Nghiên cứu tương tác của vật liệu micro nano với protein trong luận văn tốt nghiệp

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp thử nghiệm tương tác của vật liệu micro nano với protein, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải pháp cụ thể cho vấn đề .

• Tác giả: Trương Thị Trang
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Thị Thơm
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Thử nghiệm tương tác của vật liệu micro/nano với protein
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về vật liệu micro/nano
• 1.2. Định nghĩa khoa học nano và công nghệ nano
• 1.3. Vật liệu micro/nano
• 1.4. Tính chất của vật liệu micro/nano
• 1.5. Vật liệu Periodic mesoporous organosilicas (PMOs)
• 1.6. Ứng dụng của PMO trong y học và y sinh học
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Quy trình nghiên cứu
• 2.4. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
• 2.5. Phương pháp tổng hợp vật liệu
• 2.6. Phương pháp khảo sát khả năng gắn các protein/peptide lên các vật liệu PMO
• 2.7. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Xây dựng đường chuẩn nồng độ protein
• 3.2. Khả năng tương tác của các protein với các vật liệu PMO
• 3.3. So sánh khả năng hấp phụ protein của các vật liệu nghiên cứu
• 3.4. Khả năng hấp phụ các protein phụ thuộc pH dung dịch đệm
• 3.5. Sự khác nhau về khả năng hấp phụ protein BSA của vật liệu microPMO và nanoPMO
• 3.6. Khả năng hấp phụ các protein của hệ vật liệu nanoPMO
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Tóm tắt

I. Tổng quan về vật liệu micro nano

Vật liệu micro/nano đã trở thành một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong khoa học vật liệu và y sinh học. Khoa học nano nghiên cứu các cấu trúc ở kích thước nanomet, từ đó phát triển các ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Vật liệu nano có kích thước từ 1 đến 100 nanomet, trong khi vật liệu micro có kích thước lớn hơn, từ vài micromet đến vài trăm micromet. Sự khác biệt về kích thước này dẫn đến những tính chất vật lý và hóa học đặc biệt, như hiệu ứng bề mặt và hiệu ứng kích thước. Các vật liệu Periodic mesoporous organosilicas (PMOs) là một ví dụ điển hình, với khả năng hấp phụ và xúc tác cao, mở ra nhiều ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học.

1.1. Định nghĩa khoa học nano và công nghệ nano

Khoa học nano là ngành nghiên cứu về cấu trúc và vật liệu ở kích thước nanomet. Công nghệ nano cho phép thao tác và sản xuất vật chất ở quy mô này, mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong hóa học, vật lý và sinh học. Theo Tổ chức sáng kiến công nghệ Quốc gia Hoa Kỳ, công nghệ nano có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, từ y học đến điện tử. Việc nghiên cứu và phát triển các vật liệu nano và micro không chỉ giúp cải thiện hiệu suất mà còn tạo ra những sản phẩm mới với tính năng vượt trội.

II. Tính chất của vật liệu micro nano

Vật liệu micro/nano có những tính chất đặc biệt khác biệt so với vật liệu khối. Khi kích thước giảm xuống cỡ nanomet, hiệu ứng bề mặt và hiệu ứng kích thước trở nên rõ rệt. Hiệu ứng bề mặt làm tăng tỷ lệ nguyên tử trên bề mặt, dẫn đến sự thay đổi trong năng lượng liên kết và tính chất vật lý. Hiệu ứng kích thước ảnh hưởng đến các tính chất như độ dẫn điện, độ bền và khả năng phản ứng hóa học. Những tính chất này làm cho vật liệu nano trở thành ứng cử viên lý tưởng cho các ứng dụng trong y học, đặc biệt là trong việc phát triển các phương pháp điều trị và chẩn đoán mới.

2.1. Vật liệu Periodic mesoporous organosilicas PMOs

PMOs là một loại vật liệu nano có cấu trúc đặc biệt, được tổng hợp từ các tiền chất hữu cơ. Chúng có diện tích bề mặt cao và khả năng hấp phụ tốt, cho phép ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như xúc tác và hấp phụ. PMOs có thể được tổng hợp bằng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm phương pháp sol-gel, giúp kiểm soát kích thước và hình dạng của lỗ rỗng. Sự phát triển của PMOs mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và ứng dụng y sinh học, đặc biệt trong việc cố định và làm giàu protein.

III. Ứng dụng của vật liệu micro nano trong y học

Vật liệu micro/nano đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong y học, đặc biệt là trong việc phát hiện và điều trị bệnh. Các vật liệu nano có khả năng tương tác tốt với các phân tử sinh học, giúp cải thiện độ nhạy và độ chính xác trong các phương pháp chẩn đoán. Việc sử dụng vật liệu PMO trong việc cố định protein và enzyme đã cho thấy hiệu quả cao trong việc tăng cường hoạt tính sinh học và khả năng tái sử dụng. Các ứng dụng này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả điều trị mà còn mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu trong tương lai.

