để phát hiện và đối phó với tình trạng kháng thuốc.

2.2. Kháng Thuốc Sốt Rét Tại Việt Nam Thực Trạng và Giải Pháp

Việt Nam cũng đối mặt với thách thức kháng thuốc sốt rét. Ký sinh trùng đã phát triển khả năng kháng lại một số loại thuốc, gây khó khăn cho điều trị. Cần tăng cường giám sát kháng thuốc, sử dụng thuốc hợp lý, và nghiên cứu phát triển các loại thuốc mới. Theo tài liệu, tình trạng kháng thuốc sốt rét ngày càng tăng cao, gia tăng nguy cơ thành dịch SR.

2.3. Cơ Chế Kháng Thuốc Của Ký Sinh Trùng Plasmodium spp.

Cơ chế kháng thuốc của ký sinh trùng Plasmodium spp. phức tạp, liên quan đến nhiều yếu tố di truyền và sinh học. Đột biến gen là một trong những cơ chế chính, làm thay đổi cấu trúc protein mục tiêu của thuốc hoặc tăng cường khả năng đào thải thuốc ra khỏi tế bào ký sinh trùng. Nghiên cứu cơ chế kháng thuốc giúp phát triển các loại thuốc mới và các biện pháp đối phó hiệu quả.

III. Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét Phương Pháp In Vitro

Bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét là cần thiết để phục vụ nghiên cứu và phát triển các biện pháp phòng chống bệnh. Bảo tồn in vitro là phương pháp nuôi cấy ký sinh trùng trong phòng thí nghiệm, giúp duy trì nguồn ký sinh trùng ổn định và có thể sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. Phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật và trang thiết bị chuyên dụng. Với mong muốn tạo tiền đề cho việc thành lập thư viện Genenome, thư viện chủng KST SR để phục vụ cho công tác nghiên cứu về các kỹ thuật chuyên sâu trong chuẩn đoán và điều trị bệnh SR và phát triển vaccine kháng sốt rét sau này.

3.1. Nuôi Cấy Ký Sinh Trùng Sốt Rét Kỹ Thuật và Ứng Dụng

Nuôi cấy ký sinh trùng sốt rét là kỹ thuật quan trọng trong bảo tồn in vitro. Kỹ thuật này cho phép tạo ra số lượng lớn ký sinh trùng để nghiên cứu, thử nghiệm thuốc, và phát triển vaccine. Có nhiều phương pháp nuôi cấy khác nhau, tùy thuộc vào loài ký sinh trùng và mục đích nghiên cứu. Theo tài liệu, phương pháp nuôi bình nến của Trager và Jensen (1976) được sử dụng với hồng cầu người, môi trường RPMI 1640, 10% huyết thanh AB trong điều kiện nồng độ 5% CO2 và O2 thấp, ở nhiệt độ 37°C.

3.2. Bảo Quản Lạnh Ký Sinh Trùng Cryopreservation Plasmodium

Bảo quản lạnh ký sinh trùng (cryopreservation) là phương pháp bảo tồn dài hạn, giúp duy trì ký sinh trùng trong điều kiện đông lạnh sâu. Phương pháp này sử dụng nitơ lỏng để làm lạnh ký sinh trùng xuống nhiệt độ rất thấp, ngăn chặn sự phân hủy và duy trì khả năng sống sót của ký sinh trùng khi rã đông. Bảo quản lạnh là công cụ quan trọng trong ngân hàng ký sinh trùng.

IV. Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét Phương Pháp In Vivo

Bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét không chỉ dừng lại ở bảo tồn in vitro, mà còn bao gồm bảo tồn in vivo. Bảo tồn in vivo là phương pháp duy trì ký sinh trùng trong cơ thể vật chủ sống, thường là động vật thí nghiệm. Phương pháp này giúp duy trì tính đa dạng di truyền và đặc tính sinh học của ký sinh trùng. Việc tìm kiếm KST SR để phục vụ nghiên cứu gặp nhiều khó khăn; trong khi đó các nghiên cứu, thử nghiệm đánh giá đáp ứng thuốc điều trị bệnh sốt rét của KST SR có vai trò rất quan trọng việc loại trừ SR.

4.1. Mô Hình Nghiên Cứu Sốt Rét Trên Động Vật

Mô hình nghiên cứu sốt rét trên động vật là công cụ quan trọng trong bảo tồn in vivo. Chuột nhiễm sốt rét là mô hình phổ biến, được sử dụng để nghiên cứu bệnh sinh, thử nghiệm thuốc, và phát triển vaccine. Các mô hình động vật khác cũng được sử dụng, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu. Cần lựa chọn mô hình phù hợp để đảm bảo tính chính xác và tin cậy của kết quả.

