ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, virus viêm gan B vẫn là mối đe dọa lớn đến sức khỏe toàn cầu. Tính đến năm 2010, ước tính trên toàn thế giới có khoảng 2 tỉ người bị nhiễm virus viêm gan B và khoảng 248 triệu người bị viêm gan B mạn tính [16]. Viêm gan siêu vi B mạn tính là nguyên nhân hàng đầu dẫn tới suy gan, xơ gan và ung thư gan [16]. Khoảng 15 % đến 25% số người bị nhiễm virus viêm gan B mạn tính chết vì xơ gan hoặc ung thư gan.
Một nghiên cứu về bệnh tật toàn cầu đã ước tính rằng có 686.000 ca tử vong do viêm gan B vào năm 2013 [16]. Các thuốc thuộc nhóm có cấu trúc tương đồng với acid nucleic, một nhóm thuốc điều trị kháng virus, đã cho thấy sự hiệu quả trong quá trình ức chế sự nhân lên của virus, ngăn chặn sự tiến triển của virus viêm gan B, thậm chí là xơ gan và cải thiện khả năng sống sót của bệnh nhân [31]. Trong đó, tenofovir alafenamid (TAF, trước đây được gọi là là GS-7340), một tiền chất của tenofovir (TFV), sẽ được chuyển hóa thành tenofovir diphosphat (TFV-DP) do được phosphoryl hóa trong tế bào, chất này ức chế enzym polymerase của ADN virus viêm gan B và ức chế enzym phiên mã ngược của virus HIV-1, sau khi gắn vào ADN sẽ chấm dứt kéo dài thêm chuỗi ADN [2]. Hiện nay, thuốc đang được khuyến cáo đầu tiên trong phác đồ điều trị bệnh nhân viêm gan B mạn tính, hoặc dùng phối hợp với các thuốc kháng virus khác (ít nhất là 1 thuốc) trong điều trị nhiễm HIV-1 ở người trưởng thành [2],[31].
Trước đây, tenofovir disoproxil fumarat được sử dụng phổ biến hơn trong điều trị nhưng có một tỷ lệ nhất định gây tác dụng phụ trên thận và xương [28]. Trong thử nghiệm lâm sàng, tenofovir alafenamid có tác dụng kháng retrovirus tương đương với tenovovir disoproxil fumarat với liều thấp hơn 30 lần (10 mg so với 300 mg) và đã được chứng minh làm giảm đáng kể các tác dụng phụ gây suy thận, giảm mật độ xương và loãng xương do sự khác biệt trong đặc tính dược lý. Hiện tại FDA đã phê duyệt một số thuốc chứa tenofovir alafenamid bao gồm Vemlidy®, Descovy®, Biktarvy®, Genvoya® trong điều trị nhiễm HIV và HBV [18],[31]. 2 Trên thế giới hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu định lượng đồng thời tenofovir alafenamid và chất chuyển hóa tenofovir trong dịch sinh học, hầu hết bằng kỹ thuật LC-MS/MS, góp phần quan trọng trong nghiên cứu về dược động học, tác dụng dược lý cũng như đánh giá tương đương sinh học của thuốc [5],[12],[17],[19],[20],[30],[31].
Thị trường Việt Nam hiện nay đang lưu hành dạng chế phẩm chứa tenofovir alafenamid (dưới dạng muối tenofovir alafenamid fumarat). Tuy nhiên, chế phẩm này chưa được đánh giá tương đương sinh học so với thuốc gốc. Trong nước, vẫn chưa có công trình công bố về phương pháp định lượng đồng thời tenofovir alafenamid và chất chuyển hóa tenofovir trong huyết tương người. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI TENOFOVIR ALAFENAMID VÀ TENOFOVIR TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ” được thực hiện để góp phần vào việc đánh giá tương đương sinh học của các chế phẩm chứa tenofovir alafenamid đang lưu hành ở Việt Nam.
Mục tiêu của đề tài là: - Xác định chuẩn nội, điều kiện sắc ký và điều kiện khối phổ thích hợp. - Xây dựng quy trình chiết tenofovir alafenamid và chất chuyển hóa tenofovir trong huyết tương người. - Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời tenofovir alafenamid và chất chuyển hóa tenofovir trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS. Việc thẩm định được thực hiện theo tài liệu hướng dẫn của US-FDA và EMA về thẩm định phương pháp phân tích mẫu sinh học.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU TENOFOVIR ALAFENAMID 1. Cấu trúc Hình 1. Cấu trúc hóa học của tenofovir alafenamid. Danh pháp IUPAC: propan-2-yl (2S)-2-[[[(2R)-1-(6-aminopurin-9-yl)propan-2- yl]oxymethyl-phenoxyphosphoryl]amino]propanoate [27],[32].