3.1. Cố định protein và enzyme

Cố định protein trên vật liệu micro/nano là một phương pháp quan trọng trong nghiên cứu y sinh học. Các phương pháp cố định như hấp phụ vật lý, gắn cộng hóa trị và vi bao/nhốt giữ đã được áp dụng để cải thiện tính ổn định và khả năng tái sử dụng của protein. Việc cố định protein không chỉ giúp dễ dàng tách ra khỏi môi trường phản ứng mà còn cải thiện các đặc tính xúc tác. Các vật liệu PMO với cấu trúc lỗ rỗng cho phép cố định protein một cách hiệu quả, mở ra nhiều ứng dụng trong lĩnh vực y học và công nghệ sinh học.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong y học hiện đại, việc phát hiện và định lượng các chỉ dấu sinh học (biomarker) giữ vai trò then chốt trong công tác sàng lọc, chẩn đoán sớm và theo dõi điều trị các bệnh lý mạn tính nguy hiểm như ung thư và đái tháo đường. Tuy nhiên, ở giai đoạn khởi phát của bệnh, nồng độ của các peptide và protein hoạt tính sinh học này trong các dịch sinh học thường rất thấp, gây khó khăn lớn cho các kỹ thuật phân tích thông thường. Việc phân lập và làm giàu chọn lọc protein đích nhằm tăng nồng độ trước khi đưa vào hệ thống phân tích là bước tiền xử lý có tính quyết định để nâng cao độ nhạy và độ chính xác của các phương pháp chẩn đoán phân tử.

Các kỹ thuật truyền thống như siêu lọc, siêu ly tâm hay sắc ký ái lực kim loại cố định (IMAC) bộc lộ một số hạn chế về thời gian thực hiện, yêu cầu trang thiết bị phức tạp hoặc cần các phối tử đặc hiệu đắt tiền. Trong bối cảnh đó, vật liệu organosilica trung tính định kỳ (Periodic Mesoporous Organosilicas - PMO) nổi lên như một hệ chất mang tiềm năng. Với diện tích bề mặt bên trong lớn, thể tích và kích thước mao quản có thể điều chỉnh linh hoạt (trong khoảng 2–30 nm), độ bền cơ học và thủy nhiệt vượt trội cùng khả năng chức năng hóa bề mặt đa dạng, PMO cho phép điều khiển tương tác vật lý với các phân tử sinh học. Khóa luận tốt nghiệp Dược học của tác giả Trương Thị Trang tại Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội (thực hiện năm 2022 dưới sự bảo trợ của đề tài Nghị định thư mã số NĐT.CHN/19) tập trung khảo sát tương tác này thông qua hai nhiệm vụ và mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Xác định được khả năng gắn các protein/peptide lên hệ vật liệu micro/nanoPMO theo thời gian và nồng độ bằng phương pháp hấp phụ vật lý.
2. So sánh được khả năng gắn các protein/peptide của từng loại vật liệu PMO trong dung dịch đệm có pH khác nhau.

Đối tượng nghiên cứu là 6 mẫu vật liệu PMO thuộc hai nhóm kích thước (micromet và nanomet) với ba loại biến tính bề mặt: nhóm trung tính (MPT, NPT), nhóm gắn gốc amin $-NH_2$ (MPA, NPA) và nhóm gắn gốc carboxyl $-COOH$ (MPC, NPC). Các protein mô hình được khảo sát gồm Bovine Serum Albumin (BSA), Insulin và Trypsin. Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm từ tháng 2 năm 2022 đến tháng 6 năm 2022 tại phòng thí nghiệm của Khoa Công nghệ Nông nghiệp, Trường Đại học Công nghệ – Đại học Quốc gia Hà Nội.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình tương tác

Khóa luận dựa trên lý thuyết tổng hợp vật liệu lai vô cơ - hữu cơ có cấu trúc trật tự định kỳ được khởi xướng độc lập từ năm 1999 bởi các nhóm nghiên cứu của Inagaki, Stein và Ozin. Vật liệu PMO được hình thành từ các tiền chất silic hữu cơ được bis-silyl hóa dạng $(R'O)_3Si-R-Si(OR')_3$, kết hợp với chất hoạt động bề mặt đóng vai trò khuôn định hướng cấu trúc (chất tạo mixen).

Về mặt cố định phân tử sinh học, tác giả phân tích ba phương pháp: vi bao/nhốt giữ (entrapment), gắn cộng hóa trị và hấp phụ vật lý. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp hấp phụ vật lý dựa trên các lực liên kết không cộng hóa trị (tương tác tĩnh điện, tương tác kỵ nước, liên kết hydro và lực Van der Waals). Phương pháp này giúp bảo tồn nguyên vẹn cấu trúc không gian ba chiều và hoạt tính sinh học của protein, đồng thời mang tính chất thuận nghịch, cho phép thu hồi và tái sử dụng giá mang.

Cơ sở chọn lựa protein mô hình dựa trên sự khác biệt về kích thước phân tử và điểm đẳng điện ($pI$):

• Albumin huyết thanh bò (BSA): Khối lượng phân tử 66.400 Da, gồm 583 gốc acid amin, cấu trúc $74%$ chuỗi xoắn $\alpha$, điểm đẳng điện $pI = 4,7$. Tại $pH = 6,5$ (dung dịch đệm PBS), BSA mang điện tích âm thuần.
• Insulin: Phân tử lượng 5.808 Da, gồm 51 gốc acid amin trên 2 chuỗi polypeptid liên kết bằng các cầu disulfua, điểm đẳng điện $pI = 5,4$. Tại $pH = 5,5$ (dung dịch đệm MES), Insulin ở trạng thái gần trung hòa điện tích.
• Trypsin: Phân tử lượng 23.300 Da, gồm 223 gốc acid amin, điểm đẳng điện $pI = 10,5$. Tại $pH = 5,5$ (dung dịch đệm MES), Trypsin mang điện tích dương thuần rất mạnh.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và trang thiết bị

Quá trình nghiên cứu sử dụng các phương pháp hóa nghiệm và quang phổ hiện đại:

