Phân lập tuyển chọn và định danh một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải kẽm và kích thích sinh trưởng thực vật từ đất vùng rễ lúa

Nghiên cứu phân lập và định danh vi khuẩn phân giải kẽm, kích thích sinh trưởng thực vật từ đất vùng rễ lúa, góp phần cải thiện nông nghiệp.

• Tác giả: Nguyễn Thị Quỳnh
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Giang
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Phân Lập, Tuyển Chọn Và Định Danh Một Số Chủng Vi Khuẩn Có Khả Năng Phân Giải Kẽm Và Kích Thích Sinh Trưởng Thực Vật Từ Đất Vùng Rễ Lúa
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• MỤC LỤC
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN I: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích của đề tài
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 2. PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Lịch sử nghiên cứu kẽm
• 2.2. Vai trò của kẽm
• 2.3. Vi sinh vật phân giải kẽm
• 2.4. Vi sinh vật kích thích sinh trưởng cây trồng
• 2.5. Giới thiệu sơ lược về cây lúa
• 3. PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
• 3.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.1.3.1. Thời gian nghiên cứu
• 3.1.3.2. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương pháp thu thập mẫu đất
• 3.3.2. Phương pháp phân lập, làm thuần và giữ giống
• 3.3.3. Khảo sát khả năng phân giải Phosphate
• 3.3.4. Khảo sát khả năng sinh Indole acetic acid (IAA)
• 3.3.5. Khảo sát khả năng sinh Siderophore
• 3.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng phân giải kẽm của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 3.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cơ chất khác nhau đến khả năng phân giải kẽm của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 3.3.8. Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn đến khả năng nảy mầm, sinh trưởng và sinh khối cây lúa
• 3.3.9. Phương pháp xác định đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 3.3.10. Định danh một số chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp giải trình tự đoạn nucleotide 16S rRNA
• 4. PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng phân giải kẽm
• 4.2. Xác định hoạt tính phân giải kẽm của các chủng vi khuẩn
• 4.3. Khảo sát khả năng sinh Indole acetic acid (IAA) của các chủng vi khuẩn
• 4.4. Khảo sát khả năng phân giải Phosphate của các chủng vi khuẩn
• 4.5. Khảo sát khả năng sinh Siderophore của các chủng vi khuẩn
• 4.6. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng phân giải kẽm của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 4.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
• 4.6.2. Ảnh hưởng của pH
• 4.6.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy các chủng vi khuẩn
• 4.7. Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cơ chất khác nhau đến khả năng phân giải kẽm của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 4.7.1. Ảnh hưởng của nguồn Carbon
• 4.7.2. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ
• 4.8. Đánh giá ảnh hưởng của một số chủng vi khuẩn tuyển chọn đến tỷ lệ nảy mầm và khả năng sinh trưởng và sinh khối của giống lúa TBR225
• 4.9. Phương pháp xác định đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 4.10. Định danh một số chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp giải trình tự đoạn nucleotide 16S rRNA
• 4.10.1. Tách chiết DNA
• 4.10.2. Kết quả PCR
• 4.10.3. Kết quả giải trình tự nucleotide 16S rRNA
• 5. PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về vi khuẩn phân giải kẽm và cây lúa

Vi khuẩn phân giải kẽm đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện dinh dưỡng cho cây lúa. Kẽm là một yếu tố vi lượng thiết yếu, cần thiết cho sự phát triển của cây trồng. Việc sử dụng vi khuẩn để phân giải kẽm giúp tăng cường khả năng hấp thụ kẽm của cây lúa, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

1.1. Vai trò của kẽm trong dinh dưỡng cây trồng

Kẽm tham gia vào nhiều quá trình sinh lý của cây, bao gồm quang hợp và tổng hợp protein. Thiếu kẽm có thể dẫn đến sự phát triển kém và giảm năng suất cây trồng.

1.2. Các loại vi khuẩn phân giải kẽm

Một số chủng vi khuẩn như Bacillus và Pseudomonas có khả năng phân giải kẽm hiệu quả. Chúng giúp chuyển hóa kẽm từ dạng không hòa tan sang dạng hòa tan, dễ hấp thụ hơn cho cây.

II. Thách thức trong việc sử dụng kẽm cho cây lúa

Mặc dù kẽm rất quan trọng, nhưng việc thiếu hụt kẽm trong đất đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng. Nhiều loại đất nông nghiệp không đủ kẽm, ảnh hưởng đến sự phát triển của cây lúa. Việc sử dụng phân bón hóa học không phải lúc nào cũng hiệu quả.

2.1. Nguyên nhân thiếu hụt kẽm trong đất

Thiếu hụt kẽm có thể do đất bị rửa trôi, pH đất không phù hợp hoặc do sự cạnh tranh với các nguyên tố khác. Điều này dẫn đến việc cây lúa không thể hấp thụ đủ kẽm.

2.2. Tác động của thiếu kẽm đến cây lúa

Thiếu kẽm gây ra hiện tượng vàng lá, còi cọc và giảm năng suất. Cây lúa không thể phát triển bình thường, ảnh hưởng đến sản lượng lương thực.

III. Phương pháp phân lập vi khuẩn phân giải kẽm

Phân lập vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa là một bước quan trọng trong nghiên cứu. Các phương pháp nuôi cấy và phân lập giúp xác định các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải kẽm tốt nhất.

3.1. Quy trình phân lập vi khuẩn

Quy trình bao gồm thu thập mẫu đất, nuôi cấy trong môi trường thích hợp và xác định các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải kẽm.

3.2. Đánh giá khả năng phân giải kẽm

Các chủng vi khuẩn được đánh giá dựa trên khả năng phân giải kẽm trong môi trường nuôi cấy. Kết quả giúp xác định chủng vi khuẩn tiềm năng cho ứng dụng thực tiễn.

IV. Ứng dụng vi khuẩn trong nông nghiệp để kích thích sinh trưởng cây lúa

Việc sử dụng vi khuẩn phân giải kẽm không chỉ giúp cải thiện dinh dưỡng mà còn kích thích sinh trưởng của cây lúa. Các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn có thể tăng tỷ lệ nảy mầm và sinh khối của cây.

4.1. Tác động của vi khuẩn đến sự phát triển của cây lúa

Vi khuẩn giúp cây lúa phát triển mạnh mẽ hơn, tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi. Điều này dẫn đến năng suất cao hơn.

