Đặt vấn đề Ngành chăn nuôi là nhân tố quan trọng trong nền kinh tế Việt Nam. Mục tiêu của các nhà chăn nuôi là đạt đƣợc kinh tế tối đa với chi phí thấp. Đó cũng chính là mục tiêu của nhà nƣớc cũng nhƣ các nhà khoa học để có thể đƣa các thành tựu nghiên cứu khoa học vào trong chăn nuôi. Tuy nhiên hiện nay bệnh trên vật nuôi ngày càng nhiều và phức tạp đặc biệt là bệnh về đƣờng tiêu hóa, chính vì vậy để giảm thiểu tối đa thiệt hại, các nhà chăn nuôi sử dụng kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng và ngày càng lệ thuộc vào kháng sinh nhƣ một yếu tố kích thích sinh trƣởng và để chữa bệnh cho vật nuôi đã gây ra hiện tƣợng kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây bệnh.
Sự kháng lại các kháng sinh của mầm bệnh, ngay cả với những kháng sinh thế hệ mới, ngày càng nhanh hơn so với việc tìm ra kháng sinh mới thay thế để phòng trừ vi khuẩn đề kháng này, dƣ lƣợng thuốc kháng sinh tồn đọng trong thực phẩm có thể gây hại đến sức khỏe con ngƣời. Vì vậy, việc phòng và điều trị bệnh trên đƣờng tiêu hoá cho vật nuôi hạn chế sử dụng kháng sinh là một vấn đề đang đƣợc các nhà khoa học và các nhà chăn nuôi quan tâm. Ngƣời ta đã và đang đẩy mạnh việc ứng dụng những sản phẩm sinh học vào chăn nuôi. LAB đƣợc coi nhƣ là một nhóm vi khuẩn probiotic chính cho con ngƣời và động vật (Chen, 2005).
Vì chúng an toàn, có thể chịu đƣợc axit và muối mật. Chúng bám dính tốt vào biểu mô ruột của các vật chủ và có thể ức chế sự phất triển của vi khuẩn gây bệnh nhƣ Escherichia coli và Salmonella đó là những vi sinh vật gây bệnh chính trong đƣờng ruột của gà (Murry, 2004). Chúng có thể duy trì khả năng tồn tại trong quá trình chế biến và bảo quản thức ăn gia súc (Lin, 2007). Vì vậy, nỗ lực để giảm kháng sinh trong chăn nuôi bằng các sử dụng probiotic đang ngày càng đƣợc quan tâm, nhƣ một giải pháp thay thế hiệu quả về chi phí kiểm soát bệnh động vật và cải tiến năng suốt vật nuôi (Reuter, 2001).
Chủng vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phổ biến là vi khuẩn 1 lactic: gồm 2 chi chủ yếu là Lactobacillus và Bifidobacterium. Ngoài ra còn có các vi khuẩn khác nhƣ Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae. Các chế phẩm sinh học từ LAB đã và đang đƣợc sử dụng để thay thế kháng sinh trong phòng và trị các bệnh trên đƣờng tiêu hoá. Sử dụng chế phẩn sinh học từ LAB sẽ đem lại rất nhiều lợi ích nhƣ hỗ trợ tiêu hóa thức ăn, giúp cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột bằng cách cạnh tranh bằng cách kháng lại vi khuẩn gây bệnh giúp vật chủ khỏe mạnh và đem lại nguồn thực phẩm an toàn, bền vững.
Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin phân lập từ ruột gà”. Mục đích và nội dung nghiên cứu 1. Mục đích nghiên cứu Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột gà nhằm ứng dụng vào sản xuất chế phẩm sinh học thay thế kháng sinh. Nội dung nghiên cứu - Phân lập chủng vi khuẩn lactic từ các mẫu ruột gà lấy từ một số tỉnh thành.
- Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc. - Kiểm tra khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. - Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn. - Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng đã định danh.
2 PHẦN II – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về vi khuẩn axit lactic Những vi khuẩn gây lên men sinh axit lactic đƣợc gọi là vi khuẩn axit lactic. Vi khuẩn lactic đƣợc đặc trƣng bởi khả năng sinh axit lactic rất mạnh từ các loại đƣờng khác nhau, đặc biệt là đƣờng lactose. Hầu hết các vi sinh vật sinh axit lactic đều thuộc về họ Lactobacillaceae và đƣợc xếp bốn chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc.
Là vi khuẩn Gram (+). Đây là những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn, đa số không sinh bào tử, thƣờng không chuyển động và kị khí tùy tiện, vi hiếu khí, chúng không chứa cytochrom và enzyme catalase. Đa số chúng lên men đƣợc đƣờng mono và disaccharide, một số không lên men đƣợc saccharose, số khác không lên men đƣợc đƣờng maltose. Vi khuẩn lactic thƣờng có dạng hình cầu, hình oval và hình que, đƣờng kính của dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5-1,5 μm, các tế bào hình cầu xếp thành từng cặp hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau.
Kích thƣớc tế bào trực khuẩn lactic từ 1-8 μm, trực khuẩn thƣờng đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau tạo thành acid trong môi trƣờng và sức chịu đựng acid cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao hơn (khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển đƣợc ở pH = 4-3,8 còn cầu khuẩn không thể phát triển đƣợc ở môi trƣờng này.
Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn lactic ở vùng pH = 5,5-6. Đa số vi khuẩn lactic (đặc biệt là trực khuẩn đồng hình) rất kén chọn thành phần dinh dƣỡng, chúng chỉ phát triển khi trên môi trƣờng có tƣơng đối đầy đủ các yếu tố dinh dƣỡng cần thiết nhƣ acid amin, peptide, protein, vitamin (B1, B2, B6, PP, các acid pantotenic và acid folic), … Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease, chúng phân hủy đƣợc protein của sữa tới peptide và acid amin. Hoạt tính này ở các loài có khác nhau, thƣờng trực khuẩn là cao hơn. Chúng chịu đƣợc trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn ethylic, nhiều loài vẫn sống đƣợc trong môi trƣờng có 10-15% cồn hoặc cao 3 hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl tới 7-10%.
Các vi khuẩn lactic ƣa ấm có nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu là 25-350C, các loài ƣa nhiệt có nhiệt độ tối ƣu là 40- 450C. Sơ lƣợc về bacteriocin 2. Lịch sử nghiên cứu bacteriocin Công trình đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình của Gratia và cộng sự vào năm 1925. Họ đã nghiên cứu và khả năng kháng khuẩn của colicin V.
Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của colicin. Đó là một chất có khả năng gây chết nhiều vi sinh vật, có phổ hoạt động hẹp và phổ hoạt động này bị giới hạn ở những loài tƣơng tự nhƣ vi khuẩn sản xuất. Các loài vi khuẩn Gram dƣơng đƣợc nghiên cứu về khả năng sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp. Và Staphylococcus sp.
Số lƣợng công bố nghiên cứu về bacteriocin trong những năm 1980 đã có sự gia tăng đáng kể. Định nghĩa Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là các peptide đƣợc tổng hợp ở riboxom cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dƣơng để ức chế các vi khuẩn cạnh tranh khác. Bacteriocin có hoạt tính kháng các vi sinh vật cạnh tranh trong cùng ổ sinh thái và thƣờng kháng cùng loài (phổ hẹp) hoặc qua chi (phổ rộng). Đặc điểm, tính chất Bacteriocin đƣợc tổng hợp khi vi khuẩn gặp các điều kiện ức chế - tác động của môi trƣờng sống, cạnh tranh về nguồn dinh dƣỡng, không gian sống… Bacteriocin có bản chất là peptid, kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác.
Nhƣ vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó (Các tế bào sản xuất thì miễn dịch với hoạt tính bacteriocin). Hiện nay đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu về bacteriocin đã đƣợc báo cáo trong các tài liệu tham khảo, song trình tự các amino acide đối với hầu 4 hết các bacteriocin còn chƣa đƣợc xác định. Ngƣời ta mới xác định đƣợc trình tự các aide amine của 45 loại bacteriocin. Các bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí ở nồng độ rất thấp.
Hiệu quả kháng khuẩn của bacteriocin với tế bào vi khuẩn mẫn cảm không phụ thuộc vào số lƣợng acide amine có trong phân tử. Đặc tính diệt khuẩn cao hơn ở pH thấp, tƣơng đối bền ở nhiệt độ cao và không bị ảnh hƣởng bởi các dung môi hữu cơ. Các anion ở nồng độ cao có thể làm giảm hiệu quả diệt khuẩn của một số bacteriocin tích điện dƣơng nhờ sự loại bỏ cạnh tranh. Các enzyme thủy phân protein tích điện âm có thể thủy phân các peptide này, từ đó dẫn đến sự mất hoạt tính.
Do có bản chất protein (thử nghiệm với các enzyme phân giải protein nhƣ trypsin, pepsin) nên bacteriocin không gây tác dụng phụ, không gây ra phản ứng dị ứng trong cơ thể con ngƣời và các vấn đề về sức khỏe do bị phân cắt nhanh chóng bởi protease, lipase… trong đƣờng tiêu hóa. Cơ chế hoạt động của bacteriocin Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là peptid đƣợc tổng hợp theo con đƣờng riboxom. Khi đƣợc sinh tổng hợp bởi vi khuẩn sản xuất, bacteriocin có thể kết hợp với các thụ thể tƣơng ứng trên bề mặt tế bào của các vi khuẩn nhạy cảm để tiêu diệt vi khuẩn. Các bacteriocin có thể tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng thế bào; nó cũng có thể đóng vai trò nhƣ một loại nucleza với chức năng phân giải DNA, ANR hoặc tấn công vào lớp peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào.
Ứng dụng của bacteriocin 2. Bảo quản sinh học thực phẩm - Bảo quản sinh học thực phẩm với việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng (giống bảo vệ) hay các sản phẩm trao đổi của chúng (chất bảo quản sinh học) để ức chế hay tiêu diệt các vi sinh vật không mong muốn là giải pháp có nhiều tiềm 5 năng. Ƣu điểm của bacteriocin trong bảo quản sinh học thực phẩm là tăng thời hạn sử dụng, hạn chế sự truyền mầm bệnh trong chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại kinh tế do hƣ hỏng thực phẩm, hạn chế sử dụng chất bảo quản hóa học cũng nhƣ những xử lƣ nhiệt khắt khe. Bacteriocin giúp bảo quản giá trị dinh dƣỡng và vitamin, cung cấp những thực phẩm mới (ít acide, hàm lƣợng muối thấp và hàm lƣợng nƣớc cao) thỏa mãn nhu cầu công nghiệp và ngƣời tiêu dùng.
Một xu hƣớng trong công nghiệp thực phẩm ở Châu Âu là hạn chế sử dụng chất phụ gia và thành phần nhân tạo, hạn chế sự chế biến nhƣng phải đảm bảo an toàn, giữ nguyên chất lƣợng. Những yêu cầu này có thể đƣợc đáp ứng nhờ sử dụng bacteriocin. Bacteriocin có các đặc điểm lí tƣởng trong bảo quản sinh học thực phẩm. Nhiều bacteriocin bền trong điều kiện nhiệt độ chế biến cao và hoạt động trong phạm vi pH rộng.