• Phương pháp tổng hợp và biến tính vật liệu: Tổng hợp vật liệu PMO trung tính bằng phương pháp sol-gel từ các tiền chất 1,2-Bis(trimethoxysilyl)ethane (BTME) và 1,2-Bis(triethoxysilyl)ethane (BTEE) dưới sự định hướng cấu trúc của chất hoạt động bề mặt Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB). Nhóm amin được đưa lên khung cấu trúc bằng cách đồng ngưng tụ với (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) để tạo NPA và MPA. Nhóm carboxyl được tạo thành bằng phản ứng chức năng hóa bề mặt PMO amin với Succinic acid anhydride (SAA) ở nồng độ 10 mg/mL ($pH = 6$) trong 2 giờ để thu được NPC và MPC.
• Phương pháp hấp phụ và định lượng: Cân chính xác 10 mg từng loại vật liệu PMO, rửa sạch hai lần bằng dung dịch đệm tương ứng (đệm PBS $pH = 6,5$ cho BSA; đệm MES $pH = 5,5$ cho Insulin và Trypsin). Thêm 800 $\mu$L dung dịch protein vào vật liệu, tiến hành ủ và lắc trộn trên máy lắc Mini-rotator Bio RS-24. Khảo sát động học hấp phụ được thực hiện tại các mốc thời gian: 5, 10, 15, 20, 25 và 30 phút. Khảo sát dung lượng hấp phụ theo nồng độ ban đầu được thực hiện với dãy nồng độ BSA từ 0,5 đến 20 mg/mL, dãy nồng độ Insulin và Trypsin từ 0,1 đến 5 mg/mL trong thời gian lắc 20 phút.
• Trang thiết bị sử dụng: Máy quang phổ huỳnh quang Nanodrop ND 8000 (Thermo Scientific) đo độ hấp thụ tại bước sóng 280 nm ($A_{280}$) với thể tích mẫu 1–3 $\mu$L; máy ly tâm MiniSpin plus (Eppendorf); cân phân tích A&D GR-200; máy đo pH cầm tay Oakton.

Nguồn dữ liệu và công thức xử lý số liệu

Dữ liệu thô thu nhận từ tín hiệu hấp thụ quang $A_{280}$ trên máy Nanodrop ND 8000 được ghi nhận và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016. Lượng protein bị hấp phụ trên một đơn vị khối lượng vật liệu ($q_t$, đơn vị mg/g) tại thời điểm $t$ được xác định dựa trên định luật Lambert-Beer và công thức cân bằng khối lượng:

$$q_t = \frac{(C_0 - C_t) \cdot V}{W}$$

Trong đó:

• $q_t$: Khối lượng protein bị hấp phụ trên 1 gam vật liệu (mg/g).
• $C_0$: Nồng độ protein ban đầu của mẫu chứng (mg/mL).
• $C_t$: Nồng độ protein còn lại trong dung dịch tại thời điểm khảo sát $t$ (mg/mL).
• $V$: Thể tích dung dịch protein sử dụng (mL), ở đây cố định là 0,8 mL.
• $W$: Khối lượng vật liệu chất hấp phụ khô (g), ở đây là 0,01 g (10 mg).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1 - Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý luận về khoa học và công nghệ nano, định nghĩa và phân loại vật liệu nano (0D, 1D, 2D, 3D), đồng thời phân tích sâu hai hiện tượng cốt lõi: hiệu ứng bề mặt (tỷ lệ nguyên tử bề mặt trên tổng số nguyên tử tăng vọt, làm giảm năng lượng liên kết và hạ nhiệt độ chuyển pha) và hiệu ứng kích thước (khi kích thước hạt tiệm cận các độ dài đặc trưng vật lý). Tác giả làm rõ lịch sử phát triển của vật liệu PMO từ năm 1999, các con đường tổng hợp bottom-up theo cơ chế sol-gel có khuôn định hướng CTAB, và các ứng dụng tiêu biểu trong y sinh học như xúc tác sinh học, làm giá mang giải phóng thuốc có kiểm soát (DDS cho ibuprofen, amoxicillin, gentamicin, aspirin...) và làm giàu peptide/protein. Chương này cũng phân tích chi tiết đặc điểm hóa sinh của ba phân tử protein thử nghiệm (BSA, Insulin, Trypsin) và điểm lại các công trình nghiên cứu nổi bật trên thế giới (Wan và cộng sự 2010, Qian và cộng sự 2011, Zhu và cộng sự 2012) cũng như nghiên cứu chế tạo vật liệu vi cấu trúc từ nền Fe ứng dụng y sinh của Lê Việt Cường (2017) tại Việt Nam.

Chương 2 - Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và đối tượng nghiên cứu gồm 6 loại vật liệu PMO: microPMO trung tính (MPT), microPMO amin (MPA), microPMO carboxylic (MPC), nanoPMO trung tính (NPT), nanoPMO amin (NPA) và nanoPMO carboxylic (NPC). Tác giả cung cấp danh mục hóa chất xuất xứ rõ ràng từ Canada (Bio Basic), Mỹ, Đức (Merck), Ấn Độ và Trung Quốc (Xilong); bảng danh mục dụng cụ và thiết bị đo kiểm. Quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa từng bước: tổng hợp PMO trung tính, PMO gắn nhóm amin bằng APTES, chuyển hóa bề mặt amin thành carboxyl bằng SAA; quy trình pha loãng dãy nồng độ chuẩn; quy trình ủ lắc hấp phụ protein theo thời gian và nồng độ; quy trình đo phổ quang học vi lượng trên Nanodrop ND 8000 và các phương trình toán học sử dụng để tính toán dung lượng hấp phụ.