4.2. Kết quả nghiên cứu về vi khuẩn và cây lúa

Nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn như HZ 4.2 có ảnh hưởng tích cực đến chiều cao cây, số lá và khối lượng cây lúa.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu vi khuẩn phân giải kẽm

Nghiên cứu về vi khuẩn phân giải kẽm mở ra nhiều triển vọng cho nông nghiệp bền vững. Việc ứng dụng vi khuẩn trong sản xuất nông nghiệp có thể giúp cải thiện năng suất và chất lượng cây lúa.

5.1. Tương lai của nghiên cứu vi khuẩn trong nông nghiệp

Nghiên cứu tiếp tục phát triển các chủng vi khuẩn mới và cải thiện quy trình sản xuất chế phẩm sinh học. Điều này sẽ giúp nâng cao hiệu quả sử dụng kẽm trong nông nghiệp.

5.2. Lợi ích của việc sử dụng vi khuẩn trong sản xuất nông nghiệp

Sử dụng vi khuẩn không chỉ giúp cải thiện dinh dưỡng cho cây trồng mà còn giảm thiểu việc sử dụng phân bón hóa học, góp phần bảo vệ môi trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Kẽm (Zn) là một vi chất dinh dưỡng thiết yếu đối với thực vật, đóng vai trò xúc tác trong hơn 300 loại enzyme sinh học, tham gia cấu trúc của hàng nghìn protein, đồng thời giữ chức năng trung tâm trong quá trình quang hợp, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa carbohydrate, điều tiết nồng độ auxin và sản xuất các enzyme chống oxy hóa để bảo vệ tế bào thực vật trước các áp lực môi trường. Mặc dù kẽm đóng vai trò then chốt đối với sự phát triển sinh học, thực vật chỉ có thể hấp thu kẽm dưới dạng ion hòa tan $\text{Zn}^{2+}$. Hiện tượng thiếu hụt kẽm đang diễn ra trên diện rộng ở các vùng đất nông nghiệp toàn cầu, trở thành một trong những nguyên nhân hàng đầu làm suy giảm năng suất cây trồng.

Trên cây lúa (Oryza sativa L.) – loại cây lương thực chủ đạo nuôi sống hơn một nửa dân số thế giới – tình trạng thiếu kẽm làm suy giảm nghiêm trọng sức sinh trưởng của cây, dẫn đến hiện tượng cây còi cọc, vàng úa lá non, giảm kích thước phiến lá, hạn chế sự hình thành và phân hóa mầm hoa, ảnh hưởng xấu đến khả năng thụ phấn, đậu hạt và phát triển bộ rễ. Để khắc phục sự thiếu hụt này, các nguồn phân bón kẽm như kẽm sulfate ($\text{ZnSO}_4$) và kẽm oxide ($\text{ZnO}$) thường được sử dụng. Trong đó, $\text{ZnO}$ chứa hàm lượng kẽm cao (khoảng 80% Zn) và có giá thành rẻ hơn, nhưng lại có nhược điểm lớn là khó tan và nhanh chóng bị cố định trong các phức hệ khoáng của đất, khiến cây trồng không thể trực tiếp hấp thu. Việc ứng dụng nhóm vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Rhizobacteria - PGPR) có khả năng hòa tan các hợp chất kẽm khó tan, đồng thời tiết ra các hoạt chất sinh học hỗ trợ cây trồng đang là hướng tiếp cận sinh học bền vững nhằm thay thế dần phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật.

Nghiên cứu được thực hiện nhằm giải quyết mục tiêu tổng quát: phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa có hoạt tính phân giải kẽm cao, sở hữu các đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật, đồng thời phân tích ảnh hưởng của các chủng tuyển chọn lên tỷ lệ nảy mầm, khả năng sinh trưởng và sinh khối của giống lúa thuần TBR225.

Để đạt được mục tiêu trên, tác giả đã xác định 6 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa có khả năng phân giải kẽm khó tan (nguồn $\text{ZnO}$).
2. Khảo sát khả năng phân giải phosphate, khả năng sinh tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) và khả năng sinh siderophore của các chủng vi khuẩn phân lập được.
3. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy) và các nguồn dinh dưỡng carbon, nitơ khác nhau đến khả năng phân giải kẽm của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn.
4. Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn đến tỷ lệ nảy mầm, các chỉ tiêu sinh trưởng và sinh khối của giống lúa TBR225 trong điều kiện phòng thí nghiệm.
5. Khảo sát đặc điểm hình thái tế bào, khuẩn lạc và các đặc tính sinh lý, hóa sinh của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
6. Định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên việc khuếch đại và giải trình tự đoạn nucleotide gen mã hóa 16S rRNA.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn phân giải kẽm và kích thích sinh trưởng thực vật sống trong đất vùng rễ lúa; giống lúa thuần thử nghiệm TBR225 (lai tạo bởi KS. Trần Mạnh Báo và cộng sự, bản quyền thuộc Công ty Cổ phần Tập đoàn ThaiBinh Seed).
• Phạm vi không gian: 06 mẫu đất vùng rễ lúa thu thập tại khu vực đồng ruộng thuộc xã Yên Sơn và xã Phượng Cách, huyện Quốc Oai, thành phố Hà Nội.
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được triển khai thực hiện từ tháng 10 năm 2021 đến tháng 04 năm 2022 tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý luận của đề tài dựa trên tương tác giữa vi sinh vật vùng rễ (PGPR) và cây lúa. Vi khuẩn vùng rễ thực hiện quá trình hòa tan kẽm cation thông qua cơ chế axit hóa môi trường: vi khuẩn bài tiết các acid hữu cơ vào vùng đất quanh rễ, làm giảm độ pH cục bộ, phá vỡ liên kết không tan của $\text{ZnO}$ hoặc $\text{ZnCO}_3$ thành ion $\text{Zn}^{2+}$. Song song đó, vi khuẩn PGPR còn hỗ trợ sinh trưởng thực vật thông qua các cơ chế trực tiếp và gián tiếp: chuyển hóa nguồn lân khó tan ($\text{Ca}_3(\text{PO}_4)_2$) thành dạng hòa tan nhờ tiết enzyme phosphatase và các acid hữu cơ (như acid gluconic, acid 2-ketogluconic); sinh tổng hợp phytohormone auxin (chủ yếu là Indole-3-acetic acid - IAA) kích thích kéo dài tế bào rễ và phân nhánh rễ; tiết hợp chất tạo phức chelating sắt (siderophore) có ái lực cao với $\text{Fe}^{3+}$ giúp thực vật hấp thu vi lượng sắt, đồng thời cạnh tranh dinh dưỡng sắt nhằm ức chế nấm bệnh vùng rễ.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế đồng bộ từ khâu thu thập mẫu, sàng lọc in vitro đến thử nghiệm sinh học:

