ĐẶT VẤN ĐỀ Ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài (TBGTMĐL) đã mở ra một cơ hội điều trị khỏi bệnh đối với ngƣời bệnh bị mắc bệnh máu. Phƣơng pháp chữa bệnh này đã đƣợc triển khai phổ biến tại Việt Nam và Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng hiện đang dẫn đầu cả nƣớc về số ca ghép thực hiện. Sự thành công của mỗi ca ghép đƣợc đánh giá thông qua nhiều chỉ số. Trong đó, tỷ lệ mọc mảnh ghép (chimerism) hay tỷ lệ tế bào ngƣời hiến trong cơ thể ngƣời nhận là một chỉ số quan trọng, đánh giá mức độ thành công của ca ghép, hỗ trợ chẩn đoán sớm thải ghép và biến chứng.
Tỷ lệ mọc mảnh ghép đƣợc xác định thông qua việc phát hiện và định lƣợng tỷ lệ các tế bào tạo máu có nguồn gốc từ ngƣời hiến so với các tế bào tạo máu có nguồn gốc từ ngƣời nhận trong máu ngoại vi hoặc tuỷ xƣơng (1). Chimerism có thể đƣợc theo dõi bằng kỹ thuật có độ nhạy trung bình nhƣ phân tích tế bào sử dụng các kháng nguyên bề mặt tới các kỹ thuật có độ nhạy cao hơn nhƣ lai tại chỗ gắn huỳnh quang nhiễm sắc thể (NST) giới tính X/Y (FISH X/Y) hoặc phân tích chuyên sâu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử. Với độ nhạy đƣợc báo cáo là 1-5%, kỹ thuật phân tích đoạn ADN trên điện di mao quản sử dụng các chỉ thị phân tử đa hình đoạn lặp ngắn ngẫu nhiên (STR: Short Tandem Repeat) đã trở thành phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong hai thập kỷ qua và là lựa chọn của nhiều phòng xét nghiệm trên thế giới (2). Hiện nay, có nhiều bộ xét nghiệm STR thƣơng mại đƣợc sử dụng trong phân tích chimerism nhƣ Powerplex 16 kit, AmpFISTR Profiler SGM kit, Triplex AFS kit, Global filer kit… Các bộ xét nghiệm này thƣờng chứa các locus đặc trƣng thƣờng dùng trong pháp y để phân biệt cá thể và đƣợc thiết kế phù hợp với tính đa dạng của các quần thể dân cƣ trên thế giới.
Do đó, nhiều locus có ít thông tin hơn để phân tích chimerism trong một số quần thể nhất định (3). Trong giai đoạn 2018 - 2022, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng đã thực hiện ghép TBGTMĐL trung bình 20 ca/ năm. Do đó, hiện có khoảng 100 ngƣời bệnh đang đƣợc theo dõi mọc mảnh ghép tại Khoa Di truyền – Sinh học phân tử bằng kỹ thuật phân tích đoạn ADN trên điện di mao quản với bộ xét nghiệm 2 Global filer. Bộ xét nghiệm này có 24 locus STR bao gồm các locus cố định dùng trong định danh cá thể và một số locus đƣợc khuyến nghị thêm có tính phân biệt cao nhƣ Yindel, TPOX, vWA….
Trong phân tích chimerism, thông tin các locus có giá trị theo dõi mang tính cá nhân hoá cho từng cặp ghép dựa trên các locus khác biệt giữa ngƣời hiến và ngƣời nhận tế bào gốc (TBG) (3). Việc lựa chọn số lƣợng và loại STR hay các locus có giá trị thông tin đối với từng cặp ghép rất quan trọng để đảm bảo kết quả chính xác và tin cậy. Vì vậy, với mong muốn đƣa ra những khuyến cáo về những STR có giá trị thông tin thƣờng đƣợc lựa chọn cũng nhƣ số lƣợng tối thiểu STR cần trong phân tích chimerism, tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Kết quả theo dõi mọc mảnh ghép ở ngƣời bệnh ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài bằng kỹ thuật phân tích đoạn ADN trên điện di mao quản tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ƣơng giai đoạn 2018-2022”. 3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.
Đánh giá các STR có giá trị thông tin của bộ xét nghiệm Global filer trong theo dõi mọc mảnh ghép ở ngƣời bệnh ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ƣơng giai đoạn 2018 - 2022. Đánh giá tình trạng mọc mảnh ghép ở ngƣời bệnh ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài bằng kỹ thuật phân tích đoạn ADN trên điện di mao quản sử dụng STR tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ƣơng giai đoạn 2018 - 2022. 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Thông tin chung về ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài 1.
Ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài Ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài (TBGTMĐL) là một phƣơng pháp điều trị hiệu quả cho rất nhiều bệnh máu lành tính và ác tính. Từ ca ghép đồng loài đầu tiên vào cuối thập lỷ 50, cho đến năm 2016 đã có hơn một triệu ca ghép đƣợc tiến hành trên toàn thế giới. Hiện nay, số lƣợng ghép trên thế giới mỗi năm đạt gần 70000 ca và xu hƣớng ngày càng tăng (4). Phƣơng pháp thực hiện ghép TBGTMĐL là truyền tế bào gốc tạo máu (TBGTM) từ ngƣời hiến phù hợp hệ thống kháng nguyên bạch cầu ngƣời (HLA: human leucocyte antigen) hoàn toàn hoặc không hoàn toàn, sau khi đã điều kiện hoá ngƣời bệnh bằng phác đồ diệt tuỷ hoặc không diệt tuỷ.