Công thức phân tử: C21H29N6O5P [27],[32]. Khối lượng phân tử: 476,474 g/mol [27],[32]. Tính chất lý hóa Tenofovir alafenamid là chất bột kết tinh màu trắng [27],[32]. Độ tan: 4,86 mg/mL ở 20 oC (trong nước) [27],[32].
Giá trị pKa: 3,96 [27],[32]. Cơ chế tác dụng Tenofovir alafenamid (TAF) là tiền chất của tenofovir (TFV), việc gắn nhóm alafenamid giúp hạn chế tác dụng của các enzym esterase, giúp thuốc trở nên ổn định hơn khi lưu thông trong cơ thể. TAF chỉ nhạy với một số enzym đặc hiệu trong tế bào đích như cathepsin A (CatA) trong tế bào máu ngoại vi và carboxylesterase 1 (CES1) trong tế bào gan. Điều này cho thấy sự bền vững của TAF so với TDF, chất dễ dàng phân hủy thành TFV khi chưa được vận chuyển đến tế bào đích làm nồng độ TFV tăng cao trong cơ thể là nguyên nhân dẫn đến nhiều độc tính trên thận và xương.
4 hấp thụ vào cơ thể, TAF đi vào tế bào gan thông qua quá trình khuếch tán thụ động và qua các kênh vận chuyển hấp thu ở gan OATP1B1 và OATP1B3 [6],[7],[15],[23]. Huyết tương Tế bào gan Khuếch tán thụ động Đào thải qua thận Hình 1. Cơ chế tác dụng của tenofovir alafenamid trên tế bào gan [15]. TAF đã được chứng minh khả năng kháng virus cao ở liều thấp hơn mười lần so với liều TDF vì tính ổn định hơn trong huyết tương và khả năng được vận chuyển hiệu quả đến tế bào đích, nơi mà sau đó được phosphoryl hóa thành chất chuyển hóa hoạt động TFV-DP.
Sau khi dùng thuốc TAF, nồng độ TFV trong huyết tương thấp hơn 90% so với trường hợp dùng TDF. TAF không phải là chất nền của OAT1 hoặc OAT3 (là các kênh vận chuyển anion trên tế bào ống thận), cùng với nồng độ TFV trong huyết tương thấp, do đó, TAF không thể tích lũy trong các tế bào ống thận, góp phần giảm nguy cơ độc tính trên thận so với TDF [22]. 5 Huyết tương Tế bào nhiễm HIV Đào thải qua thận Hình 1. Cơ chế tác dụng của tenofovir alafenamid trên tế bào nhiễm HIV [22].
Với liều đường uống TAF 25 mg tương đương với liều uống TDF 300 mg, nồng độ TFV trong huyết tương thấp hơn 90% trong khi vẫn duy trì được nồng độ cao chất chuyển hóa có hoạt tính TFV-DP trong tế bào đích [4]. Tế bào ống Đường tiêu hóa thận Huyết tương Tế bào lympho T1/2 ngắn T1/2 dài, ổn định trong huyết tương Nồng độ TFV trong huyết tương thấp hơn 90% Tế bào ống thận Hình 1. So sánh hiệu quả của việc vận chuyển đến tế bào nhiễm HIV sau khi uống các sản phẩm tenofovir [4]. Dược động học Hấp thu: Sau khi uống, TAF hấp thu nhanh, thời gian đạt nồng độ đỉnh (Tmax) khoảng 0,48 giờ, bữa ăn giàu chất béo làm tăng sinh khả dụng của thuốc (khoảng 65%), là chất nền cho P-glycoprotein, nên các thuốc như carbamazepin, oxcarbazepin, phenobarbital, phenytoin, rifabutin, rifampin, rifapentin sẽ làm giảm sự hấp thu của TAF [27].
Phân bố: TAF liên kết cao với protein huyết tương (khoảng 80%) [27]. Chuyển hóa: TAF chuyển hóa nhờ enzym carboxylesterase 1 (CES 1) ở gan và enzym cathepsin A (CatA) trong tế bào máu ngoại vi, ngoài ra còn một lượng nhỏ chuyển hóa qua cytochrom CYP3A [11],[27]. Thải trừ: chủ yếu qua phân (31,7%), một lượng nhỏ qua nước tiểu (< 1%), t1/2 = 0,51 giờ [27]. TENOFOVIR Tenofovir là chất chuyển hóa của tenofovir alafenamid.