• Phương pháp thu thập mẫu đất: Tiến hành thu 06 mẫu đất vùng rễ lúa theo tiêu chuẩn TCVN 7538-1:2006 bằng phương pháp đường chéo hoặc ziczac. Dùng dụng cụ lấy mẫu hình chữ T đường kính lõi 2,5 cm, lấy đất ở độ sâu 10 – 20 cm, cách bờ ruộng 1 m, bảo quản trong túi zip vô trùng.
• Phương pháp phân lập, làm thuần và sàng lọc: Mẫu đất được phơi khô, nghiền nhỏ, rây qua sàng 2 mm. Pha loãng mẫu đất theo dải nồng độ từ $10^{-1}$ đến $10^{-6}$. Dùng dịch mẫu ở nồng độ $10^{-5}$ và $10^{-6}$ cấy trải trên môi trường thạch Bunt và Rovira hoặc môi trường thạch khoáng ZnSB có bổ sung 0,1% nguồn kẽm oxide ($\text{ZnO}$) khó tan, ủ ở $30 \pm 1\text{ }^\circ\text{C}$ từ 24 giờ đến 7 ngày. Làm thuần khuẩn lạc trên môi trường Luria Bertani (LB) thạch và lưu giữ giống trên thạch nghiêng LB ở $4\text{ }^\circ\text{C}$ cùng dung dịch glycerol 30% ở $-80\text{ }^\circ\text{C}$.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính hòa tan kẽm và phân giải lân:
  • Diện tích vòng phân giải ($S$ tính bằng $\text{cm}^2$): $S = \left(\frac{D - d}{2}\right)^2 \times \pi$ (với $D$ là đường kính vòng phân giải, $d$ là đường kính khuẩn lạc).
  • Hiệu suất hòa tan kẽm ($SE$ tính bằng %): $SE = \frac{D}{d} \times 100$.
  • Khả năng phân giải phosphate được khảo sát trên môi trường National Botanical Research Institute Phosphate (NBRIP) thạch chứa $\text{Ca}_3(\text{PO}_4)_2$ ở $30 \pm 1\text{ }^\circ\text{C}$ trong 72 giờ.
• Phương pháp định lượng IAA: Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường LB lỏng có bổ sung 100 mg/l L-tryptophan ở $28 \pm 1\text{ }^\circ\text{C}$, lắc 160 vòng/phút trong 48 giờ. Ly tâm lạnh 10.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi phản ứng với thuốc thử Salkowski ($\text{FeCl}_3$ và $\text{H}_2\text{SO}4$), ủ tối 10 – 15 phút và đo mật độ quang phổ tại bước sóng $\lambda = 530\text{ nm}$ ($\text{OD}{530}$), tính toán hàm lượng dựa vào đồ thị đường chuẩn IAA tinh khiết.
• Phương pháp kiểm tra siderophore: Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch xanh Chrome Azurol S (CAS) ở $28 \pm 2\text{ }^\circ\text{C}$ trong 72 giờ; đánh giá phản ứng dương tính qua sự chuyển đổi màu sắc từ xanh sang tím, hồng hoặc vàng cam xung quanh khuẩn lạc.
• Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân giải kẽm:
  • Nhiệt độ nuôi cấy: Khảo sát tại các thang nhiệt độ 25, 30, 37 và $40\text{ }^\circ\text{C}$ trên môi trường ZnSB bổ sung 0,1% $\text{ZnO}$.
  • Độ pH: Thử nghiệm ở các dải pH 4, 5, 6, 7 và 8.
  • Thời gian nuôi cấy: Đánh giá tại các mốc 3 ngày, 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày và 20 ngày.
  • Nguồn cơ chất: Nguồn carbon (glucose, fructose, xylose, maltose, lactose, dextrin) và nguồn nitơ ($(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$, $\text{KNO}_3$, $\text{NH}_4\text{Cl}$, $\text{NH}_4\text{NO}_3$, peptone).
• Phương pháp đánh giá trên giống lúa TBR225: Hạt giống được khử trùng bề mặt bằng dung dịch $\text{NaClO}$ 1% trong 10 phút, cồn $70^\circ$ trong 1 phút, rửa 4 lần bằng nước cất vô trùng. Hạt được ngâm dịch huyền phù vi khuẩn ($10^6 - 10^8\text{ CFU/ml}$) trong 24 giờ. Thí nghiệm nảy mầm bố trí 50 hạt/đĩa petri lót giấy lọc, ủ tối 3 ngày. Thí nghiệm chậu vại gồm 30 chậu nhựa chứa 250 g đất phù sa khử trùng ($120\text{ }^\circ\text{C}$ trong 1 giờ), trồng 6 cây mạ/chậu, tưới bổ sung 1 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn vào ngày thứ 3 và thứ 5. Theo dõi trong 20 ngày với các chỉ tiêu: chiều cao cây, chiều dài rễ, số lá, số rễ và sinh khối tươi.
• Phương pháp hình thái và hóa sinh: Nhuộm Gram soi kính hiển vi quang học độ phóng đại 100x; kiểm tra khả năng di động trên môi trường LB bán lỏng (0,5% agar); thử nghiệm catalase bằng $\text{H}_2\text{O}_2$ 3%; thử nghiệm đồng hóa citrate trên thạch Simmon Citrate (SAC); phản ứng Methyl Red (MR) và phản ứng Voges-Proskauer (VP) trên môi trường MR-VP broth.
• Phương pháp sinh học phân tử và định danh: Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB (Farhad Masoomi-Aladizgeh et al., 2016), đo quang phổ $\text{A}{260}/\text{A}{280}$ kiểm tra độ tinh sạch và điện di gel agarose 1%. Nhân bản đoạn gen 16S rRNA bằng phản ứng PCR (cặp mồi 27F: 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' và 1492R: 5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGGC-3'). Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di gel agarose 1,5%. Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự tại Singapore, so sánh độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) và thiết lập cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA X (thuật toán Neighbor-Joining, giá trị lặp bootstrap 1000 lần).
• Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel 2016 và phân tích thống kê bằng phần mềm InfoStat 2020.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Mở đầu

Tác giả trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ vai trò của kẽm đối với quá trình xúc tác sinh hóa ở thực vật và thực trạng thiếu kẽm trong đất nông nghiệp. Tác giả phân tích điểm nghẽn của việc sử dụng phân bón hóa học chứa kẽm (dễ bị cố định thành dạng khó tiêu) và nêu bật tiềm năng của vi khuẩn vùng rễ (PGPR) trong việc tăng cường hấp thu kẽm, kích thích phát triển hệ rễ lúa. Từ đó, xác định rõ mục đích, đối tượng, nội dung nghiên cứu cùng ý nghĩa khoa học (cung cấp dẫn liệu về vi sinh vật phân giải kẽm tại Việt Nam) và ý nghĩa thực tiễn (tạo nguồn vật liệu vi sinh để phát triển phân bón sinh học).