4.2. Duy Trì Ký Sinh Trùng Sốt Rét Trong Vật Chủ

Duy trì ký sinh trùng sốt rét trong vật chủ đòi hỏi kỹ thuật và chăm sóc đặc biệt. Cần theo dõi sức khỏe của vật chủ, kiểm soát mật độ ký sinh trùng, và ngăn ngừa các bệnh nhiễm trùng khác. Việc duy trì ký sinh trùng trong vật chủ giúp bảo tồn tính đa dạng di truyền và đặc tính sinh học của ký sinh trùng.

V. Ứng Dụng Nghiên Cứu Phân Tích Di Truyền Ký Sinh Trùng

Phân tích di truyền ký sinh trùng là công cụ mạnh mẽ để nghiên cứu ký sinh trùng sốt rét. Phân tích di truyền giúp xác định loài ký sinh trùng, đánh giá tính đa dạng di truyền, và phát hiện các gen liên quan đến kháng thuốc và độc lực. Kết quả phân tích di truyền có thể được sử dụng để phát triển các biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả hơn. Đề tài được thực hiện với nhiều phương pháp khác nhau từ các kỹ thuật truyền thống (Giêm – sa) cho đến áp dụng các kỹ thuật hiện đại (sinh học phân tử) trong chuẩn đoán ký sinh trùng sốt rét, đồng thời áp dụng kỹ thuật giải trình tự để xác định trình tự đoạn Gene đặc trưng của từng loài KST SR đ...

5.1. Đánh Giá Tính Đa Dạng Di Truyền Của Plasmodium spp.

Đánh giá tính đa dạng di truyền của Plasmodium spp. là quan trọng để hiểu rõ sự tiến hóa và lây lan của ký sinh trùng. Tính đa dạng di truyền ảnh hưởng đến khả năng thích nghi của ký sinh trùng với môi trường và khả năng kháng thuốc. Đánh giá tính đa dạng di truyền giúp dự đoán và đối phó với các thách thức trong phòng chống bệnh.

5.2. Phát Hiện Đột Biến Gen Kháng Thuốc Sốt Rét

Phát hiện đột biến gen kháng thuốc sốt rét là cần thiết để giám sát và đối phó với tình trạng kháng thuốc. Các kỹ thuật phân tích di truyền cho phép xác định các đột biến gen liên quan đến kháng thuốc, giúp lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp và ngăn chặn sự lây lan của ký sinh trùng kháng thuốc. Theo tài liệu, đột biến C580Y có tần suất xuất hiện cao ở Bình Phước, cũng như trong các nghiên cứu khác ở khu vực Cam-pu-chia, Myanmar đã được công bố.

VI. Kết Luận Tầm Quan Trọng Của Bảo Tồn Ký Sinh Trùng Sốt Rét

Bảo tồn ký sinh trùng sốt rét là cần thiết để phục vụ nghiên cứu, phát triển các biện pháp phòng chống bệnh, và bảo tồn đa dạng sinh học. Các phương pháp bảo tồn in vitro và in vivo đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì nguồn ký sinh trùng ổn định và có thể sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. Cần tăng cường đầu tư và hợp tác để phát triển các chương trình bảo tồn ký sinh trùng sốt rét hiệu quả. Bên cạnh đó, việc bảo tồn chủng KST SR tại phòng thí nghiệm, cũng góp phần duy trì nguồn chủng KST, Gene trong điều kiện KST SR đang giảm mạnh như hiện nay.

6.1. Ngân Hàng Ký Sinh Trùng Xây Dựng và Phát Triển

Ngân hàng ký sinh trùng là cơ sở quan trọng để bảo tồn và cung cấp ký sinh trùng cho nghiên cứu. Xây dựng và phát triển ngân hàng ký sinh trùng đòi hỏi đầu tư về cơ sở vật chất, trang thiết bị, và nhân lực. Ngân hàng ký sinh trùng cần tuân thủ các tiêu chuẩn quốc tế để đảm bảo chất lượng và an toàn.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Về Ký Sinh Trùng Sốt Rét

Nghiên cứu về ký sinh trùng sốt rét cần tập trung vào các lĩnh vực như phát triển vaccine, thuốc mới, và các biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả hơn. Nghiên cứu cơ chế kháng thuốc, đánh giá tính đa dạng di truyền, và tìm hiểu tương tác giữa ký sinh trùng và vật chủ là những hướng đi quan trọng. Việc bảo tồn chủng KST SR cũng có vai trò quan trọng trong việc cung cấp chứng dương cho các kỹ thuật sinh học phân tử, cung cấp mẫu cho công tác nghiên cứu tạo vaccine, kháng thuốc sốt rét, tiêu bản mẫu hình thể KST SR trong công tác đào tạo nguồn nhân lực y tế.