Chương 3 - Kết quả

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm đo đạc và đồ thị biểu diễn:

• Xây dựng đường chuẩn nồng độ protein:
  • Đường chuẩn BSA (5 điểm nồng độ: 0,5; 2,5; 5; 10; 20 mg/mL): Phương trình hồi quy $y = 0,6348x - 0,0574$ với hệ số tương quan $R^2 = 0,9998$.
  • Đường chuẩn Insulin (5 điểm nồng độ: 0,1; 0,5; 1; 2; 5 mg/mL): Phương trình hồi quy $y = 3,9162x + 0,0575$ với $R^2 = 0,9998$.
  • Đường chuẩn Trypsin (5 điểm nồng độ: 0,1; 0,5; 1; 2; 5 mg/mL): Phương trình hồi quy $y = 0,0269x - 0,0083$ với $R^2 = 0,9989$.
• Khả năng hấp phụ BSA: Trên hệ microPMO, quá trình hấp phụ diễn ra rất nhanh trong 5–10 phút đầu, trong đó MPA đạt khả năng hấp phụ cao nhất là 35,9924 mg/g, vượt trội so với MPT và MPC (đạt 25,83–28,18 mg/g). Cả ba vật liệu đều đạt trạng thái bão hòa tại thời điểm 15 phút. Khi tăng nồng độ BSA ban đầu từ 0,5 đến 20 mg/mL, dung lượng hấp phụ tăng tỷ lệ thuận với trật tự: MPA > MPT $\approx$ MPC. Trên hệ nanoPMO, NPA cũng thể hiện khả năng hấp phụ BSA vượt trội so với NPT và NPC ở mọi thời điểm và mọi nồng độ khảo sát; đồng thời dung lượng hấp phụ của hạt nano (NPA) cao hơn đáng kể so với hạt micro (MPA).
• Khả năng hấp phụ Insulin: Khảo sát trên hệ nanoPMO trong đệm MES ($pH = 5,5$) cho thấy lượng hấp phụ tăng mạnh trong 5–10 phút đầu và đạt bão hòa từ phút thứ 15. Tuy nhiên, khả năng hấp phụ của cả ba dạng biến tính NPA, NPT và NPC là tương đương nhau ở tất cả các thời điểm và nồng độ (dung lượng hấp phụ đạt xấp xỉ 109,259–109,6754 mg/g tại thời điểm 15 phút với nồng độ ban đầu 5 mg/mL).
• Khả năng hấp phụ Trypsin: Khảo sát trên hệ nanoPMO trong đệm MES ($pH = 5,5$) cho thấy xu hướng hoàn toàn trái ngược với BSA: vật liệu mang nhóm acid (NPC) có khả năng hấp phụ mạnh nhất, đạt 72,425 mg/g tại thời điểm 15 phút, tiếp theo là NPT, và thấp nhất là vật liệu mang nhóm amin (NPA). Dung lượng hấp phụ cũng đạt trạng thái cân bằng từ phút thứ 15 và tăng tỷ lệ thuận với nồng độ Trypsin ban đầu.

Chương 4 - Bàn luận

Chương 4 luận giải sâu sắc cơ chế chi phối quá trình hấp phụ protein lên hệ vật liệu PMO. Tác giả khẳng định tương tác tĩnh điện giữa các nhóm chức trên bề mặt vật liệu và điện tích thực của protein là yếu tố quyết định:

• Ở môi trường $pH = 6,5$, BSA ($pI = 4,7$) tích điện âm, do đó xuất hiện lực hút tĩnh điện mạnh mẽ với các nhóm amin tích điện dương ($-NH_3^+$) trên bề mặt MPA và NPA, giải thích vì sao vật liệu PMO-amin luôn có ái lực hấp phụ BSA cao nhất.
• Ở môi trường $pH = 5,5$, Trypsin ($pI = 10,5$) tích điện dương mạnh, do đó bị hút tĩnh điện mạnh nhất bởi các nhóm carboxyl tích điện âm ($-COO^-$) trên bề mặt NPC, dẫn đến dung lượng hấp phụ trên NPC đạt cực đại.
• Đối với Insulin, do môi trường thử nghiệm ($pH = 5,5$) gần trùng khớp với điểm đẳng điện ($pI = 5,4$), phân tử tồn tại ở trạng thái trung hòa điện thế bề mặt. Lực tĩnh điện bị triệt tiêu, quá trình hấp phụ lúc này chủ yếu bị chi phối bởi tương tác kỵ nước giữa khung organosilica và các chuỗi bên kỵ nước của protein, dẫn đến việc cả ba loại vật liệu (NPA, NPT, NPC) đều có khả năng hấp phụ tương đương nhau.
• Về ảnh hưởng của kích thước hạt, vật liệu nanoPMO có diện tích bề mặt riêng và độ xốp lớn hơn microPMO, mang lại số lượng tâm gắn hoạt động nhiều hơn trên một đơn vị khối lượng, giúp nâng cao dung lượng hấp phụ protein.
• Về động học, việc tất cả các hệ thử nghiệm đều đạt trạng thái bão hòa nhanh chóng tại thời điểm 15 phút chứng minh các mao quản của PMO có tính tiếp cận cao, phân tử protein khuếch tán thuận lợi vào các vị trí gắn mà không gặp cản trở không gian lớn.

