Tổng quan nghiên cứu

Viêm gan B mạn tính là một trong những bệnh lý nguy hiểm ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng toàn cầu, với ước tính khoảng 248 triệu người mắc bệnh tính đến năm 2010 và khoảng 686.000 ca tử vong do viêm gan B vào năm 2013. Tenofovir alafenamid (TAF) là một tiền chất của tenofovir (TFV), được sử dụng rộng rãi trong điều trị viêm gan B mạn tính nhờ khả năng ức chế enzym polymerase của ADN virus viêm gan B. TAF có ưu điểm vượt trội so với các thuốc tiền nhiệm như tenofovir disoproxil fumarat (TDF) khi có liều thấp hơn 30 lần nhưng vẫn duy trì hiệu quả kháng virus, đồng thời giảm thiểu tác dụng phụ trên thận và xương.

Tại Việt Nam, các chế phẩm generic chứa TAF đang lưu hành với giá thành thấp hơn thuốc gốc, tuy nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học giữa các chế phẩm này với thuốc gốc. Đặc biệt, TAF hiện diện trong huyết tương người ở nồng độ rất thấp do được chuyển hóa nhanh thành TFV, gây khó khăn trong việc định lượng đồng thời hai chất này. Do đó, việc xây dựng quy trình định lượng đồng thời TAF và TFV trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) là cần thiết để hỗ trợ đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm chứa TAF trên thị trường Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu là phát triển và thẩm định quy trình định lượng đồng thời TAF và TFV trong huyết tương người theo hướng dẫn của US-FDA và EMA, góp phần nâng cao chất lượng kiểm nghiệm thuốc và hỗ trợ các nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng tại Việt Nam trong giai đoạn 2019-2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Dược động học của Tenofovir alafenamid và Tenofovir: TAF là tiền chất được chuyển hóa thành TFV trong tế bào gan và tế bào máu ngoại vi, TFV sau đó được phosphoryl hóa thành TFV-DP có hoạt tính kháng virus. TAF có thời gian bán thải ngắn (khoảng 0,51 giờ), trong khi TFV có thời gian bán thải dài hơn (khoảng 32 giờ), cho phép duy trì nồng độ hoạt chất trong huyết tương ổn định.

  • Kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS): Phương pháp phân tích định lượng nhạy và đặc hiệu cao, sử dụng ion hóa tia điện (ESI) trong chế độ dương, kết hợp kỹ thuật Multiple Reaction Monitoring (MRM) để phát hiện ion phân tử và ion phân mảnh đặc trưng của TAF và TFV.

  • Chuẩn nội (Internal Standard - IS): Sử dụng tamsulosin làm chuẩn nội do có tính chất hóa học tương tự, ổn định và không tương tác với các chất phân tích, giúp tăng độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp.

  • Phương pháp xử lý mẫu huyết tương: Kết tủa protein (Protein Precipitation - PPT) bằng acetonitril được lựa chọn để loại bỏ protein và tạp chất, đảm bảo hiệu suất chiết ổn định trên 70% với hệ số biến thiên (CV) dưới 15%.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Mẫu huyết tương người giả lập chứa TAF và TFV được chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng với huyết tương trắng thu thập từ các lô huyết tương được bảo quản nghiêm ngặt.

  • Phương pháp phân tích: Sử dụng hệ thống LC-MS/MS Shimadzu 8040 với cột sắc ký Agilent Poroshell C6-Phenyl (150 × 4,6 mm; 4 µm), pha động gồm acetonitril và dung dịch acid formic 0,5% theo chương trình gradient. Điều kiện sắc ký được tối ưu với nhiệt độ cột 40°C, tốc độ dòng 0,7 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 5 µL.

  • Xử lý mẫu: Mẫu huyết tương được xử lý bằng phương pháp kết tủa protein với acetonitril, sau đó ly tâm và lấy pha trên để tiêm vào hệ thống LC-MS/MS.

