Đồ án tốt nghiệp: Ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin qua phương pháp lên men lactic

Khám phá ứng dụng của chitosan sản xuất từ chitin qua phương pháp lên men lactic trong đồ án tốt nghiệp, mang lại tiềm năng cho ngành công nghiệp.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thanh Nhật
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hoài Hương
• Trường học: Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic
• Loại tài liệu: Đồ án tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về tôm sú
• 1.2. Cấu tạo của vỏ tôm
• 1.3. Tổng quan về chitin – chitosan
• 1.4. Lịch sử phát hiện chitin – chitosan
• 1.5. Cấu trúc của chitin – chitosan. Tính chất của chittin – chitosan
• 1.6. Ứng dụng của chitosan
• 1.7. Ứng dụng chitosan kích thích nảy mầm hạt giống
• 1.8. Tình hình sản xuất chitin – chitosan hiện nay
• 1.9. Tổng quan về vi khuẩn lactic
• 1.10. Đặc tính chung
• 1.11. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
• 1.12. Giới thiệu các nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic vào lên men thu hồi chitin
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Thời gian thực hiện
• 2.4. Phương pháp luận
• 2.5. Phương pháp thí nghiệm
• 2.6. Thu thập mẫu và nguyên liệu
• 2.7. Xác định thông số về thành phần hóa học của nguyên liệu đầu vỏ tôm
• 2.8. Quy trình lên men kéo dài. Phương pháp tiến hành
• 2.9. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus CĐP1 trên môi trường nuôi cấy PDA
• 2.10. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng kích hoạt sự ra rễ hạt đậu nành, hạt đậu phộng ở các nồng độ tương ứng
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Xác định thành phần hóa học của nguyên liệu vỏ tôm
• 3.2. Thông số hóa học sau quá trình lên men lactic thu hồi chitin với tỉ lệ rỉ đường 20%
• 3.3. Hiệu quả khử khoáng và khử protein của quá trình lên men lactic với tỉ lệ rỉ đường 20 %, mật độ giống 3,16 x 10^6 cfu/ ml, 10 ngày
• 3.4. So sánh một số đặc tính, tính chất vật lý chitosan từ chitin theo phương pháp lên men lactic và chitosan thương phẩm
• 3.5. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitosan lên hoạt tính kháng nấm Aspergillus flavus CĐP1
• 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu tương
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về chitosan và chitin

Chitosan và chitin là hai chất liệu sinh học quan trọng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Chitin là một polymer tự nhiên có trong vỏ giáp xác, côn trùng và nấm. Chitosan là dẫn xuất của chitin, được tạo ra bằng cách khử acetyl hóa chitin. Phương pháp lên men lactic là một công nghệ sinh học tiên tiến để thu hồi chitin từ vỏ tôm, thay thế cho các phương pháp hóa học truyền thống. Phương pháp này không chỉ thân thiện với môi trường mà còn mang lại hiệu suất cao. Đồ án tốt nghiệp này tập trung vào việc ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng quy trình lên men lactic, nhằm tạo ra các chế phẩm sinh học có giá trị.

1.1. Lịch sử phát hiện chitin và chitosan

Chitin được phát hiện lần đầu tiên bởi Henri Braconnot vào năm 1881. Năm 1894, chitosan được tạo ra bằng cách xử lý chitin với kiềm. Các nghiên cứu sau này đã xác định cấu trúc và tính chất của hai hợp chất này, mở ra nhiều ứng dụng công nghệ trong y học, nông nghiệp và công nghiệp.

1.2. Tính chất và cấu trúc của chitin và chitosan

Chitin là một polymer mạch thẳng, cấu tạo từ các đơn vị N-acetylglucosamine. Chitosan có cấu trúc tương tự nhưng chứa nhiều nhóm amin tự do hơn, giúp nó có khả năng hòa tan trong môi trường acid. Cả hai đều có tính kháng khuẩn, kháng nấm và khả năng phân hủy sinh học cao.