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp số liệu thực nghiệm chính

Loại protein	$pI$	$pH$ đệm khảo sát	Điện tích thực của protein	Vật liệu PMO hấp phụ tốt nhất	Thời gian đạt bão hòa	Lượng hấp phụ tại 15 phút ($C_0 = 5$ mg/mL)
BSA	4,7	6,5 (PBS)	Âm ($-$)	NPA / MPA (gắn nhóm amin)	15 phút	MPA đạt 35,9924 mg/g (NPA cao hơn MPA)
Insulin	5,4	5,5 (MES)	Gần trung hòa ($\approx 0$)	Tương đương giữa NPA, NPT, NPC	15 phút	109,259 – 109,6754 mg/g
Trypsin	10,5	5,5 (MES)	Dương ($+$)	NPC (gắn nhóm carboxyl)	15 phút	NPC đạt 72,425 mg/g

Đóng góp khoa học và giải pháp đề xuất

• Xác lập quy luật tương tác tĩnh điện - kỵ nước: Khóa luận đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng quá trình hấp phụ protein lên vật liệu PMO bị điều khiển bởi sự tương quan giữa điểm đẳng điện ($pI$) của protein, $pH$ của môi trường đệm và bản chất nhóm chức hóa học biến tính trên bề mặt vật liệu.
• Tối ưu hóa thời gian và kích thước: Nghiên cứu xác định được mốc thời gian 15 phút là thời điểm tối ưu để đạt trạng thái cân bằng hấp phụ cho cả ba hệ protein; đồng thời chứng minh cấu trúc kích thước nano (nanoPMO) vượt trội hơn kích thước micro (microPMO) về dung lượng tải protein trên mỗi gam chất hấp phụ.
• Đề xuất giải pháp tiền xử lý mẫu sinh học: Tác giả đề xuất định hướng ứng dụng hệ vật liệu PMO chức năng hóa như một công cụ hiệu quả để bẫy, phân tách và làm giàu nồng độ các peptide/protein dấu ấn sinh học có nồng độ cực thấp từ dịch thể sinh học, phục vụ trực tiếp cho mục tiêu nâng cao độ nhạy của các bộ kít định lượng biomarker trong chẩn đoán biến chứng võng mạc đái tháo đường thuộc khuôn khổ Đề tài Nghị định thư NĐT.CHN/19.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Các thử nghiệm tương tác trong khóa luận mới chỉ dừng lại ở các mẫu protein chuẩn đơn lẻ (BSA, Insulin, Trypsin) hòa tan trong dung dịch đệm nhân tạo (PBS, MES) với các điều kiện lý tưởng, chưa khảo sát trên các hỗn hợp protein đa thành phần hoặc mẫu bệnh phẩm dịch sinh học thực tế (huyết thanh, huyết tương, dịch kính). Ngoài ra, nghiên cứu chưa tiến hành thực nghiệm giải hấp phụ (desorption) để đánh giá tỷ lệ thu hồi protein đích cũng như độ bền tái sử dụng của vật liệu qua nhiều chu kỳ.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng khảo sát khả năng hấp phụ chọn lọc của hệ vật liệu nanoPMO trên các mẫu bệnh phẩm huyết thanh thực tế thu thập từ bệnh nhân mắc bệnh võng mạc đái tháo đường; nghiên cứu tối ưu hóa quy trình giải hấp phụ để thu hồi nguyên vẹn các peptide đích; tích hợp vật liệu nanoPMO vào các cột sắc ký ái lực nhỏ hoặc chip vi lưu nhằm tự động hóa quy trình làm giàu biomarker trước khi phân tích khối phổ hoặc miễn dịch huỳnh quang.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận này là nguồn tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Dược học, Công nghệ nano y sinh, Hóa dược và Hóa phân tích sinh học:

• Quy trình tổng hợp và biến tính bề mặt organosilica: Cung cấp phương pháp chi tiết điều chế PMO trung tính, PMO amin (sử dụng APTES) và PMO carboxylic (sử dụng SAA) bằng phương pháp sol-gel có độ lặp lại cao.
• Quy trình thực nghiệm khảo sát tương tác sinh học vi lượng: Là tài liệu tham khảo chuẩn mực về cách thiết lập thí nghiệm hấp phụ theo thời gian, theo nồng độ và kỹ thuật định lượng protein vi lượng thể tích 1–3 $\mu$L bằng máy đo quang phổ huỳnh quang Nanodrop ND 8000.
• Cơ sở dữ liệu tương quan $pH$ - $pI$ - Nhóm chức: Cung cấp dẫn chứng thực nghiệm rõ ràng về cách kiểm soát điện tích bề mặt nhằm định hướng thiết kế các hệ chất mang làm giàu hoặc dẫn truyền hoạt chất sinh học có chọn lọc.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao vật liệu PMO mang nhóm amin (MPA, NPA) lại hấp phụ protein BSA tốt nhất?

Trong dung dịch đệm PBS có $pH = 6,5$, do BSA có điểm đẳng điện $pI = 4,7$ ($pH > pI$) nên phân tử BSA mang điện tích âm thuần. Ngược lại, nhóm amin ($-NH_2$) trên bề mặt vật liệu MPA và NPA bị proton hóa thành dạng tích điện dương ($-NH_3^+$). Lực hút tĩnh điện mạnh mẽ giữa các điện tích trái dấu này đã thúc đẩy lượng lớn BSA gắn kết lên bề mặt PMO amin, làm cho dung lượng hấp phụ của MPA và NPA vượt trội so với các dạng trung tính và acid.

