Đặt vấn đề Ralstonia solanacearum là tác nhan của bệnh héo xanh trên 250 loài cây thuộc hơn 54 họ thực vật khác nhau, đặc biệt là họ Solanaceae và họ Musaceae trong đó có các cây trồng phô biến như: cà chua, khoai tây, hồ tiêu, thuốc lá, ớt, cả tím, dâu tằm. gây ra thiệt hại lớn về mặt thương mại. Sự mất mát năng suất do tác động của R. solanacearum lên đến 60 đến 100% (Li và ctv, 2014; Mohammed va ctv, 2020; Popoola va ctv, 2015).
Các chiến lược quản lý dich bệnh tổng hợp dưới hình thức kiểm soát canh tác, kiểm soát hóa chất và kháng di truyền đã được sử dụng trong nhiều năm để kiểm soát tỷ lệ mắc bệnh héo xanh do vi khuẩn. Tuy nhiên, không có chiến lược nao hoàn toàn kiểm soát được bệnh do tính đa dạng di truyền cao, phạm vi ký chủ rộng và sự tồn tại kéo đài của mầm bệnh trong đất và trên các bộ phận của cây. Người ta ước tính rằng khoảng 3,75 triệu mẫu đất ở khoảng 80 quốc gia trên thế giới sẽ bị ảnh hưởng, và thiệt hại toàn cầu hiện ước tính vượt quá 950 triệu đô la mỗi năm (Charkowski và ctv, 2020). Do đó, việc phát hiện nhanh chóng và chính xác chủng vi khuẩn R.
solanacearum là cần thiết và góp phần kiểm soát hiệu quả R. solanacearum trong điều kiện đồng ruộng. Mục tiêu đề tài Thiết kế primer chuyên biệt cho Ralstonia solanacearum và phát hiện được sự hiện diện của Ralstonia spp. Xây dựng thành công quy trình PCR từ primer đã thiết kế dé phân biệt Ralstonia solanacearum với các loài Ralstonia khác.
Nội dung thực hiện Thiết kế primer chuyên biệt cho R. solanacearum và Ralstonia spp. bằng các công cụ tin sinh ứng dụng. Xây dựng quy trình PCR phát hiện và định danh vi khuẩn R.
solanacearum và Ralstonia spp. với cặp primer đặc hiệu. Thu thập mẫu bệnh héo xanh trên cây họ cà. Phân lập và làm thuần vi khuẩn Ralstonia trên môi trường chọn lọc.
Tăng sinh và ly trích DNA từ khuẩn lạc. Thực hiện phan ứng PCR với chủng nghi ngờ. TONG QUAN TÀI LIEU 2. Giới thiệu bệnh héo xanh Héo là một triệu chứng phổ biến của bệnh nhiễm trùng của hầu hết các vật chủ với tất cả các loại phylotype.
Các lá non nhất thường héo trước, xuất hiện vào thời điểm ấm nhất trong ngày. Héo có thể chỉ thấy ở thân, một mặt của cây hoặc thậm chí từng nhánh ở một phần của lá, tùy thuộc vào vị trí nhiễm trùng bó mạch trong các phần của thân và cuống lá. La có thé bị vàng hóa hoặc có thé xảy ra hiện tượng ta lá và khô héo. Toản bộ cây có thể bị héo và chết nhanh chóng nếu điều kiện môi trường thuận lợi cho sự phát triển của mầm bệnh (Hình 2.
Khi bệnh phát triển, có thé quan sát thấy sự hoá nâu của các mạch xylem trong thân phía trên lớp đất và rễ. Khi cắt thân cây sẽ thấy khối dịch vi khuẩn chảy ra từ các bó mạch (Hình 2. Bệnh héo xanh trên một số cây họ cà. Cây cà chua; C.
Tác nhân gây bệnh là vi khuân Ralstonia solanacearum, chúng xâm nhập vào hệ thống rễ và mach xylem thông qua lớp biểu bì, khí khổng và các vết thương tự nhiên khác, sau một thời gian phát triển cây sẽ héo rũ và chết sớm (Hayward, 1991; Denny, 2006; Lowe-Power và ctv, 2018). Giới thiệu về Ralstonia solanacearum 2. Phan loại và danh pháp Chi Ralstonia được phân loại trong ngành Proteobacteria, lớp 8-Proteobacteria, bộ Burkholderiales, họ Burkholderiaceae. Tổ hợp loài của Ralstonia solanacearum từ lâu đã được công nhận là một nhóm các chủng đa dạng về kiểu hình, ban đầu được đặc trưng là các chủng tộc (race) và biovar gây bệnh (Buddenhagen, 1962; Hayward, 1964).