II. Phương pháp lên men lactic trong sản xuất chitosan

Phương pháp lên men lactic là một quy trình sinh học sử dụng vi sinh vật lactic để thu hồi chitin từ vỏ tôm. Quá trình này bao gồm các bước khử khoáng và khử protein, tạo ra chitin tinh khiết. Quy trình lên men này không chỉ giảm thiểu việc sử dụng hóa chất độc hại mà còn tăng hiệu suất thu hồi chitin. Đồ án tốt nghiệp này đã áp dụng phương pháp này để sản xuất chitosan từ chitin thu hồi, với mục tiêu tạo ra các sản phẩm có giá trị cao.

2.1. Quy trình lên men lactic

Quy trình bao gồm các bước: chuẩn bị nguyên liệu vỏ tôm, lên men với vi khuẩn lactic, khử khoáng và khử protein. Quá trình lên men được tối ưu hóa bằng cách điều chỉnh tỉ lệ rỉ đường và mật độ vi khuẩn, đảm bảo hiệu suất thu hồi chitin cao nhất.

2.2. So sánh với phương pháp hóa học

So với phương pháp hóa học, phương pháp lên men lactic mang lại nhiều lợi ích như giảm thiểu ô nhiễm môi trường, tiết kiệm chi phí và tăng hiệu suất thu hồi chitin. Đây là một bước tiến quan trọng trong công nghệ sinh học.

III. Ứng dụng của chitosan trong nghiên cứu khoa học

Chitosan có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực như y học, nông nghiệp và công nghiệp. Trong nghiên cứu khoa học, chitosan được sử dụng để kháng nấm, kích thích nảy mầm hạt giống và xử lý nước thải. Đồ án tốt nghiệp này đã khảo sát khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus và kích thích nảy mầm hạt đậu tương, đậu phộng của chitosan, cho thấy tiềm năng lớn của chất liệu này.

3.1. Khả năng kháng nấm của chitosan

Chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Aspergillus flavus, một loại nấm gây hại trong nông nghiệp. Kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan từ phương pháp lên men lactic có hiệu quả tương đương với chitosan thương mại.

3.2. Kích thích nảy mầm hạt giống

Chitosan được sử dụng để kích thích nảy mầm hạt đậu tương và đậu phộng. Nghiên cứu cho thấy chitosan từ quy trình lên men lactic có khả năng tăng tỉ lệ nảy mầm và chiều dài rễ, mang lại hiệu quả cao trong nông nghiệp.

IV. Giá trị và ứng dụng thực tiễn của đồ án

Đồ án tốt nghiệp này không chỉ mang lại giá trị học thuật mà còn có ứng dụng thực tiễn cao. Việc sử dụng phương pháp lên men lactic để sản xuất chitosan từ chitin giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế. Chitosan từ quy trình này có thể được ứng dụng trong y học, nông nghiệp và công nghiệp, góp phần phát triển bền vững.

4.1. Giá trị học thuật

Đồ án đã góp phần vào việc nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, đặc biệt là trong lĩnh vực sản xuất chất liệu sinh học từ nguồn phế liệu thủy sản.

4.2. Ứng dụng thực tiễn

Chitosan từ quy trình lên men lactic có thể được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp và y tế, mang lại hiệu quả kinh tế và môi trường cao.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngành thủy sản đóng vai trò quan trọng trong cơ cấu kinh tế Việt Nam với mặt hàng xuất khẩu chủ lực là tôm đông lạnh. Theo báo cáo của Bộ Thủy sản năm 2012, cả nước có 1.529 cơ sở sản xuất giống tôm sú (đạt trên 37 tỷ con giống) và 185 cơ sở sản xuất giống tôm chân trắng (đạt gần 30 tỷ con giống). Diện tích nuôi tôm nước lợ tại 30 tỉnh/thành đạt 657.523 ha với sản lượng 476.424 tấn, trong đó tôm sú chiếm 94,1% diện tích và 67,2% sản lượng. Đi kèm với quy mô chế biến lớn là lượng phế liệu đầu và vỏ tôm thải bỏ khổng lồ (thống kê năm 2005 đã đạt 70.000 tấn). Nguồn phế liệu này chưa được khai thác hiệu quả, chủ yếu dùng làm thức ăn gia súc hoặc xả thải trực tiếp gây ô nhiễm môi trường.