2. Vì sao dung lượng hấp phụ Insulin lại tương đương nhau trên cả ba loại vật liệu nanoPMO?

Insulin có điểm đẳng điện $pI = 5,4$. Khi tiến hành khảo sát trong dung dịch đệm MES có $pH = 5,5$, giá trị $pH$ môi trường xấp xỉ điểm đẳng điện của phân tử, khiến điện tích thực của Insulin gần như bằng không. Do tương tác tĩnh điện bị triệt tiêu, quá trình gắn kết phân tử lúc này chủ yếu diễn ra thông qua tương tác kỵ nước giữa khung hữu cơ của silica với các gốc acid amin kỵ nước của Insulin. Do cả NPA, NPT và NPC đều có cùng bộ khung hữu cơ định kỳ, khả năng hấp phụ Insulin của cả ba vật liệu là tương đương nhau (đạt khoảng 109,259–109,6754 mg/g).

3. Thời gian ủ tối ưu để vật liệu PMO đạt trạng thái bão hòa hấp phụ protein là bao lâu?

Số liệu thực nghiệm khảo sát động học từ 5 đến 30 phút cho thấy lượng protein bị hấp phụ tăng rất nhanh trong khoảng 5–10 phút đầu tiên và đều đạt đến trạng thái bão hòa cân bằng tại thời điểm 15 phút. Sau 15 phút, lượng protein bị hấp phụ biến thiên không đáng kể đối với tất cả các mẫu thử (BSA, Insulin và Trypsin).

4. Phương trình đường chuẩn định lượng ba loại protein trên máy Nanodrop ND 8000 được xác định như thế nào?

Dựa trên phép đo mật độ quang tại bước sóng 280 nm ($A_{280}$), tác giả đã xây dựng ba đường chuẩn tuyến tính với độ tin cậy rất cao:

• BSA: $y = 0,6348x - 0,0574$ với hệ số tương quan $R^2 = 0,9998$ (khảo sát từ 0,5 đến 20 mg/mL).
• Insulin: $y = 3,9162x + 0,0575$ với hệ số tương quan $R^2 = 0,9998$ (khảo sát từ 0,1 đến 5 mg/mL).
• Trypsin: $y = 0,0269x - 0,0083$ với hệ số tương quan $R^2 = 0,9989$ (khảo sát từ 0,1 đến 5 mg/mL).

5. Sự khác biệt về khả năng hấp phụ giữa hạt kích thước nano (nanoPMO) và hạt kích thước micro (microPMO) là gì?

Khi so sánh giữa vật liệu MPA (micro) và NPA (nano) cùng mang nhóm amin để hấp phụ protein BSA, vật liệu nanoPMO (NPA) thể hiện dung lượng hấp phụ trên mỗi gam chất mang cao hơn đáng kể so với microPMO (MPA). Nguyên nhân là do các hạt kích thước nanomet sở hữu tỷ lệ diện tích bề mặt tiếp xúc trên thể tích lớn hơn nhiều lần so với các hạt kích thước micromet, cung cấp nhiều tâm tương tác hơn cho các phân tử protein bám dính.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Trương Thị Trang đã tổng hợp thành công 6 dạng vật liệu micro/nano PMO (trung tính, gắn amin, gắn carboxyl) và chứng minh hiệu quả hấp phụ protein thông qua phương pháp vật lý đơn giản, nhanh chóng đạt trạng thái bão hòa chỉ sau 15 phút. Nghiên cứu đã làm sáng tỏ cơ chế tương tác tĩnh điện và tương tác kỵ nước phụ thuộc vào điểm đẳng điện của protein ($pI$) và $pH$ môi trường đệm, trong đó nanoPMO amin hấp phụ mạnh nhất với BSA mang điện tích âm, nanoPMO carboxyl hấp phụ tối ưu với Trypsin mang điện tích dương, và Insulin trung hòa điện tích hấp phụ đồng đều qua tương tác kỵ nước. Các kết quả thực nghiệm này cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thực nghiệm quan trọng, mở ra hướng ứng dụng vật liệu PMO kích thước nano trong việc tiền xử lý và làm giàu các chỉ dấu sinh học peptide nồng độ thấp phục vụ chẩn đoán sớm trong y dược học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1. Tổng quan về vật liệu micro/nano 1. Định nghĩa khoa học nano và công nghệ nano Khoa học nano là ngành khoa học nghiên cứu nghiên cứu về cấu trúc và phân tử ở kích thước nanomet (từ vài đến vài trăm nanomet). Khoa học nano là sự hội tụ vật lý, khoa học vật liệu và sinh học, liên quan đến các thao tác vật liệu ở các quy mô nguyên tử, phân tử và đại phân tử.

Công nghệ nano là khả năng quan sát, đo lường, thao tác, lắp ráp, kiểm soát và sản xuất vật chất ở quy mô nanomet. Theo Tổ chức sáng kiến công nghệ Quốc gia (NNI) Hoa Kỳ, công nghệ nano là “một ngành khoa học, kỹ thuật và công nghệ được tiến hành ở quy mô nano (1 đến 100 nm), nơi các hiện tượng độc đáo cho phép ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, từ hóa học, vật lý và sinh học, đến y học, kỹ thuật và điện tử”[4] 1. Vật liệu micro/nano 1. Định nghĩa Vật liệu nano là đối tượng của khoa học nano và công nghệ nano, nó có vai trò liên kết hai lĩnh vực trên với nhau.