Phần II: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về 5 nội dung chính:

• Lịch sử nghiên cứu kẽm: Các mốc lịch sử nghiên cứu kẽm trên thực vật (1869), động vật (1934) và con người (1961), nhấn mạnh vai trò của kẽm là nguyên tố vi lượng quan trọng thứ tư sau N, P, K.
• Vai trò của kẽm: Phân tích cơ chế sinh học của kẽm đối với cấu trúc tế bào, enzyme $\text{SOD}$, carbonic anhydrase, quá trình quang hợp, tổng hợp protein và tổng hợp phytohormone ở thực vật; nhu cầu kẽm mô lá lúa (15 – 20 mg/kg lá).
• Vi sinh vật phân giải kẽm: Trình bày cơ chế hòa tan kẽm của vi khuẩn thông qua quá trình axit hóa môi trường, tổng quan các chi vi khuẩn phân giải kẽm tiềm năng đã được công bố (Pseudomonas, Acinetobacter, Gluconacetobacter, Bacillus).
• Vi sinh vật kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR): Làm rõ các cơ chế hỗ trợ dinh dưỡng qua phân giải khoáng (lân, kẽm), sinh chất điều hòa sinh trưởng (IAA) và sinh siderophore kiểm soát nấm bệnh.
• Giới thiệu sơ lược về cây lúa: Cung cấp đặc điểm hình thái học rễ, thân, lá của cây lúa qua 4 giai đoạn sinh trưởng (mạ, đẻ nhánh, đòng - trổ, chín) và giá trị kinh tế của ngành sản xuất lúa gạo, phụ phẩm rơm rạ tại Việt Nam và trên thế giới.

Phần III: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ hóa chất, trang thiết bị, môi trường nuôi cấy chuyên dụng (ZnSB, LB, NBRIP, CAS, MR-VP), nguồn gốc mẫu đất thu thập tại Quốc Oai (Hà Nội), và giống lúa thuần TBR225. Tác giả trình bày chuẩn hóa toàn bộ các công thức tính toán diện tích vòng phân giải, hiệu suất hòa tan kẽm, quy trình trắc quang định lượng IAA, quy trình bố trí thí nghiệm nảy mầm và chậu vại (20 ngày), các phản ứng sinh lý hóa sinh vi sinh vật, cũng như thông số chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA.

Phần IV: Kết quả và thảo luận

Đây là chương nội dung cốt lõi của khóa luận, phản ánh đầy đủ các phát hiện thực nghiệm:

• Kết quả phân lập và xác định hoạt tính phân giải kẽm: Từ 6 mẫu đất ban đầu, phân lập được 26 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải $\text{ZnO}$ trên môi trường ZnSB. Các chủng tạo vòng phân giải với đường kính và diện tích khác nhau; trong đó chủng HZ 1.1 có đường kính vòng phân giải kẽm lớn nhất đạt 2,1 cm. Hiệu suất hòa tan kẽm ($SE$) của 26 chủng dao động rộng từ 111% đến 600%.
• Khảo sát các hoạt tính kích thích sinh trưởng:
  • Khả năng sinh IAA: Cả 26 chủng đều có khả năng sinh tổng hợp IAA với sự hiện diện của L-tryptophan, hàm lượng sinh ra dao động từ 2,76 đến 55,05 µg/ml (tính toán dựa trên đường chuẩn $y = 0,0175x - 0,0288$ với $R^2 = 0,9957$).
  • Khả năng phân giải phosphate: 20/26 chủng có khả năng phân giải $\text{Ca}_3(\text{PO}_4)_2$ trên môi trường NBRIP thạch, tạo diện tích vòng phân giải từ nhỏ đến 0,79 $\text{cm}^2$ (chủng HZ 1.8 đạt cực đại 0,79 $\text{cm}^2$, tiếp theo là chủng HZ 3.2 đạt 0,64 $\text{cm}^2$).
  • Khả năng sinh siderophore: Có 22/26 chủng làm chuyển màu chỉ thị môi trường CAS từ xanh sang vàng cam, khẳng định hoạt tính tổng hợp siderophore giữ sắt.
• Tuyển chọn 5 chủng vi khuẩn ưu tú: Dựa trên tổng hợp hoạt tính phân giải kẽm vượt trội và các đặc tính PGPR, tác giả chọn ra 5 chủng xuất sắc nhất gồm HZ 1.1, HZ 2.11, HZ 3.6, HZ 4.2 và HZ 6.9 để tiến hành nghiên cứu sâu hơn.
• Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy và cơ chất: Cả 5 chủng tuyển chọn đều biểu hiện khả năng phân giải kẽm cao nhất ở nhiệt độ $30\text{ }^\circ\text{C}$ và pH trong khoảng 6 – 7; hoạt tính giảm mạnh ở $40\text{ }^\circ\text{C}$. Về cơ chất, nguồn carbon glucose và lactose cùng nguồn nitơ vô cơ $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$ và nitơ hữu cơ peptone là thích hợp nhất cho khả năng hòa tan kẽm.
• Thử nghiệm sinh học trên giống lúa TBR225: Cả 5 chủng tuyển chọn đều có tác động kích thích sự nảy mầm và sinh trưởng của cây lúa sau 20 ngày so với đối chứng không xử lý vi khuẩn. Chủng HZ 4.2 biểu hiện hiệu quả nổi trội nhất trên toàn bộ các chỉ tiêu theo dõi (chiều cao thân cây, chiều dài rễ, số lượng lá, số lượng rễ và khối lượng tươi của cây).
• Đặc điểm hình thái, sinh hóa và định danh phân tử: Xác định các chỉ tiêu nhuộm Gram, hình thái tế bào, hoạt tính catalase, đồng hóa citrate, phản ứng MR và VP. Kết quả phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA định danh 5 chủng vi khuẩn thuộc 4 loài khác nhau.