Vỏ tôm chứa các hợp chất có giá trị sinh học cao như chitin, protein, canxi và sắc tố astaxanthin. Các phương pháp sản xuất chitin - chitosan truyền thống chủ yếu dùng hóa chất acid và kiềm đậm đặc, tiêu tốn năng lượng và tạo nguồn nước thải độc hại. Việc ứng dụng công nghệ sinh học bằng phương pháp lên men vi khuẩn lactic (LAB) kết hợp nguồn carbon phụ phẩm như mật rỉ đường mở ra hướng xử lý thân thiện với môi trường, giảm chi phí hóa chất. Khóa luận kế thừa chuỗi nghiên cứu từ năm 2008 đến 2014 tại Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường (Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh) nhằm hoàn thiện quy trình lên men và đánh giá khả năng ứng dụng thực tiễn của sản phẩm chitosan thu hồi.

Mục đích nghiên cứu của đề tài là ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic với nguồn đường rỉ đường. Nhiệm vụ nghiên cứu được xác định gồm 3 nội dung chính:

1. Thực hiện quy trình thu hồi chitin - chitosan từ vỏ tôm bằng phương pháp lên men lactic sử dụng nguồn rỉ đường.
2. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan thu hồi đến khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus CĐP1 so với các mẫu thương phẩm.
3. Khảo sát khả năng kích thích nảy mầm và phát triển rễ của chitosan lên hạt giống đậu tương và hạt giống đậu phộng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Phế liệu vỏ tôm sú thu nhận từ chợ Bà Chiểu (TP. Hồ Chí Minh); chủng vi khuẩn lên men lactic L5; chủng nấm Aspergillus flavus CĐP1; hạt giống đậu tương và đậu phộng; hai mẫu chitosan thương phẩm dùng đối chứng (mẫu 1 nhập khẩu từ Úc, mẫu 2 từ Công ty TNHH Hùng Tiến, Cần Thơ).
• Không gian thực hiện: Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh.
• Thời gian thực hiện: Từ ngày 25/05/2015 đến ngày 16/08/2015.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Vỏ tôm sú có cấu trúc phân tầng gồm 4 lớp: biểu bì (epicuticle), lớp màu chứa sắc tố astaxanthin, lớp canxi hóa và lớp không bị canxi hóa. Các thành phần chính gồm canxi (chủ yếu là $\text{CaCO}_3$, một phần $\text{Ca}_3(\text{PO}_4)_2$), protein (dạng tự do và liên kết phức tạp) và chitin. Chitin là polymer sinh học cấu tạo từ các mắt xích $N$-acetyl-D-glucosamine liên kết $\beta$-(1$\rightarrow$4)-glycoside. Khi xử lý bằng kiềm đặc ở nhiệt độ cao, phản ứng deacetyl hóa chuyển đổi nhóm $-\text{NHCOCH}_3$ tại vị trí C2 thành nhóm amin tự do $-\text{NH}_2$, tạo thành chitosan (polymer polycation tự nhiên tan trong dung dịch acid hữu cơ loãng).

Quá trình lên men lactic sử dụng vi khuẩn LAB dị hóa nguồn đường thành acid lactic, làm giảm pH môi trường xuống mức 2–3 để hòa tan muối khoáng canxi thành canxi lactat (khử khoáng). Đồng thời, hệ enzyme protease do vi khuẩn tiết ra và protease nội tạng tôm thủy phân mạng lưới protein liên kết với chitin (khử protein), giúp tinh sạch chitin mà không làm gãy đứt mạch polymer sinh học.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và phân tích hóa lý được thực hiện gồm:

• Phương pháp lên men bán rắn/lỏng kéo dài 10 ngày trong điều kiện kiểm soát tỷ lệ rỉ đường, mật độ vi sinh vật và nhiệt độ.
• Phương pháp điều chế chitosan: Deacetyl hóa chitin bằng dung dịch $\text{NaOH}$ 40%, tỷ lệ rắn/lỏng 1:10 (w/v) ở 100°C trong 5 giờ, rửa trung tính và tẩy màu bằng $\text{H}_2\text{O}_2$.
• Phương pháp phân tích chỉ tiêu: Xác định độ ẩm bằng sấy nhiệt độ 105°C đến khối lượng không đổi; xác định hàm lượng khoáng (tro thô) bằng nung lò ở 500–550°C trong 2 giờ; xác định nitơ amin bằng phương pháp chuẩn độ formol (Sörensen); xác định nitơ tổng theo phương pháp Kjeldahl; xác định nitơ protein hòa tan bằng phương pháp Bradford trên máy đo quang Hach với dung dịch chuẩn Albumin; định lượng acid lactic sinh ra.
• Phương pháp thử nghiệm sinh học: Khảo sát hoạt tính kháng nấm Aspergillus flavus CĐP1 trên đĩa thạch Potato Dextrose Agar (PDA) ở các nồng độ chitosan 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 g/l tại pH 5,5, theo dõi đường kính tản nấm sau 7 ngày ủ; khảo sát kích thích nảy mầm hạt đậu tương và đậu phộng thông qua theo dõi tỷ lệ nảy mầm (%), chiều dài rễ mầm (cm) và khối lượng hạt (g).
• Phương pháp xử lý dữ liệu: Sử dụng phần mềm Microsoft Excel và Statgraphics.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan

Chương này hệ thống hóa các cơ sở lý thuyết và công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài:

• Trình bày chi tiết cấu tạo giải phẫu và thành phần hóa học của vỏ tôm sú, bản chất liên kết đồng hóa trị giữa chitin, protein và muối canxi.
• Tổng kết lịch sử phát hiện chitin và chitosan từ năm 1811 (Henri Braconnot), 1823 (Odier), 1859 (Rouget), 1894 (Hoppe-Seyler) đến các nghiên cứu cấu trúc tinh thể qua nhiễu xạ tia X (Meyer và Mark, 1928). Phân tích các đặc trưng lý hóa quan trọng của chitosan: mức độ deacetyl hóa (DDA thường từ 70% đến 95%), khối lượng phân tử trung bình (MW từ 100.000 đến 500.000 g/mol), độ nhớt và các phản ứng hóa học tại nhóm $-\text{OH}$ và $-\text{NH}_2$.
• Tổng hợp các ứng dụng của chitosan trong y sinh (màng lọc thận nhân tạo, da nhân tạo, chỉ khâu tự tiêu, điều trị bỏng, màng bao thuốc), công nghiệp (mỹ phẩm tóc/da/răng, xử lý ion kim loại nặng và chất màu nước thải xưởng nhuộm, phụ gia tăng độ bền giấy tái chế, chất tạo gel thực phẩm) và nông nghiệp (chất mang phóng thích chậm phân bón, màng bảo quản trái cây NOCC, xử lý hạt giống kích thích nảy mầm và ức chế nấm bệnh vùng rễ).
• Phân tích ưu nhược điểm của quy trình hóa học (Robert, 1998) so với quy trình sinh học sử dụng vi khuẩn lactic lên men thu hồi chitin (Bhaskar, 2010; Rao, 2000; Prameela, 2010).
• Trình bày đặc điểm sinh lý, sinh hóa, con đường trao đổi chất lên men đồng hình (Embden-Meyerhof-Parnas) và dị hình (6-phosphogluconate/phosphoketolase) của vi khuẩn lactic. Điểm lại các kết quả kế thừa từ sinh viên khóa trước tại HUTECH: xác định tỷ lệ nước/vỏ tôm 2,5:1 (Nguyễn Thị Ngọc Thu, 2012); phân lập tuyển chọn chủng L5 từ nem chua, xác định tỷ lệ đường 20% và mật độ giống $3,16 \times 10^6 \text{ cfu/g}$ (Lê Thị Hồng Thủy, 2013); xác định thời gian lên men kéo dài 7–10 ngày và thay thế glucose bằng mật rỉ đường sau xử lý (Dương Quốc Xuân, 2014).