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh sốt rét do ký sinh trùng Plasmodium spp. gây ra là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến tại các quốc gia nhiệt đới, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng và kinh tế xã hội. Theo ước tính của WHO, hàng năm có khoảng 350 - 500 triệu người mắc sốt rét trên toàn cầu, với hơn 1 triệu ca tử vong, trong đó trẻ em dưới 5 tuổi chiếm tới 86% số ca tử vong. Tại Việt Nam, năm 2013 có khoảng 14,4 triệu người sống trong vùng sốt rét lưu hành, với hơn 35.000 ca mắc được ghi nhận, trong đó 60% do Plasmodium falciparum gây ra. Tỉnh Bình Phước được xác định là điểm nóng sốt rét của khu vực Nam Bộ với tỷ lệ ký sinh trùng sốt rét chiếm gần 20% tổng số ca cả nước năm 2015.

Mặc dù tỷ lệ mắc sốt rét tại Việt Nam đã giảm mạnh trong những thập kỷ gần đây, song tình trạng kháng thuốc của ký sinh trùng, đặc biệt là kháng artemisinin, đang gia tăng, gây khó khăn cho công tác điều trị và phòng chống. Do đó, việc bảo tồn nguồn chủng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp. là rất cần thiết để phục vụ nghiên cứu, phát triển thuốc và vaccine mới.

Luận văn tập trung vào việc thu thập, nuôi cấy, bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét tại tỉnh Bình Phước trong giai đoạn từ tháng 2 đến tháng 8 năm 2017. Mục tiêu chính là xây dựng ngân hàng gene ký sinh trùng sốt rét, bảo tồn chủng trong điều kiện nitơ lỏng và giải trình tự gene đặc trưng nhằm hỗ trợ các nghiên cứu sâu hơn về dịch tễ, kháng thuốc và phát triển phương pháp điều trị hiệu quả.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về sinh học ký sinh trùng sốt rét, bao gồm:

• Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng Plasmodium spp.: Gồm giai đoạn vô tính trong cơ thể người và giai đoạn hữu tính trong muỗi Anopheles, với các thể phát triển như thể nhẫn, thể tư dưỡng, thể phân liệt và giao bào.
• Kháng thuốc sốt rét: Định nghĩa và cơ chế kháng thuốc, đặc biệt là đột biến gene K13 cánh quạt liên quan đến kháng artemisinin, được xem là dấu ấn phân tử quan trọng trong giám sát kháng thuốc.
• Kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và nghiên cứu ký sinh trùng sốt rét: Sử dụng kỹ thuật Nested-PCR để định danh loài ký sinh trùng và giải trình tự gene 18S Ribosome bảo tồn, cũng như phát hiện đột biến gene kháng thuốc.

Các khái niệm chính bao gồm: ký sinh trùng sốt rét, gene 18S Ribosome, đột biến K13, kỹ thuật Nested-PCR, nuôi cấy ký sinh trùng, bảo tồn chủng trong nitơ lỏng.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 30 mẫu máu dương tính với ký sinh trùng sốt rét được thu thập tại tỉnh Bình Phước, vùng dịch tễ sốt rét lưu hành nặng của khu vực Nam Bộ.
• Phương pháp chọn mẫu: Mẫu được lấy từ bệnh nhân có triệu chứng sốt rét và xác định dương tính bằng kỹ thuật nhuộm Giêm – sa.
• Phương pháp phân tích:
  • Xác định loài ký sinh trùng bằng kỹ thuật Nested-PCR với độ nhạy cao (0,1 KST/µl máu).
  • Giải trình tự gene 18S Ribosome đặc trưng cho từng loài Plasmodium spp.
  • Phát hiện đột biến gene K13 liên quan đến kháng artemisinin bằng Nested-PCR và giải trình tự.
  • Nuôi cấy ký sinh trùng Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax trong phòng thí nghiệm theo phương pháp bình nến của Trager và Jensen (1976) với môi trường RPMI 1640, 10% huyết thanh AB, điều kiện 5% CO2, nhiệt độ 37°C.
  • Bảo tồn chủng ký sinh trùng trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -196°C.
• Timeline nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 2 đến tháng 8 năm 2017 tại Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng TP. Hồ Chí Minh.