Phần V: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các kết quả đạt được về số lượng chủng phân lập, thông số tối ưu, chủng vi khuẩn tốt nhất và kết quả định danh 16S rRNA. Kiến nghị tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về tính an toàn sinh học, đánh giá hiệu quả ngoài đồng ruộng và thử nghiệm công nghệ tạo chế phẩm vi sinh.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã thu thập và xử lý thực nghiệm 06 mẫu đất tại huyện Quốc Oai (Hà Nội), phân lập thành công 26 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải kẽm khó tan ($\text{ZnO}$). Các kết quả định lượng cụ thể thu được gồm:

• Hoạt tính phân giải kẽm: Hiệu suất hòa tan kẽm ($SE$) của 26 chủng dao động từ 111% đến 600%. Một số chủng có hiệu suất hòa tan rất cao như HZ 2.6 (đạt 600%), các chủng HZ 1.1, HZ 2.11, HZ 3.6, HZ 4.2 đạt từ 433,33% đến 533,33%. Vòng phân giải kẽm lớn nhất ghi nhận được ở chủng HZ 1.1 với đường kính 2,1 cm.
• Đặc tính kích thích sinh trưởng (PGPR):
  • 100% (26/26) chủng vi khuẩn sinh tổng hợp được IAA trong môi trường bổ sung L-tryptophan với hàm lượng dao động từ 2,76 đến 55,05 µg/ml.
  • 76,92% (20/26) chủng có khả năng phân giải phosphate khó tan ($\text{Ca}_3(\text{PO}_4)_2$) trên môi trường NBRIP, diện tích vòng phân giải lớn nhất đạt 0,79 $\text{cm}^2$ (chủng HZ 1.8) và 0,64 $\text{cm}^2$ (chủng HZ 3.2).
  • 84,61% (22/26) chủng có khả năng sinh siderophore trên môi trường chỉ thị CAS.
• Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho phân giải kẽm: Nhiệt độ tối ưu là $30\text{ }^\circ\text{C}$; pH tối ưu từ 6 – 7; nguồn carbon tối ưu là glucose và lactose; nguồn nitơ tối ưu là $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$ và peptone.
• Hiệu quả trên lúa TBR225: Sau 20 ngày nuôi trồng trong chậu vại chứa đất phù sa khử trùng, cả 5 chủng tuyển chọn đều giúp cây lúa sinh trưởng vượt trội so với đối chứng. Trong đó, chủng HZ 4.2 cho kết quả tốt nhất về tỷ lệ nảy mầm, chiều cao chồi, chiều dài rễ, số rễ, số lá và khối lượng sinh khối tươi của cây mạ.
• Kết quả định danh phân tử 5 chủng vi khuẩn tuyển chọn:

Ký hiệu chủng	Loài tương đồng nhất trên GenBank (NCBI)	Tỷ lệ tương đồng (%)	Tên định danh đặt cho chủng
HZ 1.1	Klebsiella pneumoniae	98,51%	Klebsiella pneumoniae HZ1.1
HZ 2.11	Acinetobacter sp.	98,79%	Acinetobacter sp. HZ2.11
HZ 3.6	Cytobacillus firmus	99,40%	Cytobacillus firmus HZ3.6
HZ 4.2	Pseudomonas fluorescens	99,64%	Pseudomonas fluorescens HZ4.2
HZ 6.9	Klebsiella pneumoniae	99,84%	Klebsiella pneumoniae HZ6.9

Đóng góp của đề tài:

• Về mặt lý luận: Bổ sung dẫn liệu khoa học về đặc điểm phân loại học, sinh lý, hóa sinh và tiềm năng sinh học của các chủng vi khuẩn phân giải kẽm bản địa sống tại vùng rễ lúa khu vực đồng bằng sông Hồng (Hà Nội).
• Về mặt thực tiễn: Tuyển chọn được các chủng vi sinh vật ưu tú (đặc biệt là Pseudomonas fluorescens HZ4.2) tích hợp đa hoạt tính có lợi (hòa tan kẽm, hòa tan lân, sinh IAA và siderophore), cung cấp nguồn giống vi sinh vật triển vọng phục vụ nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh và chế phẩm sinh học ứng dụng trong canh tác lúa bền vững.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận đã hoàn thành các mục tiêu đề ra ở quy mô phòng thí nghiệm, tuy nhiên vẫn còn một số giới hạn gắn liền với phạm vi nghiên cứu:

• Phạm vi đánh giá hiệu lực sinh học trên cây lúa mới dừng lại ở giai đoạn mạ (20 ngày sau gieo) trong điều kiện chậu vại với đất đã hấp tiệt trùng tại phòng thí nghiệm. Thử nghiệm chưa phản ánh đầy đủ ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đến các giai đoạn phát triển tiếp theo của cây lúa như đẻ nhánh, làm đòng, trổ bông và năng suất thu hoạch hạt thóc thực tế.
• Điều kiện thí nghiệm sử dụng đất khử trùng nên chưa phản ánh được áp lực cạnh tranh sinh thái thực tế giữa các chủng vi khuẩn bổ sung với hệ vi sinh vật bản địa tự nhiên trong đất lúa ngoài đồng ruộng.
• Nghiên cứu tập trung khảo sát chủ yếu trên nguồn kẽm oxide ($\text{ZnO}$), chưa mở rộng so sánh chuyên sâu với các dạng kẽm khó tan khác như $\text{ZnCO}_3$ hay $\text{Zn}_3(\text{PO}_4)_2$. Ngoài ra, hai chủng vi khuẩn định danh là Klebsiella pneumoniae (HZ1.1 và HZ6.9) cần được kiểm tra nghiêm ngặt về tính an toàn sinh học trước khi cân nhắc phát triển ứng dụng thực tế.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất:

• Tiếp tục khảo sát đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn tuyển chọn (đặc biệt là Pseudomonas fluorescens HZ4.2) qua toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của cây lúa ngoài đồng ruộng trên các chân đất nông nghiệp khác nhau.
• Nghiên cứu thử nghiệm phối hợp các chủng vi khuẩn tạo thành tổ hợp vi sinh vật (consortium) có khả năng tương hỗ để nâng cao hiệu lực phân giải khoáng và kích thích sinh trưởng.
• Nghiên cứu chất mang, kỹ thuật lên men và quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh dạng lỏng hoặc dạng bột nhằm kéo dài thời gian bảo quản và duy trì mật độ tế bào sống phục vụ ứng dụng đại trà.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho:

• Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Nông học, Khoa học Đất và Quản lý Dinh dưỡng Cây trồng.
• Những người thực hiện đề tài về phân lập vi sinh vật vùng rễ (PGPR), vi sinh vật phân giải khoáng (Zn, P, K), và nghiên cứu các chất kích thích sinh trưởng tự nhiên trong nông nghiệp sinh thái.

