Xây Dựng Vectơ Dựa Trên Thực Vật CD2v Từ Virus Dịch Tả Lợn Châu Phi

• Tác giả: Vu Duy Thai Son
• Người hướng dẫn: Assoc. Pham Bich Ngoc
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Xây Dựng Vectơ Dựa Trên Thực Vật CD2v Từ Virus Dịch Tả Lợn Châu Phi Và Phát Hiện Biểu Hiện Tạm Thời Của Protein CD2v Trong Nicotiana Benthamiana
• Loại tài liệu: Graduation Thesis
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hanoi

• STATEMENT OF ORIGINAL AUTHORSHIP
• ACKNOWLEDGEMENTS
• TABLE OF CONTENT
• LIST OF ABBREVIATION
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• ABSTRACT
• 1. INTRODUCTION
• 2. GENERAL REVIEW
• 2.1. Animal diseases are now putting a threat to animal health, food safety, national economy and environment
• 2.2. African swine fever virus
• 2.2.1. Molecular biology of virus
• 2.2.2. Transmission and dangerous effect of the ASFV
• 3. MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Vectors and genes
• 3.2. Bacteria and plant
• 3.3. Chemicals agents and technique machines
• 3.4. Amplification of the EP402R gene encoding the CD2V protein of the ASFV virus
• 3.5. DNA purification method
• 3.6. Plasmid extraction method .coli XLI Blue by heat shock method
• 3.7. Transformation into AGL1 by electroporation method
• 3.8. Colony PCR method
• 3.9. Transient expression of recombinant protein in the leaf of N. benthamiana by Agro-Infiltration methods
• 3.10. Test the transient expression of CD2V protein by Western blot
• 4. RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Amplification of the EP402R gene encoding the CD2V protein of the ASFV virus
• 4.2. Construction of the cloning vectors that contain the gene encoding for CD2V protein of ASFV
• 4.3. Construction of the expression vectors that contain the gene encoding CD2V protein of ASFV
• 4.4. Transient expression of recombinant protein in N. benthamiana by Agro-Infiltration methods
• 4.5. Evaluation the transient expression of CD2V protein by Western blot
• 5. CONCLUSION AND SUGGESTION

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Vectơ Thực Vật CD2v Từ ASFV

Nghiên cứu tập trung vào việc xây dựng vectơ biểu hiện thực vật dựa trên CD2v từ Virus dịch tả lợn châu Phi (ASFV) và đánh giá khả năng biểu hiện tạm thời protein này trong cây Nicotiana benthamiana. ASFV là một mối đe dọa lớn đối với ngành chăn nuôi lợn toàn cầu, gây ra tỷ lệ tử vong cao và thiệt hại kinh tế nặng nề. Việc phát triển vaccine hiệu quả là vô cùng cấp thiết. CD2v là một protein bề mặt virus quan trọng, có tiềm năng lớn trong việc phát triển vaccine subunit. Sử dụng công nghệ sinh học thực vật để sản xuất vaccine mang lại nhiều ưu điểm như chi phí thấp, khả năng mở rộng sản xuất nhanh chóng và an toàn hơn so với các phương pháp truyền thống. Nghiên cứu này hướng đến việc tạo ra một hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp hiệu quả, góp phần vào nỗ lực phòng chống dịch tả lợn châu Phi.

1.1. Giới thiệu về Virus Dịch Tả Lợn Châu Phi ASFV

Virus dịch tả lợn châu Phi (ASFV) là một loại virus DNA lớn, phức tạp, gây bệnh dịch tả lợn châu Phi, một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở lợn với tỷ lệ tử vong có thể lên đến 100%. ASFV lây lan nhanh chóng và gây ra thiệt hại kinh tế to lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Hiện tại, chưa có vaccine thương mại hiệu quả để phòng chống dịch tả lợn châu Phi. Nghiên cứu về ASFV và phát triển vaccine là một ưu tiên hàng đầu trong lĩnh vực thú y. Virus này có cấu trúc phức tạp và bộ gen lớn, gây khó khăn cho việc phát triển vaccine truyền thống.

1.2. Vai trò của Protein CD2v trong ASFV

CD2v là một protein bề mặt của ASFV, đóng vai trò quan trọng trong quá trình lây nhiễm và tương tác với tế bào vật chủ. CD2v được coi là một ứng cử viên tiềm năng cho vaccine subunit do khả năng kích thích phản ứng miễn dịch. Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng CD2v có thể liên quan đến khả năng bảo vệ chống lại nhiễm trùng ASFV. Việc hiểu rõ hơn về chức năng và cấu trúc của CD2v là rất quan trọng để phát triển vaccine hiệu quả. Protein này có thể đóng vai trò trong sự bám dính của virus vào tế bào chủ.