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và các kỹ thuật đo đạc trong phòng thí nghiệm:

• Nguyên liệu vỏ tôm từ chợ Bà Chiểu được rửa sạch tạp chất cơ học, xay nhỏ kích thước $\le 2\text{ mm}$ và cấp đông bảo quản ở nhiệt độ $-40^\circ\text{C}$.
• Thiết lập quy trình lên men lactic kéo dài: Phối trộn 500 g vỏ tôm với 2,5% $\text{NaCl}$, 20% rỉ đường đã qua xử lý, tỷ lệ nước : đầu tôm là 2,5 : 1, cấy chủng vi khuẩn lactic L5 với mật độ $3,16 \times 10^6 \text{ cfu/ml}$ (chuẩn hóa theo độ đục OD = 0,4), tiến hành lên men ở nhiệt độ 37°C trong thời gian 10 ngày.
• Quy trình chuyển hóa chitin sang chitosan: Ngâm mẫu chitin trong dung dịch $\text{NaOH}$ 40% với tỷ lệ khối lượng/thể tích 1:10 (w/v) ở 100°C trong 5 giờ, rửa sạch đến môi trường trung tính, tẩy màu bằng $\text{H}_2\text{O}_2$ và phơi khô tự nhiên.
• Mô tả chi tiết nguyên lý và công thức tính toán các chỉ tiêu phân tích hóa học: tro thô, độ ẩm, hàm lượng nitơ amin dịch trích ly ($N_{\text{amin}}$ qua chuẩn độ formol), nitơ tổng ($N_{\text{tổng}}$ qua Kjeldahl), protein hòa tan (Bradford), hàm lượng acid lactic, hiệu quả khử khoáng (%) và khử protein (%).
• Thiết lập quy trình bố trí thí nghiệm ứng dụng: Khảo sát khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus CĐP1 của dung dịch chitosan ở các nồng độ 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 g/l trên môi trường PDA tại pH 5,5 sau 7 ngày nuôi cấy; quy trình ngâm và theo dõi khả năng nảy mầm của hạt đậu tương và hạt đậu phộng theo các nồng độ dung dịch chitosan tương ứng.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm và đánh giá so sánh:

• Xác định thành phần hóa học ban đầu của nguyên liệu vỏ tôm sú và sự biến đổi các thông số hóa sinh sau 10 ngày lên men lactic bằng chủng L5 với 20% rỉ đường.
• Đánh giá hiệu quả khử khoáng và khử protein của quy trình lên men lactic đạt mức triệt để, cho phép thu hồi bã chitin đáp ứng yêu cầu nguyên liệu cho phản ứng deacetyl hóa.
• Phân tích, so sánh các đặc tính vật lý và tính chất của mẫu chitosan điều chế từ phương pháp lên men lactic với 2 mẫu chitosan thương phẩm (mẫu nhập khẩu Úc và mẫu sản xuất tại Cần Thơ).
• Đánh giá hoạt tính kháng nấm Aspergillus flavus CĐP1: Bổ sung chitosan ở các nồng độ từ 0,1 đến 4,0 g/l vào môi trường PDA (pH 5,5) làm giảm rõ rệt đường kính tản nấm sau 7 ngày ủ; so sánh định lượng hiệu quả ức chế giữa nguồn chitosan lên men lactic và 2 nguồn thương phẩm.
• Đánh giá hiệu quả kích thích sinh trưởng thực vật: Nồng độ chitosan ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ nảy mầm, tốc độ vươn dài của rễ và khối lượng hạt đậu tương cũng như hạt đậu phộng; phân tích so sánh chi tiết tại nồng độ tối ưu 2,0 g/l giữa chitosan lên men lactic và 2 mẫu thương phẩm.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã hoàn thành các mục tiêu thực nghiệm và ghi nhận các kết quả cụ thể sau:

Thông số / Chỉ tiêu thực nghiệm	Điều kiện / Kết quả ghi nhận trong khóa luận
Quy mô và điều kiện lên men	500 g vỏ tôm xay ($\le 2\text{ mm}$), 20% rỉ đường xử lý, 2,5% $\text{NaCl}$, nước : vỏ tôm = 2,5 : 1
Chủng giống vi sinh vật	Chủng vi khuẩn lactic L5, mật độ $3,16 \times 10^6\text{ cfu/ml}$ (OD = 0,4)
Chế độ lên men thu hồi chitin	Nhiệt độ lên men 37°C, thời gian lên men kéo dài 10 ngày
Chế độ deacetyl hóa tạo chitosan	$\text{NaOH}$ 40%, tỷ lệ 1:10 (w/v), nhiệt độ 100°C, thời gian phản ứng 5 giờ
Chỉ tiêu hóa sinh theo dõi	Độ ẩm, tro thô, acid lactic sinh ra, $N_{\text{amin}}$, $N_{\text{tổng}}$, protein hòa tan
Khảo sát hoạt tính kháng nấm	Ức chế nấm Aspergillus flavus CĐP1 trên môi trường PDA (pH = 5,5) sau 7 ngày
Dải nồng độ thử nghiệm sinh học	0,1 g/l; 0,5 g/l; 1,0 g/l; 2,0 g/l; 4,0 g/l
Nồng độ tối ưu kích thích nảy mầm	Nồng độ 2,0 g/l cho hiệu quả kích thích nảy mầm, chiều dài rễ và khối lượng hạt đậu tương tốt nhất
Mẫu đối chứng so sánh	Chitosan thương phẩm 1 (Úc) và Chitosan thương phẩm 2 (Hùng Tiến, Cần Thơ)

Các giải pháp và đóng góp của đề tài:

• Chứng minh tính khả thi của việc sử dụng rỉ đường (phụ phẩm ngành mía đường) ở tỷ lệ 20% làm cơ chất carbon thay thế glucose tinh khiết trong lên men lactic quy mô phòng thí nghiệm kéo dài 10 ngày để thu hồi chitin từ phế liệu vỏ tôm sú.
• Chứng minh sản phẩm chitosan điều chế từ chitin lên men lactic có hoạt tính sinh học tương đương và có các chỉ tiêu sinh học cạnh tranh được với các nguồn chitosan thương phẩm nhập khẩu và trong nước.
• Xác lập dải nồng độ xử lý chitosan (đặc biệt là nồng độ 2,0 g/l) giúp ức chế vi nấm gây hại nông sản Aspergillus flavus và nâng cao tỷ lệ nảy mầm, kích thích phát triển hệ rễ của hạt giống đậu tương và đậu phộng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Thí nghiệm lên men được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm gián đoạn (mẻ 500 g nguyên liệu vỏ tôm), chưa đánh giá trên các hệ thống thiết bị lên men quy mô lớn hơn.
• Mật rỉ đường sử dụng đòi hỏi công đoạn xử lý trước khi đưa vào môi trường lên men để đảm bảo hoạt lực của vi khuẩn lactic.
• Thử nghiệm kích thích nảy mầm hạt giống và ức chế nấm mới dừng lại ở điều kiện in-vitro và phòng thí nghiệm (trên đĩa petri và môi trường thạch PDA), chưa đánh giá hiệu lực kéo dài trên đất và ngoài đồng ruộng thực tế.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:

• Tiếp tục tối ưu hóa công đoạn khử màu và phản ứng deacetyl hóa từ bã chitin sau lên men để nâng cao độ tinh sạch và mức độ deacetyl hóa của chitosan thành phẩm.
• Mở rộng khảo sát hoạt tính kháng nấm của màng chitosan trên nhiều chủng vi nấm gây bệnh thực vật khác trong bảo quản nông sản.
• Triển khai thử nghiệm ứng dụng dung dịch chitosan xử lý hạt giống trên quy mô nhà lưới và đồng ruộng đối với cây họ đậu để hoàn thiện quy trình ứng dụng nông nghiệp.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên môn cho sinh viên, giảng viên và học viên cao học thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Khoa học Môi trường và Nông nghiệp.