Các phần có giá trị tham khảo kỹ thuật nổi bật:

• Quy trình sàng lọc vi khuẩn hòa tan kẽm trên môi trường khoáng ZnSB bổ sung $\text{ZnO}$ và công thức chuẩn hóa để tính toán diện tích vòng phân giải cùng hiệu suất hòa tan kẽm ($SE$).
• Giao thức định lượng auxin/IAA bằng thuốc thử Salkowski kết hợp máy đo quang phổ ở bước sóng 530 nm với phương trình đường chuẩn chi tiết.
• Kỹ thuật nhuộm phát hiện siderophore trên đĩa thạch CAS và phương pháp khuếch đại gen 16S rRNA bằng cặp mồi phổ biến 27F/1492R.

Câu hỏi thường gặp

1. Năm chủng vi khuẩn có khả năng phân giải kẽm tốt nhất được tuyển chọn trong đề tài đã được định danh thuộc những loài nào?

Dựa trên kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rRNA và tra cứu độ tương đồng trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI), 5 chủng vi khuẩn tuyển chọn được định danh lần lượt là:

• Chủng HZ 1.1: Tương đồng 98,51% với loài Klebsiella pneumoniae, định danh là Klebsiella pneumoniae HZ1.1.
• Chủng HZ 2.11: Tương đồng 98,79% với chi Acinetobacter, định danh là Acinetobacter sp. HZ2.11.
• Chủng HZ 3.6: Tương đồng 99,40% với loài Cytobacillus firmus, định danh là Cytobacillus firmus HZ3.6.
• Chủng HZ 4.2: Tương đồng 99,64% với loài Pseudomonas fluorescens, định danh là Pseudomonas fluorescens HZ4.2.
• Chủng HZ 6.9: Tương đồng 99,84% với loài Klebsiella pneumoniae, định danh là Klebsiella pneumoniae HZ6.9.

2. Điều kiện môi trường (nhiệt độ, pH, nguồn carbon và nitơ) nào là tối ưu cho hoạt tính phân giải kẽm của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn?

Thực nghiệm khảo sát trên 5 chủng vi khuẩn tuyển chọn cho thấy:

• Nhiệt độ thích hợp nhất cho khả năng hòa tan kẽm là $30\text{ }^\circ\text{C}$ (hoạt tính giảm ở $37\text{ }^\circ\text{C}$ và giảm sút mạnh ở $40\text{ }^\circ\text{C}$ do sinh trưởng bị kìm hãm).
• Dải pH tối ưu cho hoạt tính hòa tan kẽm nằm trong khoảng pH 6 – 7.
• Nguồn dinh dưỡng carbon kích thích phân giải kẽm tốt nhất là glucose và lactose.
• Nguồn dinh dưỡng nitơ kích thích phân giải kẽm tốt nhất là dạng nitơ vô cơ $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$ và nitơ hữu cơ peptone.

3. Chủng vi khuẩn nào thể hiện hiệu quả kích thích sinh trưởng và phát triển cao nhất trên giống lúa TBR225?

Chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens HZ4.2 thể hiện hiệu quả vượt trội nhất đối với giống lúa TBR225. Sau 20 ngày theo dõi trong điều kiện chậu vại phòng thí nghiệm, cây lúa ở nghiệm thức xử lý dịch nuôi chủng HZ 4.2 đạt giá trị cao nhất về tỷ lệ nảy mầm hạt, chiều cao thân cây, chiều dài rễ, số lượng lá/cây, số lượng rễ/cây và khối lượng sinh khối tươi của cây mạ so với đối chứng và các nghiệm thức xử lý các chủng vi khuẩn còn lại.

4. Tác giả đã sử dụng phương pháp và chỉ thị hóa sinh nào để định lượng hoạt tính sinh IAA và đánh giá khả năng sinh siderophore?

• Hoạt tính sinh Indole-3-acetic acid (IAA) được định lượng bằng phương pháp trắc quang phổ: Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB lỏng bổ sung 100 mg/l L-tryptophan trong 48 giờ, ly tâm thu dịch trong phản ứng với thuốc thử Salkowski ($\text{FeCl}_3$ trong dung dịch $\text{H}_2\text{SO}4$). Phản ứng tạo phức màu hồng được đo mật độ quang ở bước sóng 530 nm ($\text{OD}{530}$) và nồng độ IAA ($\mu\text{g/ml}$) được tính qua phương trình đường chuẩn $y = 0,0175x - 0,0288$ ($R^2 = 0,9957$).
• Khả năng sản sinh siderophore được đánh giá trên môi trường thạch Chrome Azurol S (CAS): Dựa trên sự đổi màu của phức hợp thuốc thử chỉ thị từ màu xanh dương đặc trưng sang màu tím, hồng hoặc vàng cam xung quanh khuẩn lạc sau 72 giờ nuôi cấy ở $28 \pm 2\text{ }^\circ\text{C}$.

