MỞ ĐẦU Việt Nam là một trong các thị trường dược phẩm lớn của khu vực Đông Nam Á. Đến đầu năm 2021, nước ta có 268 nhà máy sản xuất thuốc đạt nguyên tắc GMP- WHO [54], sản xuất thuốc của 640 dược chất thuộc 27 nhóm tác dụng dược lý khác nhau, trong đó có 652 biệt dược được chứng minh tương đương sinh học với thuốc gốc [55]. Các số liệu cho thấy ngành công nghiệp dược nước ta sẽ ngày càng phát triển. Song song với hoạt động sản xuất ngày một gia tăng thì hoạt động kiểm nghiệm cũng luôn được nâng cao để đáp ứng được với xu thế hội nhập.
Tiêu chuẩn chất lượng thuốc vì thế cũng được cập nhật theo Thông tư số 11/2018/TT-BYT ngày 04 tháng 5 năm 2018 [5] và Thông tư số 03/2020/TT-BYT ngày 22 tháng 01 năm 2020 sửa đổi, bổ sung một số điều của Thông tư 11/2018/TT-BYT của Bộ Y tế Quy định về chất lượng thuốc, nguyên liệu làm thuốc [6], trong đó có quy định xử phạt đối với các thuốc không đạt chỉ tiêu tạp chất liên quan vì ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị và tiềm ẩn nguy cơ không an toàn cho người bệnh. Vấn đề chuẩn tạp chất được đặt ra ở hầu hết các công ty sản xuất và cả những đơn vị kiểm nghiệm. Chuẩn tạp hiện nay đa số rất mắc tiền, thời gian đặt hàng lâu nếu mua các chuẩn USP, BP gây không ít khó khăn cho công tác sản xuất và công tác kiểm nghiệm. Amlodipin là dẫn xuất của dihydropyridin, thuốc chẹn kênh calci thế hệ 2 được FDA phê duyệt vào năm 1995, sử dụng cho các bệnh tim mạch là cao huyết áp và đau thắt ngực [1].
Amlodipin có nhiều ưu điểm như duy trì nồng độ ổn định trong máu, thời gian bán thải dài (liều một lần/ngày từ 5-10 mg), phù hợp khi bệnh nhân tăng huyết áp có kèm theo đái tháo đường, ngoài ra thuốc không gây phản xạ tăng nhịp tim và hạ huyết áp [4]. Amlodipin hiện là một trong các thuốc phổ biến khắp thế giới, riêng ở nước ta có 116 số đăng ký sản xuất thuốc chứa hoạt chất này ở dạng đơn chất và phối hợp với các thuốc tim mạch khác, với các dạng bào chế chủ yếu là viên nén và viên nang [60]. Nguyên liệu amlodipin chủ yếu từ các nhà cung cấp nước ngoài, vì vậy việc kiểm tra tạp chất trong nguyên liệu trước khi đưa vào sản xuất cũng như thành phẩm là rất quan trọng. Theo dược điển Anh 2020 và dược điển Việt Nam V, có 7 tạp chất liên quan trong nguyên liệu amlodipin besylat cần được kiểm tra là tạp A, B, D, E, F, G, H; trong khi.
2 đó theo dược điển Mỹ 43, tạp cần kiểm tra trong nguyên liệu là tạp A (còn gọi là tạp D theo dược điển Anh 2020 và dược điển Việt Nam V). Trong thành phẩm, tạp cần kiểm tra theo dược điển Việt Nam V là tạp D; theo dược điển Anh 2020 là tạp A, B, D, E, F, G, amlodipin 1; theo dược điển Mỹ 43 là tạp A và tạp D (còn gọi là tạp A theo dược điển Anh 2020 và dược điển Việt Nam V), tạp sản phẩm cộng của amlodipin và lactose, tạp sản phẩm cộng của amlodipin và galactose, tạp sản phẩm cộng của amlodipin và mannitol. Tạp chất A, D và G đã được các nhóm nghiên cứu của Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh tổng hợp thành công và thiết lập tạp chuẩn phục vụ trong công tác kiểm nghiệm. Trong đó, tạp A đã được Lê Thị Diễm Trang và cộng sự [9] tổng hợp ở quy mô phòng thí nghiệm với khối lượng sản phẩm là 1,42 g; hiệu suất toàn quá trình 52,14%; độ tinh khiết 99,42% và đã được thiết lập chất đối chiếu.