Năm 2005, Fegan va Prior đã mô tả bốn kiểu loài trong tổ hợp loài, mỗi kiểu bao gồm nhiều biến thể phát sinh loài (sequevars) theo sự đa dạng về trình tự trong các gen mã vạch (bao gồm 16S rRNA, #rpB, mutS, và egi). Gan đây, phức hợp đã được phân loại lại trên cơ sở so sánh toàn bộ bộ gen thành ba loài riêng biệt (Safm va ctv, 2014; Prior và ctv, 2016): R. pseudosolanacearum (Phylotype I va IID, va RK. Ralstonia syzygii Method Cutoff subsp.33 + 10% (distance) QGDC 70% (DDH) Ralstonia solanacearum Ralstonia pseudosolanacearum IBSBF1503 CFBP6783 Uwi7g CFBP7014 Hình 2.
Mối quan hệ phát sinh loài của các chủng trong quan thé loài Ralstonia solanacearum (Prior và ctv, 2016). Cây kết hợp ma trận khoảng cách được tạo ra từ các giá trị trung bình độ tương dong nucleotidex (AND), chỉ số so khớp duy nhất toi da (Mi UMi) và may tính khoảng cách giữa bộ gen với bộ gen (GGDC) dé so sánh DNA:DNA tương dong (DDH) (Charkowski và ctv, 2020). Pham vi kí chủ Một loạt các ký chủ quan trọng về kinh tế bao gồm cà chua, khoai tây, cà tím, chuối, chuối rừng, bầu bí, bạch đàn, gừng, lạc, dâu tằm, thuốc lá, tiêu, các loại ớt và nhiều cây cảnh. syzygii, mỗi loài bao gồm các chủng ban đầu được chỉ định là chủng (race) 1 và xuất hiện ở các khu vực nhiệt đới trên toàn thế giới, tắn công một loạt vật chủ rất rộng với hơn 250 vật chủ thuộc 54 họ thực vật.
Một số kiểu gen R. solanacearum trong Phylotype II (sequevars IIA-6, IA- 24, IIA-41, IA-53, IIB-3, IIB-4 và IIB-25), ban đầu được mô tả là race 2, gây ra bệnh Moko của Musa spp. solanacearum (sequevar 1) trong Phylotype IIB (PIIB1), trước đây được gọi là chủng 3 / blovar 2, có liên quan rộng rãi nhất với khoai tây. Kiểu gen này có nhiệt độ tối ưu của cây thấp hơn (27°C) so với hầu hết các kiểu gen khác (35°C), thường xảy ra trong các trường hợp nhiễm trùng tiềm ẩn (không triệu chứng) ở độ cao lớn ở vùng nhiệt đới và các khu vực trồng rừng cận nhiệt đới và ôn đới.
Chủng này cũng có thể gây héo cà chua và có thể tồn tại tiềm an lâu năm (Charkowski va ctv, 2020). Dịch té học Hình 2. Sự xâm nhiễm của R. solanacearum vào rễ cà chua quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM).
Mặt cắt ngang của rễ. Các mũi tên màu vàng trỏ đến các tế bào nhu mô xylem bị thu gọn, B. Hình ảnh phóng đại của hộp đỏ được nhìn thay trong (A) cho thay vi khuẩn hau hết bám vào thành của các phan tử khí quản, C. Hình ảnh phóng đại của hộp vàng từ (A) cho thấy phan tử khí quan bị cản trở bởi vi khuẩn.
Yếu to khí quản (TE), Vi khuẩn (mũi tên do), Mô nhu mô xylem xep (mũi tên vàng) (Caldwell va ctv, 2017). Bệnh héo xanh thường nặng nhất ở nhiệt độ 24 - 35°C, có tỷ lệ bệnh cao khi độ ầm đất cao, thời tiết 4m ướt hoặc mùa mưa. Vi khuẩn thường xâm nhập vào hệ thống rễ vật chủ thông qua các vết thương tự nhiên do sự xuất hiện của rễ bên hoặc qua các vết thương do rễ mọc xuyên qua đất; di chuyển vào xylem và bám lên thành mạch nhờ lực hút phân cực, hoặc xâm nhập vào lòng mạch - nơi chúng nhân lên trong xylem (Hình 2.4) và sau đó lan vào chéi. Vi khuẩn tiết exopolysaccharide (EPS) gây ra sự tắc nghẽn vật lý của mô xylem, dẫn đến héo cây và cuối cùng là chết (Caldwell và ctv, 2017).