Cấu trúc Hình 1. Cấu trúc hóa học của tenofovir. Danh pháp IUPAC: ({[(2R)-1-(6-amino-9H-purin-9-yl) propan-2-yl] oxy} methyl) phosphonic acid [33]. Công thức phân tử: C9H14N5O4P [33].
Khối lượng phân tử: 287,212 g/mol [33]. Tính chất lý hóa Tenofovir là chất bột kết tinh màu trắng [33]. 7 Độ tan: 13,4 mg/mL ở 20 oC (trong nước) [33]. Giá trị pKa: 3,8 và 6,7 [33].
Tỷ lệ liên kết với protein huyết tương thấp (khoảng 7,9 %), t1/2 = 32 giờ [33]. Cơ chế tác dụng Tenofovir alafenamid khi được hấp thu vào cơ thể bị thủy phân bởi enzym carboxylesterase 1, tạo thành chất chuyển hóa tenofovir, sau đó tenofovir được phosphoryl hóa thành chất chuyển hóa hoạt động tenofovir diphosphat (TFV-DP), chất này ức chế enzym polymerase của ADN virus viêm gan B và ức chế enzym phiên mã ngược của virus HIV-1, do cạnh tranh với chất nền tự nhiên deoxyadenosin 5′-triphosphat, sau khi gắn vào ADN sẽ chấm dứt kéo dài thêm chuỗi AND, có hiệu quả chống lại cả HBV và HIV-1 [2],[6],[15],[23]. Dược động học Tenofovir thể hiện sinh khả dụng rất thấp khi dùng đường uống. Sự giảm hấp thụ này có liên quan đến sự hiện diện của hai điện tích âm trong cấu trúc.
Điện tích âm này hạn chế sự xâm nhập tế bào và sự khuếch tán thụ động TFV qua màng tế bào và niêm mạc ruột. Do đó, TFV thường được sử dụng dưới hai dạng tiền dược là tenofovir disoproxil và tenofovir alafenamid với mục đích tăng sự bền vững, tăng sự hấp thu từ đó tăng sinh khả dụng của thuốc [33]. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) 1. Đại cương Máy phân tích phổ khối lượng (thường được gọi là máy đo phổ khối – Mass Spectrometer – MS) dựa trên sự đo lường trực tiếp tỷ lệ khối lượng theo thế điện tích (ký hiệu là m/z) của những ion trong pha khí của chất phân tích [3].
Những ion của chất phân tích được sinh ra từ nguồn ion của máy được gia tốc và được tách ra bởi bộ phận phân tích trước khi đến được bộ phận phát hiện. Tất cả quá trình này xảy ra trong một buồng có hệ thống bơm chân không sâu, đạt từ 10-3 đến 10-6 Pa [3]. 8 Phổ khối lượng thu được chỉ ra sự tương quan giữa số lượng các ion có giá trị m/z (đến bộ phận phát hiện) theo giá trị m/z. Đa số các ion đều mang điện tích dương +1 nên tỷ lệ m/z tương đương với m (do đó thường gọi là phổ khối) [3].
Thông tin từ khối phổ đồ cho phép định tính (dựa vào khối lượng phân tử, cấu trúc phân mảnh) và định lượng (dùng chất chuẩn nội hay chuẩn ngoại) với giới hạn phát hiện từ picomol (10-12 M) đến femtomol (10-15 M) [3]. Khối phổ là kỹ thuật phân tích nhạy và có tính chọn lọc tốt bằng cách đo lường trực tiếp tỷ lệ khối lượng theo điện tích của ion đó (m/z). Tuy nhiên, kỹ thuật này không thể tách một chất phân tích từ những mẫu có hàng ngàn phân tử có khối lượng phân tử giống nhau, nên cần một kỹ thuật tách trước khi vào máy khối phổ như sắc ký lỏng, sắc ký khí, điện di mao quản. Việc ghép máy sắc ký lỏng với máy khối phổ phức tạp hơn nhiều vì nhiều yếu tố không tương thích về kỹ thuật giữa hai máy cần phải giải quyết: - Máy sắc ký lỏng: hoạt động ở áp suất cao, nhiệt độ thấp, mẫu phân tích ở thể lỏng trong pha động (đôi khi khó bay hơi như dung dịch đệm), lưu lượng lớn (vài mL/phút),.