Cỡ mẫu 30 bệnh nhân được lựa chọn nhằm đảm bảo tính đại diện cho vùng dịch tễ, đồng thời phù hợp với khả năng phân tích và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Xác định loài ký sinh trùng sốt rét: Tất cả 30 mẫu máu dương tính với ký sinh trùng sốt rét được xác định bằng kỹ thuật Nested-PCR, trong đó chủ yếu là Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax. Tỷ lệ mẫu nhiễm P. falciparum chiếm khoảng 47%, P. vivax chiếm 53%.

2. Đột biến gene K13 liên quan đến kháng artemisinin: Trong 14 chủng P. falciparum đơn thuần được phân lập, có 9 chủng (64,3%) phát hiện đột biến K13 cánh quạt. Các điểm đột biến gồm: C447G (7,1%), I543T (7,1%), P553L (21,4%) và C580Y (28,6%). Đột biến C580Y có tần suất xuất hiện cao nhất, tương đồng với các nghiên cứu tại Campuchia và Myanmar.

3. Nuôi cấy và bảo tồn chủng ký sinh trùng: Các chủng P. falciparum và P. vivax được nuôi cấy thành công trong phòng thí nghiệm, tạo chủng thuần phục vụ nghiên cứu. Chủng được bảo tồn ổn định trong nitơ lỏng, đảm bảo nguồn vật liệu nghiên cứu lâu dài.

4. So sánh tỷ lệ đột biến K13 với các vùng khác: Tỷ lệ đột biến K13 tại Bình Phước tương đương hoặc cao hơn so với các vùng dịch tễ sốt rét khác trong tiểu vùng sông Mê Kông, cho thấy nguy cơ lan rộng kháng thuốc artemisinin tại khu vực này.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự hiện diện phổ biến của các đột biến gene K13 liên quan đến kháng artemisinin trong chủng P. falciparum tại Bình Phước, phản ánh tình trạng kháng thuốc đang gia tăng tại điểm nóng sốt rét này. Việc nuôi cấy thành công các chủng ký sinh trùng và bảo tồn trong nitơ lỏng tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng thuốc, phát triển thuốc mới và vaccine.

So với các nghiên cứu trước đây, tỷ lệ đột biến C580Y tại Bình Phước cao hơn, đồng thời sự đa dạng các điểm đột biến cho thấy sự biến đổi gen phức tạp của ký sinh trùng, đòi hỏi giám sát chặt chẽ và cập nhật thường xuyên. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ các đột biến K13 và bảng so sánh tỷ lệ kháng thuốc giữa các vùng.

Việc xây dựng ngân hàng gene và bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét là bước tiến quan trọng, góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu và phòng chống sốt rét hiệu quả trong bối cảnh dịch bệnh có xu hướng giảm nhưng nguy cơ kháng thuốc tăng cao.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tăng cường giám sát kháng thuốc: Thực hiện giám sát định kỳ các đột biến gene K13 tại các vùng sốt rét lưu hành, đặc biệt tại các điểm nóng như Bình Phước, nhằm phát hiện sớm và ngăn chặn sự lan rộng của chủng kháng thuốc. Thời gian thực hiện: hàng năm; chủ thể: Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng, Sở Y tế địa phương.

2. Phát triển ngân hàng gene và bảo tồn chủng: Mở rộng quy mô thu thập, nuôi cấy và bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét tại các vùng dịch tễ trọng điểm, đảm bảo nguồn vật liệu nghiên cứu đa dạng và ổn định. Thời gian: 2-3 năm; chủ thể: Viện nghiên cứu, các trường đại học chuyên ngành.

3. Nâng cao năng lực kỹ thuật sinh học phân tử: Đào tạo chuyên sâu cho cán bộ y tế và nghiên cứu viên về kỹ thuật Nested-PCR, giải trình tự gene và phân tích dữ liệu để nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán và nghiên cứu kháng thuốc. Thời gian: liên tục; chủ thể: Bộ Y tế, các viện nghiên cứu.