5. Phương pháp thu thập và xử lý các mẫu đất vùng rễ lúa tại huyện Quốc Oai được tiến hành theo tiêu chuẩn nào?

Các mẫu đất vùng rễ lúa được thu thập tại 6 điểm đồng ruộng thuộc xã Yên Sơn và xã Phượng Cách (huyện Quốc Oai, Hà Nội) vào tháng 11/2021 ngay sau vụ lúa mùa, tuân thủ theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7538-1:2006. Mẫu đất được lấy theo sơ đồ đường chéo hoặc ziczac bằng dụng cụ lấy mẫu hình chữ T có đường kính lõi 2,5 cm ở tầng đất độ sâu từ 10 – 20 cm, cách bờ ruộng 1 m, chứa trong túi zip vô trùng, sau đó đem về phòng thí nghiệm phơi khô, nghiền nhỏ và rây qua mắt sàng 2 mm trước khi tiến hành phân lập.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Quỳnh đã phân lập thành công 26 chủng vi khuẩn vùng rễ lúa tại huyện Quốc Oai (Hà Nội), qua đó tuyển chọn được 5 chủng ưu tú tích hợp đồng thời khả năng phân giải kẽm khó tan ($\text{ZnO}$), phân giải phosphate, sinh tổng hợp phytohormone IAA và sinh siderophore cạnh tranh sắt. Các chủng vi khuẩn sinh trưởng và phân giải kẽm tối ưu ở điều kiện nhiệt độ $30\text{ }^\circ\text{C}$, pH 6 – 7, sử dụng hiệu quả nguồn carbon glucose, lactose và nguồn nitơ $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$, peptone. Kết quả thử nghiệm trên giống lúa thuần TBR225 khẳng định chủng Pseudomonas fluorescens HZ4.2 có tác động thúc đẩy vượt trội đến tỷ lệ nảy mầm, các chỉ tiêu hình thái và sinh khối tươi của cây mạ sau 20 ngày theo dõi. Công trình cung cấp các dẫn liệu sinh học thực nghiệm có độ tin cậy cao, tạo nền tảng nguồn giống vi sinh vật triển vọng phục vụ công tác phát triển chế phẩm phân bón sinh học nhằm nâng cao năng suất và hướng tới nền canh tác lúa bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Kẽm (Zn) là một vi chất dinh dưỡng cần thiết với thực vật, do nó có vai trò quan trọng trong việc xúc tác một số phản ứng trao đổi chất ở thực vật. Kẽm là một yếu tố không thể thiếu của hàng nghìn protein trong hệ thống sinh học và tham gia xúc tác hơn 300 loại enzyme (Zastrow & Pecoraro, 2014). Kẽm có vai trò quan trọng đối với khả năng chống lại các áp lực môi trường, quang hợp, chuyển hoá nitơ và carbohydrate, tổng hợp và hình thành protein, điều tiết auxin và sản xuất các enzyme chống oxy hoá (Azhar Hussain et al. Mặc dù đóng vai trò quan trọng đối với thực vật xong sự thiếu hụt kẽm trong đất đang gây ra nguy cơ nghiêm trọng cho nền nông nghiệp bền vững trên toàn thế giới.

Tuy nhiên, thực vật chỉ có thể hấp thụ kẽm ở dạng hoà tan Zn2+. Một số loại đất nông nghiệp đang thiếu kẽm diện rộng được coi là nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng trên toàn thế giới (Fageria et al. Trong một nghiên cứu khác vào năm 2008, Robin Graham đã khẳng định rằng Zn là yếu tố ưu tiên hàng đầu trong số các vi chất dinh dưỡng cho việc giải quyết các vẫn đề trong nông nghiệp (Robin Graham, 2008). Trong nông nghiệp, lúa là cây lương thực quan trọng với hầu hết dân số thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển.

Theo nghiên cứu của Gandhi và cộng sự năm 2016 đã chỉ ra rằng tầm quan trọng của việc sử dụng vi chất dinh dưỡng vẫn chưa được xem xét nhiều trên cây lúa, đặc biệt đối với nguyên tố vi lượng có vai trò quan trọng trong việc hình thành enzyme như kẽm (Gandhi & Muralidharan, 2016). Thiếu kẽm trong lúa khiến cây còi cọc, vàng lá. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng thiếu kẽm ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển bình thường của các mô hoa, khả năng ra hoa, thụ phấn và đậu quả, đồng thời dẫn đến chậm phát triển chồi, úa lá, giảm kích thước lá, nhạy cảm với nhiệt, ánh sáng, dễ nhiễm nấm cũng như ảnh hưởng đến năng suất hạt, sự hình 1 thành phân hoa, phát triển rễ, hút và vận chuyển nước cho cây theo công bố của các tác giả Alloway, 2004; Tavallali et al. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu của về vi sinh vật thúc đẩy tăng trưởng thực vật đang phát triển theo hướng tiếp cận mới và thân thiện với môi trường để cải thiện tính sẵn có của chất dinh dưỡng trong đất (Maqshoof Ahmad et al.

Các nhà khoa học đã và đang tập trung nghiên cứu và phát triển phân bón Zn hiệu quả và tiết kiệm chi phí để tăng cường khả năng hấp thụ Zn ở thực vật. Nhiều loại phân bón hữu cơ và khoáng khác nhau được sử dụng để khắc phục tình trạng thiếu kẽm trong đất như kẽm sunfat (ZnSO4) và kẽm oxide (ZnO) thường được sử dụng để tăng khả năng sẵn có của Zn và tăng năng suất cây trồng. Kẽm oxit (ZnO) chứa khoảng 80% Zn là một nguồn cung cấp Zn rẻ hơn nhưng lại ít hoà tan hơn so với ZnSO4. Tuy nhiên, hạn chế chính của việc sử dụng phân bón kẽm là nó chỉ được cố định nhanh chóng trong đất mà không có sẵn trong cây trồng (Kathleen Hefferon, 2019).

Một số chủng vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật thuộc các chủng Bacillus và Pseudomonas được coi là các chủng vi khuẩn phân giải Zn tiềm năng trong đất như khả năng phân giải kẽm oxide (ZnO) và kẽm cacbonat (ZnCO3) (Azhar Hussain, 2015). Những vi khuẩn như vậy rất có lợi cho cây trồng, chúng không chỉ giúp cây trồng tăng khả năng hấp thu Zn mà còn tham gia vào các quá trình sản xuất phytohormon, cố định N2, tăng cường khả năng chống chịu của cây. Song song với việc sử dụng phân bón hữu cơ để bổ sung các chất dinh dưởng cho cây trồng sử dụng các vi sinh vật có khả năng cải thiện các chất dinh dưỡng sẵn có trong đất đồng thời thúc đẩy tăng trưởng thực vật trong đất nông nghiệp cũng được coi là quan trọng. Một số chủng vi khuẩn đã và đang được nghiên cứu về khả năng phân giải kẽm giúp thúc đẩy sinh trưởng thực vật như các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sp.,… Sử dụng vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh 2 trưởng ở thực vật (PGPR) đang dần trở thành một phương pháp thay thế phân bón hoá học, thuốc trừ sâu.

Vì vậy, đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và định danh một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải kẽm và kích thích sinh trưởng thực vật từ đất vùng rễ lúa” được tiến hành nghiên cứu. Mục đích của đề tài Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích phân lập, tuyển chọn và định danh một số chủng vi khuẩn phân giải kẽm từ đất vùng rễ lúa và phân tích ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn này đến tỷ lệ nảy mầm, khả năng sinh trưởng và sinh khối của cây lúa. Ý nghĩa của đề tài  Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu này nhằm cung cấp thêm một số hiểu biết, dẫn liệu khoa học về đặc điểm sinh học và điều kiện thích hợp để nhân giống một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải kẽm và kích thích sinh trưởng thực vật được phân lập từ đất vùng rễ lúa.  Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của nghiên cứu này giúp tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải kẽm tốt, làm tăng tỷ lệ nảy mầm, khả năng sinh trưởng và sinh khối cây lúa nhằm tạo nguồn vật liệu quan trọng cho sản xuất chế phẩm sinh học, phân bón vi sinh, góp phần xây dựng nền nông nghiệp sạch và bền vững.