II. Thách Thức Trong Phát Triển Vaccine ASFV Hiệu Quả

Việc phát triển vaccine chống lại Virus dịch tả lợn châu Phi (ASFV) gặp nhiều khó khăn do tính phức tạp của virus và bộ gen lớn. Các loại vaccine truyền thống như vaccine bất hoạt không mang lại hiệu quả bảo vệ đáng kể. Vaccine sống giảm độc lực có tiềm năng, nhưng quy trình sản xuất phức tạp và tốn kém. Vaccine subunit, sử dụng các kháng nguyên virus cụ thể như CD2v, là một hướng đi đầy hứa hẹn. Tuy nhiên, việc xác định các kháng nguyên và epitope quan trọng để kích thích phản ứng miễn dịch hiệu quả vẫn là một thách thức lớn. Nghiên cứu này tập trung vào việc sử dụng hệ thống biểu hiện thực vật để sản xuất protein tái tổ hợp CD2v, một giải pháp tiềm năng để vượt qua những thách thức này.

2.1. Hạn chế của Vaccine Truyền Thống cho ASFV

Các loại vaccine truyền thống như vaccine bất hoạt thường không mang lại hiệu quả bảo vệ đáng kể chống lại ASFV. Vaccine sống giảm độc lực có tiềm năng hơn, nhưng việc tạo ra và sản xuất chúng thường phức tạp và tốn kém. Ngoài ra, có những lo ngại về an toàn liên quan đến việc sử dụng vaccine sống giảm độc lực, chẳng hạn như khả năng virus phục hồi độc lực. Do đó, cần có những phương pháp tiếp cận mới để phát triển vaccine ASFV hiệu quả và an toàn hơn. Các phương pháp tiếp cận này cần tập trung vào việc kích thích phản ứng miễn dịch mạnh mẽ và kéo dài.

2.2. Tiềm năng và Thách thức của Vaccine Subunit ASFV

Vaccine subunit, sử dụng các kháng nguyên virus cụ thể như CD2v, là một hướng đi đầy hứa hẹn trong việc phát triển vaccine ASFV. Vaccine subunit có thể an toàn hơn so với vaccine sống giảm độc lực, nhưng việc xác định các kháng nguyên và epitope quan trọng để kích thích phản ứng miễn dịch hiệu quả vẫn là một thách thức lớn. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để xác định các kháng nguyên có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch bảo vệ chống lại ASFV. Ngoài ra, cần có các phương pháp hiệu quả để sản xuất và tinh chế các kháng nguyên này với chi phí hợp lý.

III. Phương Pháp Xây Dựng Vectơ Biểu Hiện CD2v Từ ASFV

Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật di truyền để xây dựng vectơ biểu hiện thực vật chứa gen mã hóa protein CD2v từ ASFV. Gen CD2v được tối ưu hóa codon để tăng cường biểu hiện protein trong Nicotiana benthamiana. Các đoạn DNA mã hóa các vùng khác nhau của CD2v (toàn bộ, không có peptide tín hiệu, vùng tế bào chất, vùng ngoại bào) được khuếch đại bằng PCR và chèn vào vectơ nhân dòng. Sau đó, cassette biểu hiện được chèn vào vectơ biểu hiện và chuyển vào Agrobacterium tumefaciens để biểu hiện tạm thời protein trong cây.

3.1. Tối ưu hóa Codon và Tổng hợp Gen CD2v

Gen mã hóa protein CD2v từ ASFV được tối ưu hóa codon để tăng cường biểu hiện protein trong Nicotiana benthamiana. Tối ưu hóa codon là quá trình thay đổi các codon trong gen để phù hợp hơn với tần suất sử dụng codon của tế bào chủ, từ đó tăng hiệu quả dịch mã. Gen CD2v được tổng hợp nhân tạo sau khi đã được tối ưu hóa codon. Quá trình này đảm bảo rằng gen có trình tự chính xác và không chứa các yếu tố gây cản trở quá trình biểu hiện protein.

3.2. Khuếch Đại PCR và Chèn Gen CD2v vào Vectơ

Các đoạn DNA mã hóa các vùng khác nhau của CD2v (toàn bộ, không có peptide tín hiệu, vùng tế bào chất, vùng ngoại bào) được khuếch đại bằng PCR sử dụng các mồi đặc hiệu. PCR là một kỹ thuật khuếch đại DNA nhanh chóng và hiệu quả. Các sản phẩm PCR sau đó được chèn vào vectơ nhân dòng bằng các enzyme giới hạn. Quá trình này tạo ra các vectơ tái tổ hợp chứa gen CD2v hoặc các đoạn của nó.

IV. Biểu Hiện Tạm Thời Protein CD2v Trong Nicotiana Benthamiana

Để biểu hiện protein tái tổ hợp CD2v trong cây, Agrobacterium tumefaciens mang vectơ biểu hiện được sử dụng để chuyển gen vào Nicotiana benthamiana thông qua phương pháp agroinfiltration. Biểu hiện tạm thời protein cho phép đánh giá nhanh chóng khả năng biểu hiện của gen và tính chất của protein. Protein CD2v được phát hiện bằng kỹ thuật Western blot sử dụng kháng thể đặc hiệu. Kết quả cho thấy các đoạn CD2v khác nhau có mức độ biểu hiện khác nhau trong cây.