Các phần có giá trị tham khảo cụ thể:

• Bố trí thí nghiệm lên men sinh học thu hồi polymer từ phế phụ phẩm thủy sản bằng vi khuẩn lactic L5 kết hợp mật rỉ đường.
• Quy trình phân tích định lượng các thông số sinh hóa: chuẩn độ nitơ formol xác định nitơ amin, phương pháp Kjeldahl xác định nitơ tổng, phương pháp đo quang Bradford định lượng protein hòa tan.
• Phương pháp luận và thiết kế thực nghiệm đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh nông sản (in-vitro) và thử nghiệm kích thích nảy mầm hạt giống cây trồng.

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi khuẩn lactic L5 sử dụng trong khóa luận có nguồn gốc từ đâu?
Chủng vi khuẩn L5 do Phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường (Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh) cung cấp. Chủng này được phân lập và tuyển chọn từ sản phẩm nem chua trong nghiên cứu năm 2013 của tác giả Lê Thị Hồng Thủy, có đặc tính lên men lactic đồng hình mạnh và có hoạt tính protease.

2. Quy trình lên men kéo dài thu hồi chitin sử dụng những thông số kỹ thuật nào?
Quy trình sử dụng 500 g vỏ tôm sú xay nhỏ ($\le 2\text{ mm}$), bổ sung 2,5% $\text{NaCl}$, 20% rỉ đường sau xử lý, tỷ lệ nước : đầu tôm là 2,5 : 1, cấy giống vi khuẩn L5 với mật độ $3,16 \times 10^6\text{ cfu/ml}$ (tương ứng $\text{OD} = 0,4$), tiến hành lên men ở 37°C trong thời gian 10 ngày.

3. Điều kiện thực hiện phản ứng deacetyl hóa chuyển chitin thành chitosan là gì?
Bã chitin sau lên men và rửa sạch được ngâm trong dung dịch $\text{NaOH}$ 40% theo tỷ lệ khối lượng/thể tích 1:10 (w/v), gia nhiệt ở 100°C trong 5 giờ, sau đó rửa trung tính, tẩy màu bằng $\text{H}_2\text{O}_2$ và phơi khô tự nhiên.

4. Hai mẫu chitosan thương phẩm dùng đối chứng trong nghiên cứu có xuất xứ từ đâu?
Mẫu chitosan thương phẩm 1 là sản phẩm ngoại nhập từ Úc (do cô Tuyến, Viện Sinh học Nhiệt đới và cô Ngọc Yên, Trường Đại học Bách khoa TP.HCM hỗ trợ cung cấp). Mẫu chitosan thương phẩm 2 là sản phẩm trong nước do Công ty TNHH Hùng Tiến (Quận Bình Thủy, TP. Cần Thơ) sản xuất.

5. Nồng độ chitosan nào được xác định tối ưu để kích thích nảy mầm hạt đậu tương?
Khóa luận xác định nồng độ chitosan 2,0 g/l là nồng độ tối ưu, cho kết quả vượt trội về tỷ lệ nảy mầm (%), chiều dài rễ mầm (cm) và khối lượng hạt đậu tương khi so sánh giữa mẫu chitosan lên men lactic và 2 mẫu chitosan thương phẩm.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thị Thanh Nhật đã hoàn thiện việc thu hồi chitin từ phế liệu vỏ tôm sú thông qua quá trình lên men vi khuẩn lactic L5 kéo dài 10 ngày sử dụng 20% mật rỉ đường, đồng thời chuyển hóa thành công thành chitosan bằng phương pháp deacetyl hóa kiềm 40%. Sản phẩm chitosan thu hồi thể hiện rõ hoạt tính ức chế vi nấm Aspergillus flavus CĐP1 trên môi trường PDA và thể hiện hiệu quả kích thích nảy mầm, phát triển rễ hạt giống đậu tương và đậu phộng tối ưu ở nồng độ 2,0 g/l. Kết quả nghiên cứu khẳng định tiềm năng thay thế hóa chất bằng công nghệ sinh học trong xử lý phế phụ phẩm thủy sản và cung cấp cơ sở thực nghiệm cho các ứng dụng chế phẩm sinh học trong nông nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Tổng quan về tôm sú 1. Cấu tạo của vỏ tôm Vỏ tôm chia làm 4 lớp chính: - Lớp biểu bì ( epicucle) - Lớp màu - Lớp canxi hóa - Lớp không bị canxi hóa Lớp màu : tính chất của lớp này do sự có mặt của những thể hình hạt của vật chất mang màu giống dạng melanin. Chúng gồm những túi khứ hoặc những không bào.

Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh, là con đường cho canxi thẩm thấu vào. Lớp biểu bì (epcuticle): những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng bị biến đổi bởi fucxxin, có điểm pH = 5,1 không chứa chitin. Nó khác với các vỏ còn lại, bắt màu với anilin xanh. Lớp epicuticle có lipit vì thế nó cản trở tác động của acid hơn là các lớp bên trong.

Màu của lớp này thường vàng rất nhạt có chứa polyphenoloxidase và bị hóa cứng bởi puinone – tannin. Lớp epicuticle liên kết với một số màng mỏng bên ngoài cản trở hòa tan ngay cả trong môi trường acid đậm đặc do nó có chứa các mắt xích paratin mạch thẳng. Lớp canxi hóa: lớp này chiếm phần lớn vỏ, thường có màu xanh trải đều khắp, chitin ở trạng thái tạo phức với canxi. Lớp không bị canxi hóa: trong cùng của lớp vỏ được tạo thành bởi một phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin – protein bền vững không có canxi và quinine.

Thành phần hóa học của vỏ tôm Protein : thành phần protein trong phế liệu tôm thường tồn tại ở 2 dạng : dạng tự do và dạng liên kết. Dạng tự do : dạng này là tồn tại ở phần thịt từ một số tôm bị biến đổi và vứt đi lẫn vào phế liệu hoặc phần đầu và thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của tôm. Nếu công nhân vặt đầu không đúng kỹ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều làm tăng tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu này khó xử lý hơn. Dạng phức tạp : ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với chittin, canxicacbonat, với lipid tạo thành lipoprotein, với sắc tố tạo proteincarotenoit,… như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm.

• Chitin : tồn tại dưới dạng liên kết bởi những những liên kết đồng hóa trị với các prrotein dưới dạng phức hợp chitin – protein, liên kết với các hợp chất khoáng và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng. • Canxi : trong vỏ, đầu tôm, … có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là muối CaCO3, hàm lượng Ca3( PO4)2 mặc dù không nhiều nhưng trong quá trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl gây khó khăn cho quá trình khử khoáng. Sắc tố trong vỏ tôm thường có nhiều loại sắc tố nhưng chủ yếu là astaxanthin. • Enzyme : Hoạt độ enzyme protesae của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/ gam tươi.

Các enzyme chủ yếu là enzyme của nội tạng trong đầu tôm và của vi sinh vật thường trú trên tôm nguyên liệu. Ngoài thành phần chủ yếu kể trên, trong vỏ đầu tôm còn có các thành phần khác như : nước, lipid, photpho. Tổng quan về chitin – chitosan 1. Lịch sử phát hiện chitin – chitosan Chitin đã được phát hiện bởi Heri braconnot vào năm 1881.

Lần đầu tiên ông phân lập được chitin như một hợp chất không tan trong kiềm của một số loại 7 Đồ án tốt nghiệp nấm. Hợp chất do Braconnot phân lập được còn rất nhiều tạp chất nhưng không khẳng định đây không phải là gỗ. Đến năm 1823, Odier đã cô lập được chitin từ cánh cứng của con bọ cánh cứng và cũng phân lập được chitin khi loại khoáng vỏ cua.