3 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Lịch sử nghiên cứu kẽm Kẽm (Zn) là một kim loại quan trọng đối với sự sống, có số nguyên tử là 30, nguyên tử khối là 65,37. Các nhà khoa học đã tuyên bố rằng sau các nguyên tố đa lượng N, P và K, Zn là nguyên tố vi lượng quan trọng nhất. Các nghiên cứu về tầm quan trọng của Zn được nghiên cứu lần đầu tiên trên thực vật vào năm 1869; năm 1934, thí nghiệm đầu tiên được thực hiện trên động vật và vào năm 1961 đối với con người.

Một số nghiên cứu về tầm quan trọng của kẽm đối với sức khoẻ con người, các nhà khoa học đã chỉ ra rằng kẽm được hấp thụ thụ động qua con đường nội bào, hấp thụ trực tiếp đến gan và sau đó được giải phóng vào hệ tuần hoàn để phân phối đến các mô khác. Khoảng 70% lượng kẽm trong tuần hoàn được liên kết với albumin, và ở bất kỳ tình trạng nào làm thay đổi nồng độ albumin huyết thanh đều có thể ảnh hưởng thứ cấp đến nồng độ kẽm huyết thanh. Mặc dù, kẽm huyết thanh chỉ chiếm 0,1% lượng kẽm toàn cơ thể, nhưng lượng kẽm tuần hoàn chuyển hóa nhanh chóng để đáp ứng nhu cầu của mô (Fao Joint, 2004; Sławomir Tubek, 2007; Nazanin Roohani et al. Ngoài phosphate, các chất vi lượng như Zn, Fe, và Mn đều bị thiếu trong hầu hết các loại đất được tìm thấy trong khi Zn là vi chất dinh dưỡng quan trọng nhất trên khắp thế giới (Alloway, 2004).

Kẽm cũng là một vi chất dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển tối ưu của cây trồng. Vai trò quan trọng của kẽm trong việc thúc đẩy sinh trưởng, phát triển, tăng năng suất cây trồng, bảo vệ và chống lại các mầm bệnh. Tại Pakistan, hơn 70% đất bị thiếu Zn với nguồn kẽm phổ biến là nguồn ZnSO4. Có 33% lượng Zn được sử dựng để bón cung cấp cho cây trồng nhưng chỉ có 4 – 8 % lượng Zn được hấp thụ, phần còn lại tồn dư lại trong đất 4 (Azhar Hussain et al.

Theo công bố của Saravanan và cộng sự năm 2007, chủng vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus có khả năng phân giải kẽm tốt nhất với nguồn ZnO so với hai nguồn kẽm còn lại là ZnCO3 và Zn3(PO4) (Saravanan et al. Vai trò của kẽm Kẽm (Zn) là một nguyên tố vi lượng quan trọng và cần thiết cho sự sống. Trong cơ thể con người, kẽm là thành phần không thể thiếu. Kẽm có vai trò quan trọng liên quan đến tăng trưởng và phân chia tế bào, tham gia vào thành phần cấu trúc tế bào, tác động đến hầu hết các quá trình sinh học trong cơ thể, hoạt hoá nhiều enzyme khác nhau, duy trì tế bào gốc, phát triển hệ xương và tái tạo hệ thần kinh võng mạc.

Đồng thời giúp duy trì tính ổn định của màng sinh học, sự biểu hiện của hormone, lưu trữ insulin ở tuyến tuỵ và đóng góp một phần quan trọng trong việc hỗ trợ các chức năng cảm giác. Ngoài ra, kẽm còn giúp tổng hợp DNA và RNA, kích hoạt tế bào miễn dịch RNA, phiên mã, sao chép DNA và tăng cường khả năng chống nhiễm trùng của hệ thống miễn dịch (Claudia Schubert et al. Nhu cầu Zn của một người trưởng thành là 9 – 18 mg/ngày (Shams Tabrez Khan, 2021). So với người lớn, trẻ sơ sinh, trẻ em, thanh thiếu niên, phụ nữ có thai và cho con bú là nhóm đối tượng có nhu cầu về kẽm cao.

Trong việc phát triển chiều cao, cân nặng của trẻ sơ sinh, trẻ em và thanh thiếu niên thì kẽm đóng vai trò đặc biệt quan trọng. Chức năng của kẽm đối với sức khoẻ con người đã được các nhà khoa học nghiên cứu và thừa nhận trong gần nửa thế kỳ từ khi phát hiện ra các hội chứng biểu hiện sự thiếu kẽm ở một thanh niên người Iran. Vào năm 1961, lần đầu tiên một nam giới 21 tuổi ở Iran bị hội chứng thiếu máu, thiểu năng sinh dục và bệnh lùn do ăn kiêng bánh mì, khoai tây và sữa dẫn đến thiếu kẽm. Từ đó, thiếu kẽm ở người hiện được biết đến là một vấn đề suy dinh dưỡng quan trọng trên toàn thế giới.

Nó dần phổ biến hơn ở các khu vực sử dụng nhiều ngũ cốc và ít tiêu thụ thức ăn động vật. Các vi chất dinh dưỡng quan trọng cho sự trao 5 đổi chất ở người được bổ sung qua việc ăn uống thức ăn từ động thực vật giàu K, Na, P, Mg,… và đặc biệt là các vi chất dinh dưỡng có chức năng quan trọng như Zn, Cl, S, Mo,…. Thiếu kẽm ở trẻ em có thể dẫn đến các vẫn đề về sức khoẻ như tiêu chảy, hệ miễn dịch kém, viêm phổi, giảm sức đề kháng. Ngoài ra, thiếu kẽm còn ảnh hưởng đến hoạt động của não và gan.

Đối với thực vật, kẽm (Zn) là thành phần của men carboxylase kích thích sự giải phóng CO2 trong diệp lục, kích thích quang hợp. Kẽm tham gia vào tổng hợp protein, sự hình thành hạt và thúc đẩy tăng trưởng thực vật.