4.1. Agroinfiltration để Chuyển Gen vào Nicotiana Benthamiana

Agroinfiltration là một phương pháp chuyển gen hiệu quả và đơn giản để biểu hiện tạm thời protein trong cây. Agrobacterium tumefaciens mang vectơ biểu hiện chứa gen CD2v được tiêm vào lá của Nicotiana benthamiana. Agrobacterium chuyển gen CD2v vào tế bào thực vật, nơi gen được phiên mã và dịch mã để tạo ra protein CD2v. Phương pháp này cho phép đánh giá nhanh chóng khả năng biểu hiện của gen và tính chất của protein.

4.2. Phát Hiện Protein CD2v bằng Western Blot

Protein CD2v được phát hiện trong dịch chiết từ lá Nicotiana benthamiana bằng kỹ thuật Western blot. Western blot là một kỹ thuật phân tích protein sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát hiện protein mục tiêu. Kháng thể đặc hiệu cho CD2v được sử dụng để nhận diện protein CD2v trong mẫu. Kết quả Western blot cho thấy các đoạn CD2v khác nhau có mức độ biểu hiện khác nhau trong cây. Điều này có thể liên quan đến cấu trúc và chức năng của các đoạn CD2v khác nhau.

V. Đánh Giá Kết Quả Biểu Hiện Protein CD2v và Ứng Dụng

Kết quả nghiên cứu cho thấy protein CD2v toàn phần không được biểu hiện hiệu quả trong Nicotiana benthamiana. Tuy nhiên, đoạn CD2v không có peptide tín hiệu được biểu hiện ở mức độ thấp, trong khi các đoạn chứa vùng tế bào chất và vùng ngoại bào được biểu hiện mạnh mẽ. Điều này cho thấy peptide tín hiệu có thể ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện protein trong hệ thống thực vật. Kết quả này cung cấp cơ sở khoa học cho việc sản xuất kháng nguyên trong hệ thống thực vật, mở ra tiềm năng phát triển các hệ thống sản xuất mới với chi phí thấp, góp phần vào y học sáng tạo.

5.1. Phân tích Mức Độ Biểu Hiện của Các Đoạn CD2v

Kết quả Western blot cho thấy protein CD2v toàn phần không được biểu hiện hiệu quả trong Nicotiana benthamiana. Đoạn CD2v không có peptide tín hiệu được biểu hiện ở mức độ thấp, trong khi các đoạn chứa vùng tế bào chất và vùng ngoại bào được biểu hiện mạnh mẽ. Điều này cho thấy peptide tín hiệu có thể ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện protein trong hệ thống thực vật. Peptide tín hiệu có thể gây ra các vấn đề về gấp nếp protein hoặc vận chuyển protein trong tế bào thực vật.

5.2. Tiềm Năng Ứng Dụng trong Phát Triển Vaccine ASFV

Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc sản xuất kháng nguyên trong hệ thống thực vật, mở ra tiềm năng phát triển các hệ thống sản xuất mới với chi phí thấp, góp phần vào y học sáng tạo. Các đoạn CD2v được biểu hiện hiệu quả trong Nicotiana benthamiana có thể được sử dụng làm kháng nguyên trong vaccine subunit ASFV. Hệ thống biểu hiện thực vật có thể cung cấp một phương pháp sản xuất vaccine nhanh chóng và hiệu quả để phòng chống dịch tả lợn châu Phi.

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Vaccine ASFV

Nghiên cứu đã thành công trong việc xây dựng vectơ biểu hiện thực vật chứa gen CD2v từ ASFV và đánh giá khả năng biểu hiện tạm thời protein này trong Nicotiana benthamiana. Kết quả cho thấy hệ thống biểu hiện thực vật có tiềm năng trong việc sản xuất kháng nguyên cho vaccine subunit ASFV. Hướng nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình biểu hiện protein, đánh giá khả năng kích thích phản ứng miễn dịch của các đoạn CD2v khác nhau và phát triển các công thức vaccine hiệu quả.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu Chính

Nghiên cứu đã thành công trong việc xây dựng vectơ biểu hiện thực vật chứa gen CD2v từ ASFV và đánh giá khả năng biểu hiện tạm thời protein này trong Nicotiana benthamiana. Kết quả cho thấy hệ thống biểu hiện thực vật có tiềm năng trong việc sản xuất kháng nguyên cho vaccine subunit ASFV. Các đoạn CD2v khác nhau có mức độ biểu hiện khác nhau trong cây, cho thấy peptide tín hiệu có thể ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện protein.

6.2. Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo

Hướng nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình biểu hiện protein, đánh giá khả năng kích thích phản ứng miễn dịch của các đoạn CD2v khác nhau và phát triển các công thức vaccine hiệu quả. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để xác định các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện protein trong hệ thống thực vật và phát triển các phương pháp để tăng cường biểu hiện protein. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu về miễn dịch học để đánh giá khả năng kích thích phản ứng miễn dịch của các đoạn CD2v khác nhau và xác định các epitope quan trọng.