4. Phối hợp nghiên cứu đa ngành: Tăng cường hợp tác giữa các cơ quan y tế, viện nghiên cứu và cộng đồng để phát triển các giải pháp phòng chống sốt rét hiệu quả, bao gồm phát triển thuốc mới, vaccine và các biện pháp kiểm soát véc tơ. Thời gian: dài hạn; chủ thể: Bộ Y tế, các tổ chức quốc tế.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Y học nhiệt đới: Luận văn cung cấp dữ liệu thực nghiệm về bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét, kỹ thuật nuôi cấy và phân tích gene, hỗ trợ nghiên cứu chuyên sâu về sinh học phân tử và dịch tễ học.

2. Cán bộ y tế và chuyên gia phòng chống sốt rét: Thông tin về tình hình kháng thuốc và các đột biến gene giúp xây dựng chiến lược điều trị và giám sát hiệu quả, nâng cao năng lực chẩn đoán và xử lý ca bệnh.

3. Các tổ chức quốc tế và cơ quan quản lý y tế: Cung cấp cơ sở khoa học cho việc hoạch định chính sách phòng chống sốt rét, đặc biệt trong bối cảnh kháng thuốc gia tăng tại khu vực Đông Nam Á.

4. Nhà phát triển thuốc và vaccine: Dữ liệu về gene và chủng ký sinh trùng được bảo tồn là nguồn nguyên liệu quý giá để nghiên cứu phát triển thuốc mới và vaccine phòng sốt rét.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét?
   Bảo tồn chủng giúp duy trì nguồn vật liệu nghiên cứu ổn định, phục vụ cho các nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh, kháng thuốc và phát triển thuốc, vaccine mới. Ví dụ, các chủng được bảo tồn có thể được sử dụng để thử nghiệm hiệu lực thuốc trong phòng thí nghiệm.

2. Kỹ thuật Nested-PCR có ưu điểm gì trong chẩn đoán sốt rét?
   Nested-PCR có độ nhạy cao (phát hiện được 0,1 ký sinh trùng/µl máu) và độ đặc hiệu gần như tuyệt đối, giúp xác định chính xác loài ký sinh trùng, đặc biệt trong trường hợp nhiễm hỗn hợp hoặc mật độ ký sinh trùng thấp.

3. Đột biến gene K13 ảnh hưởng thế nào đến điều trị sốt rét?
   Đột biến K13 làm giảm hiệu quả của thuốc artemisinin, dẫn đến chậm làm sạch ký sinh trùng và tăng nguy cơ thất bại điều trị. Ví dụ, đột biến C580Y được ghi nhận phổ biến tại Bình Phước và các nước lân cận, liên quan đến kháng thuốc nghiêm trọng.

4. Phương pháp nuôi cấy ký sinh trùng sốt rét trong phòng thí nghiệm có khó khăn gì?
   Nuôi cấy đòi hỏi điều kiện môi trường nghiêm ngặt như nhiệt độ, nồng độ khí CO2, O2 và môi trường dinh dưỡng phù hợp. Việc duy trì chủng thuần lâu dài cũng gặp thách thức do ký sinh trùng dễ bị biến đổi hoặc chết.

5. Làm thế nào để phòng chống sự lan rộng của ký sinh trùng kháng thuốc?
   Cần phối hợp giám sát chặt chẽ, sử dụng thuốc phối hợp có hiệu quả, tránh sử dụng đơn liều artemisinin, đồng thời tăng cường các biện pháp kiểm soát véc tơ và nâng cao nhận thức cộng đồng về phòng chống sốt rét.

Kết luận

• Đã thu thập và xác định thành công 30 mẫu ký sinh trùng sốt rét tại tỉnh Bình Phước, với tỷ lệ nhiễm P. falciparum và P. vivax gần như cân bằng.
• Phát hiện 64,3% chủng P. falciparum có đột biến gene K13 liên quan đến kháng artemisinin, trong đó đột biến C580Y chiếm tỷ lệ cao nhất.
• Nuôi cấy và bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét thành công trong phòng thí nghiệm, tạo nguồn vật liệu nghiên cứu quý giá.
• Kết quả góp phần xây dựng ngân hàng gene ký sinh trùng sốt rét, hỗ trợ nghiên cứu phát triển thuốc và vaccine mới.
• Đề xuất tăng cường giám sát kháng thuốc, mở rộng bảo tồn chủng và nâng cao năng lực kỹ thuật sinh học phân tử trong công tác phòng chống sốt rét.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các cơ quan y tế và viện nghiên cứu triển khai giám sát đột biến gene K13 định kỳ, đồng thời phát triển các dự án nghiên cứu ứng dụng bảo tồn chủng trong điều trị và phòng chống sốt rét. Để biết thêm chi tiết và hợp tác nghiên cứu, liên hệ Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng TP. Hồ Chí Minh.