  • Thẩm định phương pháp: Thực hiện theo hướng dẫn của US-FDA và EMA, bao gồm các chỉ tiêu: tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng dưới (LLOQ), hiệu suất chiết, ảnh hưởng của nền mẫu, độ ổn định mẫu và ảnh hưởng của sự pha loãng.

  • Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong khóa học thạc sĩ 2019-2021 tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, với các giai đoạn chuẩn bị mẫu, khảo sát điều kiện phân tích, xây dựng quy trình và thẩm định phương pháp.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Điều kiện khối phổ tối ưu: TAF, TFV và chuẩn nội tamsulosin được ion hóa bằng ESI dương, với các ion định lượng lần lượt là m/z 477,10 → 176,00 (TAF), 288,10 → 176,00 (TFV) và 409,20 → 148,10 (tamsulosin). Tín hiệu ion ổn định với thời gian ghi nhận 100 ms.

  2. Hiệu suất chiết mẫu: Phương pháp kết tủa protein với acetonitril đạt hiệu suất chiết ổn định trên 70% cho cả TAF và TFV, với hệ số biến thiên (CV) dưới 15%, đảm bảo độ lặp lại cao.

  3. Khoảng tuyến tính và giới hạn định lượng: Khoảng tuyến tính của TAF là 4 – 500 ng/mL, TFV là 0,4 – 50 ng/mL. Giới hạn định lượng dưới lần lượt là 4 ng/mL cho TAF và 0,4 ng/mL cho TFV, phù hợp với yêu cầu phân tích dược động học.

  4. Kết quả thẩm định: Các chỉ tiêu tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác trong ngày và giữa các ngày đều nằm trong giới hạn cho phép (độ chính xác CV ≤ 15%, độ đúng 80-120%). Ảnh hưởng của nền mẫu, lượng mẫu tồn dư và sự pha loãng đều không vượt quá giới hạn quy định, chứng tỏ quy trình phân tích ổn định và tin cậy.

Thảo luận kết quả

Việc lựa chọn kỹ thuật LC-MS/MS với ion hóa ESI và chế độ MRM đã giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu trong việc định lượng đồng thời TAF và TFV trong huyết tương người, đặc biệt khi nồng độ TAF rất thấp do chuyển hóa nhanh thành TFV. So với các nghiên cứu quốc tế, kết quả đạt được tương đương về giới hạn định lượng và độ chính xác, chứng tỏ quy trình phù hợp với điều kiện thực tế tại Việt Nam.

Phương pháp kết tủa protein với acetonitril được ưu tiên do đơn giản, nhanh chóng và tiết kiệm chi phí, mặc dù có thể có ảnh hưởng nhẹ của nền mẫu nhưng vẫn nằm trong giới hạn cho phép. Việc sử dụng tamsulosin làm chuẩn nội giúp điều chỉnh sai số trong quá trình xử lý mẫu và phân tích, nâng cao độ tin cậy của kết quả.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ sắc ký thể hiện các pic sắc ký của TAF, TFV và chuẩn nội với thời gian lưu ổn định, cũng như bảng số liệu thẩm định các chỉ tiêu như độ đúng, độ chính xác và hiệu suất chiết ở các mức nồng độ khác nhau.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Áp dụng quy trình LC-MS/MS trong đánh giá tương đương sinh học: Khuyến nghị các trung tâm kiểm nghiệm thuốc và các cơ sở nghiên cứu sử dụng quy trình đã xây dựng để đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học các chế phẩm chứa TAF trên thị trường Việt Nam trong vòng 1-2 năm tới.

  2. Đào tạo kỹ thuật viên và cán bộ kiểm nghiệm: Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật LC-MS/MS và xử lý mẫu huyết tương nhằm nâng cao năng lực phân tích, đảm bảo kết quả chính xác và ổn định.