Vật liệu nano có khả năng ứng dụng trong y sinh học vì kích thước của chúng so sánh được với kích thước của tế bào khoảng từ 1 nanomet đến 100 nanomet. Khác với vật liệu nano, vật liệu micro có kích thước lớn hơn, từ vài micromet (mcm) đến vài trăm micromet. Phân loại Vật liệu nano có thể được phân loại thành các nhóm khác nhau theo các tiêu chí như: kích thước, hình thái, trạng thái và thành phần hóa học. Dựa trên kích thước và hình dạng tổng thể, vật liệu nano có thể được chia thành bốn loại.

Vật liệu nano không chiều (0D) có cả ba chiều đều ở kích thước nano, tức là có kích thước dưới 100 nm, bao gồm các vật liệu nano hình cầu, khối lập phương, thanh nano, đa giác, khối cầu rỗng, kim loại, vỏ - lõi, chấm lượng tử (QDs). Vật liệu nano một chiều (1D) là vật liệu có một chiều không ở kích thước nano trong khi hai chiều còn lại ở kích thước nano. Vật liệu nano hai chiều (2D) chỉ có một chiều 3 Luan van ở kích thước nano trong khi hai chiều còn lại thì không. Vật liệu ba chiều (3D) có các kích thước khác nhau ngoài 100 nm.

Dựa vào hình thái, vật liệu nano được chia thành ba dạng: phẳng, hình cầu, tỷ lệ khung hình. Theo trạng thái, vật liệu có thể được phân loại là isometric, vật liệu nano không đồng nhất, phân tán và kết tụ. Sự kết tụ này dựa trên các đặc tính điện từ, từ tính và điện tích bề mặt của vật liệu nano. Hơn nữa, sự kết tụ của các vật liệu nano trong chất lỏng phụ thuộc vào hình thái và chức năng, dẫn đến tính kỵ nước hoặc tính ưa nước.

Dựa trên thành phần hóa học của chúng, vật liệu nano có thể được phân loại thành nhiều loại khác nhau như hạt nano, nanocomposite và các vật liệu hữu cơ, vô cơ[37] 1. Tính chất của vật liệu micro/nano Vật liệu micro/nano có những tính chất đặc biệt và khác so với vật liệu khối đã từng nghiên cứu. Khi kích thước giảm xuống cỡ nanomet thì có hai hiện tượng đặc biệt xảy ra: Hiệu ứng bề mặt và hiệu ứng kích thước. Đối với hiệu ứng bề mặt: Khi kích thước của vật liệu nhỏ thì tỉ số giữa số nguyên tử trên bề mặt và tổng số nguyên tử của vật liệu gia tăng.

Mặt khác, năng lượng liên kết của các nguyên tử bề mặt bị hạ thấp một cách đáng kể vì chúng không được liên kết đầy đủ, điều này thể hiện qua nhiệt độ nóng chảy hoặc nhiệt độ chuyển pha cấu trúc của các hạt nano thấp hơn nhiều so với vật liệu khố thông thường (ví dụ, TiO2 có nhiệt độ chuyển pha từ cấu trúc anatase sang cấu trúc rutile là khoảng 400 độ C khi vật liệu ở cỡ nano và khoảng 1200 độ C khi vật liệu ở dạng khối). Đối với hiệu ứng kích thước: Khác với hiệu ứng bề mặt, hiệu ứng kích thước mang lại sự khác biệt rất nhiều cho vật liệu nano so với vật liệu truyền thống. Điều này là bởi vì đối với một vật liệu, mỗi một tính chất của vật liệu này đều có một độ dài đặc trưng. Độ dài đặc trưng của rất nhiều các tính chất của vật liệu đều rơi vào kích thước nm.

Ở vật liệu khối, kích thước vật liệu lớn hơn nhiều lần độ dài đặc trưng này dẫn đến các tính chất vật lí đã biết. Nhưng khi kích thước của vật liệu có thể so sánh được với độ dài đặc trưng đó thì tính chất có liên quan đến độ dài đặc trưng bị thay đổi đột ngột, khác hẳn so với tính chất đã biết trước đó. Nghĩa là không có sự chuyển tiếp một cách liên tục về tính chất khi đi từ vật liệu khối đến vật liệu nano. Chính vì 4 Luan van vậy, khi nói đến vật liệu micro/nano, chúng ta phải nhắc đến tính chất đi kèm của vật liệu đó[1] 1.

Vật liệu Periodic mesoporous organosilicas (PMOs) 1. Sự ra đời của PMOs Năm 1999, các nhóm nghiên cứu của Inagaki[36] Stein và Ozin đã báo cáo một cách độc lập về sự tổng hợp của các organosilicas trung tính từ các tiền chất hữu cơ được bis-silyl hóa [(R’O)3Si–R–Si(OR’)3. PMOs được nghiên cứu trong bối cảnh chức năng hóa bề mặt của các silicas trung tính định kỳ (PMS) được yêu cầu để mở rộng và cải thiện ứng dụng của chúng như chất hấp phụ, chất xúc tác, chất bẫy, cảm biến[9]… .Các organosilica trung tính định kỳ là một loại vật liệu lai hữu cơ-vô cơ có trật tự mới, trong đó các đơn vị hữu cơ được phân bố đồng nhất vào khung silica[36]. PMO bảo toàn được những chức năng cơ bản của silica trung tính như diện tích bề mặt và thể tích lỗ cao, kích thước lỗ có thể điều chỉnh, cấu trúc trung gian có trật tự cao, ngoài ra vật liệu này còn thể hiện được một số ưu điểm đặc biệt là tính ổn định cơ học và thủy nhiệt cao so với các đối tác silica của chúng do kết hợp tải nhiều chất hữu cơ vào khuôn khổ của chúng[8].