Giá thành của tạp A chuẩn và tạp B chuẩn hiện nay được bán bởi EDQM là 79 euro/15 mg [57], bởi USP là 775 USD/25 mg [61], giá của tạp A chuẩn của Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM [62] chưa công bố; riêng tạp B chưa có trong danh mục chất chuẩn đối chiếu của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Trên thế giới cho đến nay chỉ có một công trình nghiên cứu tổng hợp tạp B [13] và tại Việt Nam chưa có tác giả nào công bố công trình tổng hợp tạp B. Điều này gây khó khăn cho quá trình kiểm nghiệm tạp chất liên quan của nguyên liệu và thành phẩm amlodipin. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu A và B của amlodipin” được thực hiện để phục vụ cho mục đích kiểm nghiệm tạp chất liên quan của amlodipin trong nguyên liệu và thành phẩm, góp phần đáp ứng nhu cầu sử dụng tạp chuẩn trong nước.
Mục tiêu của đề tài là: - Nâng cấp 5 lần quy mô tổng hợp tạp A của amlodipin ở phòng thí nghiệm. - Tổng hợp tạp B của amlodipin ở quy mô phòng thí nghiệm. - Thiết lập chất đối chiếu hai tạp đã tổng hợp. - Kiểm tra tạp A và tạp B trong nguyên liệu và thành phẩm amlodipin theo chuyên luận của dược diển Anh 2020, sử dụng tạp chất đối chiếu đã được thiết lập.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về amlodipin - Tên hóa học: 3-ethyl 5-methyl (4RS)-2-[(2-aminoethoxy)methyl]-4-(2- clorophenyl)-6-methyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat. - Công thức phân tử: C20H25ClN2O5. - Phân tử lượng: 408,88 g/mol.
- Công thức cấu tạo:[38] và đồng phân đối quang 1. Tính chất lý hóa Amlodipin dạng base là chất rắn màu trắng hoặc gần như trắng, không mùi; ít tan trong nước (độ tan: 75,3 mg/L ở 25 oC), tan trong aceton, cloroform, ethyl acetat, methanol; pKa = 8,6; nhiệt độ nóng chảy 137 ºC [38]. Amlodipin trong các dạng bào chế chủ yếu ở dạng muối besylat [19]. Amlodipin besylat là chất bột trắng hoặc gần như trắng; dễ tan trong methanol, hơi tan trong ethanol, khó tan trong nước và 2- propanol; nhiệt độ nóng chảy 195,4 ºC [33],[34].
Dạng base chuyển thành dạng muối besylat và ngược lại theo phản ứng sau: Acid benzensulfonic/ amoni benzensulfonat Amlodipin base Amlodipin besylat NaOH 1 M 1. Tổng hợp Amlodipin được tổng hợp bằng hai phương pháp dựa trên phản ứng Hantzsch và phản ứng Azo-Diels-Alder [10],[31]. Dựa trên phản ứng Hantzsch Amlodipin thuộc nhóm dẫn xuất 1,4-DHP bất đối xứng được tổng hợp bằng phản ứng Hantzsch biến đổi với hai con đường tổng quát (A) và (B) như sơ đồ sau [11]:. Phản ứng tổng quát tổng hợp amlodipin base (Ab): amlodipin base, X là một nhóm tiền chất bảo vệ với nhóm amin bậc 1.
Con đường (A) là phản ứng giữa benzyliden với aminocrotonat. Con đường (B) là ngưng tụ 3 thành phần phản ứng gồm alkyl aminocrotonat với 2-clorobenzadehyd và β- cetoester. Phản ứng tổng hợp amlodipin base ứng với các nhóm tiền chất bảo vệ X Nhóm tiền chất bảo vệ X Hiệu suất phản ứng Hiệu suất phản ứng là 19%, được tách loại bằng Azido H2/Pd hoặc Zn và HCl [42],[52]. Hiệu suất phản ứng là 25%, được tách loại bằng Phthalimido amin bậc 1, hydrazin hydrat hoặc KOH sau đó trung hòa bằng HCl [42],[52].
Hiệu suất phản ứng là 7%, được tách loại khi tác Trityl dụng với acid benzensulfonic trong methanol tạo amlodipin besylat [15],[52]. Hiệu suất phản ứng là 53%, tách loại bằng Pyrol hydroxylamin hydroclorid trong dung môi hữu cơ (isopropanol, methanol, ethanol hoặc 1-butanol) [52]. Hiệu suất phản ứng là 10%, cần hai bước hydro hóa Benzyl để loại nhóm bảo vệ amin [52]. Chuyển thành nhóm amin bẳng phản ứng Delepine; tác dụng với hexamethylen tetramin tạo thành muối Halogen Cl-, I- urotropin sau đó tác dụng với acid benzensulfonic để tạo amlodipin besylat; hiệu suất 47% (với Cl-); hiệu suất 22% (với I-) [18].