  3. Mở rộng nghiên cứu ứng dụng: Khuyến khích nghiên cứu mở rộng định lượng các chất chuyển hóa khác của TAF và TFV trong các mẫu sinh học khác như tế bào máu ngoại vi, nhằm phục vụ nghiên cứu dược động học toàn diện.

  4. Cập nhật và hoàn thiện quy trình theo tiêu chuẩn quốc tế: Đề xuất cập nhật quy trình thẩm định theo các hướng dẫn mới nhất của US-FDA và EMA, đồng thời xây dựng quy trình chuẩn nội bộ cho các phòng kiểm nghiệm thuốc tại Việt Nam trong vòng 3 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Các nhà nghiên cứu dược học và dược động học: Luận văn cung cấp quy trình phân tích chuẩn xác, giúp nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học của các thuốc chứa TAF.

  2. Phòng kiểm nghiệm thuốc và độc chất: Hướng dẫn chi tiết về phương pháp LC-MS/MS và xử lý mẫu huyết tương, hỗ trợ kiểm soát chất lượng thuốc trên thị trường.

  3. Cơ quan quản lý dược phẩm: Cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá chất lượng và tương đương sinh học các chế phẩm generic chứa TAF, phục vụ công tác cấp phép và giám sát.

  4. Sinh viên và học viên ngành dược học, kiểm nghiệm thuốc: Tài liệu tham khảo quý giá về kỹ thuật phân tích hiện đại, quy trình thẩm định phương pháp và ứng dụng thực tiễn trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc.

Câu hỏi thường gặp

  1. Tại sao cần định lượng đồng thời TAF và TFV trong huyết tương?
    Định lượng đồng thời giúp đánh giá chính xác nồng độ thuốc và chất chuyển hóa, từ đó đánh giá hiệu quả điều trị và tương đương sinh học của các chế phẩm chứa TAF.

  2. Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm gì so với các kỹ thuật khác?
    LC-MS/MS có độ nhạy cao, đặc hiệu, thời gian phân tích nhanh và khả năng phân tích đồng thời nhiều chất trong mẫu phức tạp như huyết tương.

  3. Tại sao chọn tamsulosin làm chuẩn nội?
    Tamsulosin có tính chất hóa học tương tự, ổn định, không tương tác với TAF và TFV, giúp điều chỉnh sai số trong quá trình phân tích.

  4. Phương pháp xử lý mẫu huyết tương nào được sử dụng và vì sao?
    Phương pháp kết tủa protein bằng acetonitril được chọn vì đơn giản, nhanh, hiệu suất chiết cao và tiết kiệm chi phí.

  5. Quy trình thẩm định theo hướng dẫn nào?
    Quy trình thẩm định tuân thủ các tiêu chuẩn của US-FDA và EMA, đảm bảo độ chính xác, độ đúng, tính đặc hiệu và độ ổn định của phương pháp.

Kết luận

  • Đã xây dựng thành công quy trình định lượng đồng thời tenofovir alafenamid và tenofovir trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS với độ nhạy và độ chính xác cao.
  • Phương pháp xử lý mẫu huyết tương bằng kết tủa protein với acetonitril cho hiệu suất chiết ổn định trên 70% và CV dưới 15%.
  • Khoảng tuyến tính của TAF và TFV lần lượt là 4 – 500 ng/mL và 0,4 – 50 ng/mL, phù hợp với yêu cầu phân tích dược động học.
  • Quy trình thẩm định theo hướng dẫn US-FDA và EMA đảm bảo tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác và độ ổn định trong giới hạn cho phép.
  • Đề xuất áp dụng quy trình trong các nghiên cứu sinh khả dụng, tương đương sinh học và kiểm nghiệm thuốc tại Việt Nam trong giai đoạn tiếp theo.

Hành động tiếp theo là triển khai đào tạo kỹ thuật viên, áp dụng quy trình trong các phòng kiểm nghiệm và mở rộng nghiên cứu ứng dụng nhằm nâng cao chất lượng kiểm nghiệm thuốc trong nước.