Vi khuẩn cũng có thé lây truyền cơ học trong quá trình cắt tia hoặc khi lay cành giâm đề nhân giống. Sự di chuyên xa của vật liệu nhân giống sinh dưỡng (ví dụ như củ khoai tây, thân rễ của gừng và nghệ, và chồi chuối) có thể mang mầm bệnh tiềm an. Đã có những phát hiện về hạt bị ô nhiễm của các vật chủ khác (bao gồm cà chua, Capsicum, cà tím và đậu nành) mặc dù sự lây nhiễm và lây truyền hạt giống chưa được chứng minh. Hiện nay, sự lây truyền qua nước hoặc đất và sự di chuyên của các bộ phận thực vật sinh dưỡng bị nhiễm bệnh được coi là quan trọng hơn đối với hầu hết các cây ký chủ hơn là lây truyền qua hạt giống (Charkowski và ctv, 2020).
Đặc điểm nuôi cấy R. solanacearum là vi khuân hiểu khí. Việc sang lọc vi khuẩn trên TZC cho phép phân biệt giữa các dòng độc và không độc. Các khuẩn lạc độc lực điển hình phát triển trong vòng 48 giờ trên môi trường TZC có màu trang, tâm màu hồng, tròn không đều va lỏng (Hình 2.5A), trong khi các chủng không độc tao ra khuẩn lạc nhỏ hơn, màu đỏ sam và tròn đều (Hình 2.
Khi được nuôi cấy trên CPG, các chủng độc lực có khuẩn lạc mau trang dén mau kem, tron không đều, lỏng và mờ đục (Hình 2. Ngược lại, các khuẩn lạc không độc có mau trắng hoặc màu kem, nhỏ hơn, tròn đều và khuẩn lạc mờ đục (Hình 2. VE A _&“Tam es | Hinh 2. Hinh thai té bao cua R.
Soi dưới kính hiên vi điện tử quét (SEM) (Fan va ctv, 2013). solanacearum không sinh bào tử, có hình que ngắn và tròn ở hai đầu. Vi khuan thường gặp ở dạng đơn lẻ, ghép đôi hoặc bốn, kích thước trong khoảng 1,0 - 1,5 x 0,5 - 0,6 um, chuyền động nhờ một đến một vài tiên mao (flagella) (Nguyén Tat Thang va ctv, 2011). Đặc điểm sinh hóa R.
solanacearum cho phản ứng dương tính với thử nghiệm độ hòa tan kali hydroxit, thử nghiệm catalase, thử nghiệm thủy phân tinh bột, thử nghiệm khả năng vận động, thử nghiệm Kovacs oxidase, thử nghiệm hoạt tính lipase trên thạch Tween 80 và thử nghiệm thủy phân casein; cho phản ứng âm tính đối với nhuộm gram, thử nghiệm sản xuất Levan từ sucrose, thử nghiệm Arginine dihydrolase và thử nghiệm sản xuất sắc tố huỳnh quang (Popoola và ctv, 2015; Zubeda va Hamid, 2011). Nghiên cứu về chủng Ralstonia solanacearum 2. Nghiên cứu trong nước Đánh giá đa dang di truyền của 26 chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith được thu thập ở các vùng trồng cây họ cà và bầu bí ở miền Bắc bằng chỉ thị RAPD. Tổng số 100 chỉ thị RAPD được dùng dé đánh giá kiểu gen của một số chủng vi khuẩn đại diện cho cây họ cả va bầu bí, trong đó có 21 chỉ thị phân tử RAPD khuếch đại các đoạn DNA rõ nét và ồn định và được chọn dé đánh giá kiểu gen của 26 chủng vi khuẩn.
Sản phẩm PCR được phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2. Kết quả cho thấy các chủng ®. solanacearum được thu thập trên các ký chủ khác nhau có sự khác biệt về đi truyền cao hơn so với các chủng ở các vùng sinh thái khác nhau (Trương Thị Hồng Hải va ctv, 2016). Võ Thi Bích Thuy va ctv (2016) đã chon ra những chủng vi khuẩn R.
solanacearum có kha năng gây hai cao đồng thời đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh của giống ớt sừng vàng Châu Phi được ghép trên gốc ghép ớt khác nhau trong điều kiện nhà lưới.