5 Nhận xét: đây là phản ứng tổng hợp amlodipin được nghiên cứu lâu đời, ổn định cao, hiệu suất lặp lại, dễ tinh chế sản phẩm. Hợp chất trung gian phthalimido amlodipin là chất phổ biến trong sản xuất quy mô công nghiệp [59] vì nhóm phthalimido dễ tách loại, không gây cháy nổ và khó kiểm soát như azido; được chuyển thành amlodipin base cho các bước tổng hợp tiếp theo bởi các chất đơn giản, có sẵn như methylamin. Dựa trên phản ứng Aza-Diels-Alder Quy trình qua 6 bước, mất 112 giờ để hoàn thành, đạt hiệu suất 8%, phản ứng phù hợp ở quy mô phòng thí nghiệm và ít được nhắc đến trong các phương pháp tổng hợp amlodipin ở quy mô công nghiệp [31]. Định tính amlodipin besylat 1.
Trong nguyên liệu Bảng 1. Các phương pháp định tính nguyên liệu amlodipin besylat theo dược điển tham chiếu Phương DĐVN V [3], BP 2020 [56], USP 43 [48] pháp EP 10. Các đỉnh đặc trưng trong phổ IR của amlodipin base và amlodipin besylat [10] (cm-1) Nhóm chức Amlodipin base Amlodipin besylat N-H (amin, DHP) 3390 3297 ~3075, ~3065 3158 C-H (nhân thơm) 758, 736, 612 755, 730, 615 C-H (mạch thẳng) 2982, 2945, 2895, 2855 2985 C=O (ester) 1686 1698, 1676 Nhân thơm 1602, 1478 1614, 1493 CH3, CH2 1478 1445, 1432 C-O (ester) 1283, 1204 1207, 1126 C-O-C (ether) 1118, 1099, 1039, 1018 1095, 1034, 1018 S=O (sulfonat) 1207, 1095 C-Cl 1099 1095. Trong chế phẩm Bảng 1.
Các chuyên luận thành phẩm amlodipin trong các dược điển tham chiếu Đơn chất Phối hợp DDVN V BP 2020 USP 43 USP 43 Viên nén Viên nén Viên nén Viên nén amlodipin và atorvastatin Dung Viên nén amlodipin và valsartan dịch uống Viên nén amlodipin, valsartan và hydroclorothiazid Viên nén amlodipin và telmisartan Hỗn dịch Viên nén amlodpin và olmesartan medoxomil uống Viên nang amlodipin và benazepril hydrocloric Bảng 1. Các phương pháp định tính amlodipin besylat trong thành phẩm theo dược điển tham chiếu DĐVN V [3] BP 2020 [56] USP 43 [48] Phương Viên nén Viên Dung dịch Viên Hỗn dịch uống Chế phẩm pháp nén uống nén pha từ viên nén phối hợp IR SKLM Không có chỉ HPLC tiêu định tính UV Phương pháp IR Lắc một lượng bột thuốc tương ứng 50 mg amlodipin với 10 ml MeOH, lọc, làm khô cắn ở 40-60 °C. Phổ IR của cắn phải phù hợp với phổ tham chiếu của amlodipin besylat. Sự vắng mặt của các đỉnh ở khoảng 1570 cm-1, 1345 cm-1 và 875 cm-1 giúp phân biệt với amlodipin maleat.
Sự hiện diện của các đỉnh ở khoảng 995 cm-1 và 730 cm-1 và sự vắng mặt của một đỉnh ở khoảng 780 cm-1 giúp phân biệt với amlodipin mesilat [56]. Phương pháp SKLM Bảng 1. Định tính amlodipin besylat trong thành phẩm bằng phương pháp SKLM DĐVN V [3] BP 2020 [56] Bản mỏng Silica gel GF 254 Octadecylsilyl silica gel Acid acetic băng – nước – methyl Amoniac 10% - MeOH – Dung môi isobutyl ceton (25:25:50), để tách EtOAc (2:4:17) khai triển lớp, lấy lớp trên Lắc 1 lượng bột viên tương ứng Lắc một lượng chế phẩm tương 10 mg amlodipin với 2 ml đương 5 mg amlodipin với 20 DDT MeOH, ly tâm, lấy dịch trong ml CH2Cl2 trong 30 phút, ly tâm, lấy lớp dưới.