Các PMO có chức năng cao có thể tìm thấy các ứng dụng mới mà silica trung tính không thể đạt được như trong các ứng dụng quang học như xúc tác quang thu ánh sáng, phim phát quang có thể điều chỉnh màu, thiết bị quang điện và xúc tác phức kim loại không đồng nhất. Một số phương pháp tổng hợp vật liệu PMO Vật liệu nano được chế tạo bằng hai phương pháp chính: phương pháp từ trên xuống (top-down) và phương pháp từ dưới lên (bottom-up). Phương pháp từ trên xuống là phương pháp tạo hạt có kích thước micro/nano từ kích thước lớn hơn trong khi đó phương pháp từ dưới lên là hình thành hạt micro/nano từ các nguyên tử (kích thước angstrom). Phương pháp từ trên xuống bao gồm các kỹ thuật như nghiền, nghiền bi năng lượng cao, in thạch bản, hợp kim cơ học, lắng đọng pha hơi hóa học (CVD) và lắng đọng pha hơi vật lý (PVD),.

Phương pháp từ dưới lên chủ yếu được thực hiện bằng con đường hóa học như sol – gel, thủy nhiệt, đồng 5 Luan van kết tủa, epitaxy chùm phân tử,. Ngoài ra, tổng hợp PMO còn được phân loại dựa vào các con đường khau nhau như con đường vật lý, hóa học, cơ học, sinh học được minh họa ở hình 1. Vật liệu PMO thường được điều chế bằng phương pháp sol-gel trong dung dịch nước[28]. Quá trình tổng hợp bao gồm quá trình thủy phân và ngưng tụ silica hữu cơ trong dung dịch nước dưới xúc tác base hoặc acid.

Đặc điểm chính của tổng hợp PMO: trùng hợp silica hữu cơ với cầu nối là một nhóm hữu cơ thay vì cầu nối là đầu chất này và đuôi chất kia. Nguyên liệu để tổng hợp PMO thường bao gồm tiền chất, chất hoạt động bề mặt. Để thu được vật liệu xốp rỗng PMO, chất hoạt động bề mặt được thêm vào. Trong trường hợp tạo khuôn bằng CTAB, khi nồng độ chất hoạt động bề mặt dưới nồng độ micelle tới hạn (CMC), các chất hoạt động bề mặt có xu hướng hấp phụ như một lớp đơn ở bề mặt phân cách nước ± không khí.

Ở nồng độ trên CMC, chúng tạo ra các mixen hình cầu. Với sự gia tăng hơn nữa về nồng độ của chất hoạt động bề mặt, các mixen hình cầu trở thành hình trụ và ở nồng độ cao hơn nữa, đóng gói hình lục giác của các mixen hình ống được hình thành[34] Hình 1. Tổng hợp PMO từ tiền chất silic hữu cơ (thủy phân và ngưng tụ silica hữu cơ trong dung dịch nước dưới xúc tác base hoặc acid với sự có mặt của chất hoạt động bề mặt. Các mixen hình cầu trở thành hình trụ và ở nồng độ chất hoạt động bề mặt cao hơn nữa, đóng gói hình lục giác của các mixen hình ống được hình thành) Nguồn: "Periodic mesoporous organosilicas for advanced applications"[28] 6 Luan van 1.

Ứng dụng của PMO trong y học và y sinh học Cùng với sự phát triển của khoa học nano và công nghệ nano trong rất nhiều lĩnh vực của đời sống, ngày nay việc nghiên cứu ứng dụng vật liệu micro/nano trong y học nói chung và ứng dụng vật liệu micro/nano PMO nói riêng mang đến nhiều hứa hẹn cho các ứng dụng tiềm năng, chẳng hạn như xúc tác[25], điện tử[13, 22], hấp phụ kim loại[12], cố định hoặc bao bọc các phân tử sinh học và y sinh thiết kế các PMO chức năng cho ứng dụng tiếp theo của chúng như là chất hỗ trợ hoặc chất mang phù hợp của các phân tử sinh học, chất xúc tác sinh học và thuốc khác nhau[9] Hình 1. Các ứng dụng của PMO – xúc tác sinh học, hấp phụ phân tử sinh học, phân phối thuốc (Bio-catalysis: Xúc tác sinh học do sự đồng tồn tại của các tương tác tĩnh điện và kỵ nước đối với sự cố định của enzyme; adsorption: Hấp phụ ổn định nhằm loại bỏ chọn lọc các ion kim loại; loading/release: quá trình hấp phụ/giải phóng thuốc có kiểm soát) 7 Luan van  Cố định phân tử sinh học Kể từ khi được phát hiện, vật liệu silicas trung tính được nghiên cứu rộng rãi với chức năng là một chất hỗ trợ cho sự cố định của các phân tử hoạt tính sinh học như là protein, enzyme, peptide[14]. Các vấn đề phổ biến liên quan đến sự thiếu ổn định của các enzym trong điều kiện khắc nghiệt và khả năng tái sử dụng của chúng được khắc phục rõ ràng sau khi cố định, mang lại một số lợi ích bổ sung như dễ dàng tách khỏi môi trường phản ứng, thay đổi các đặc tính xúc tác và ngăn ngừa sự nhiễm bẩn của protein trong số những đặc tính khác[11].