Nguồn TBG sử dụng trong ghép có thể lấy từ một trong ba loại gồm các TBGTM của ngƣời trƣởng thành lấy từ tuỷ xƣơng; các TBGTM của ngƣời trƣởng thành lấy từ máu ngoại vi; các TBGTM lấy từ máu cuống rốn (5). Những hiểu biết về đặc điểm sinh học của TBG ngày càng đầy đủ và việc phân loại nguy cơ bệnh máu ác tính dựa vào các dấu ấn di truyền – sinh học phân tử đã giúp tăng khả năng lựa chọn ngƣời bệnh. Từ đó, kết quả của ghép TBGTMĐL cũng đã đƣợc cải thiện và khả năng ứng dụng tiềm năng của ghép TBGTMĐL đƣợc mở rộng cho nhiều đối tƣợng bệnh khác nhau (6). Chimerism trong ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài Thuật ngữ chimerism bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “chimera” - là từ chỉ một con thú có các bộ phận lai giữa sƣ tử, dê và rắn.
Trong y học, chimerism đƣợc sử dụng để đề cập đến tình trạng khảm, hay sự hiện diện của các TBGTM có nguồn gốc không phải của ngƣời bệnh. Những tế bào này có thể đƣợc truyền ngẫu nhiên giữa thai nhi và mẹ hoặc truyền có chủ đích trong ghép TBGTMĐL (7). Trong ghép TBGTMĐL, tỷ lệ phần trăm chimerism đƣợc hiểu là tỷ lệ phần trăm tế bào ngƣời hiến trong cơ thể ngƣời nhận TBG hay là tỷ lệ phần trăm mọc mảnh ghép. Chimerism đƣợc đánh giá là mọc hoàn toàn khi tỷ lệ tế bào ngƣời 5 hiến/ngƣời nhận lớn hơn 95%; chimerism đƣợc đánh giá mọc một phần cao khi tỷ lệ tế bào ngƣời hiến/ngƣời nhận nằm trong khoảng 50% – 95%; mọc một phần thấp khi tỷ lệ tế bào ngƣời hiến/ngƣời nhận nằm trong khoảng 5% – 50% và chimerism đƣợc đánh giá không mọc khi tỷ lệ tế bào ngƣời hiến/ngƣời nhận từ nhỏ hơn 5% (8) (9).
Mảnh ghép TBGTMĐL thƣờng đƣợc kiểm tra ngay sau khi ghép 1 tháng và duy trì theo dõi tại các thời điểm sau ghép 3, 6, 9 và 12 tháng. Sau đó tuỳ thuộc vào tình trạng lâm sàng của ngƣời bệnh, chimerism sẽ đƣợc theo dõi định kỳ 6 tháng – 1 năm (10). Mẫu bệnh phẩm dùng trong theo dõi có thể là dịch tuỷ xƣơng, máu toàn phần hoặc mẫu tế bào tách dòng. Đối với ghép TBGTMĐL thì thông tin về tỷ lệ tế bào T của ngƣời hiến/ngƣời nhận rất quan trọng trong chẩn đoán thải ghép và bệnh ghép chống chủ (11).
Bệnh ghép chống chủ là một trong những biến chứng nguy hiểm và ảnh hƣởng nhiều nhất tới kết quả của ghép TBGTMĐL. Do vậy, một số tác giả khuyên dùng mẫu máu toàn phần trong những trƣờng hợp đánh giá kết quả ngay sau ghép vì trong máu toàn phần giai đoạn này giàu tế bào T cũng nhƣ các dòng khác hơn (12). Theo nghiên cứu của Antin và cộng sự (2001) thì tế bào T chiếm 10% của tổng số bạch cầu trong máu toàn phần, trong khi chỉ có 3% trong dịch tuỷ xƣơng (13). Ngoài ra, để tăng độ nhạy và tính chính xác của kỹ thuật, chimerism có thể đƣợc theo dõi theo từng dòng tế bào.
Theo nghiên cứu của Theide (2004) thì độ nhạy của phƣơng pháp khi tách dòng tế bào có thể tăng hơn 10 lần (14). Phƣơng pháp theo dõi chimerism trên các dòng tế bào có vai trò hỗ trợ, bổ sung cho phƣơng pháp theo dõi chimerism trên máu toàn phần. Đặc biệt, độ nhạy của phƣơng pháp cao hơn nên có thể phát hiện sớm sự tái phát của các dòng tế bào ác tính. Tuỳ thuộc vào thể bệnh, ngƣời nhận ghép có thể đƣợc theo dõi sau ghép trên từng dòng tế bào nhƣ tế bào lympho T (T hỗ trợ, T gây độc), tế bào lympho B, tế bào NK, tế bào dòng tuỷ…(15).
Các kỹ thuật theo dõi mọc mảnh ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài 1. Một số kỹ thuật theo dõi mọc mảnh ghép phổ biến Tỷ lệ chimerism đƣợc xác định thông qua việc phát hiện và định lƣợng tỷ lệ các TBGTM có nguồn gốc từ ngƣời hiến so với các tế bào tạo máu có nguồn gốc từ 6 ngƣời nhận. Đây là nguyên tắc cơ bản để theo dõi tình trạng mọc mảnh ghép TBGTMĐL của các phƣơng pháp khác nhau nhƣ tế bào học, di truyền học và sinh học phân tử. Chimerism có thể đƣợc theo dõi bằng kỹ thuật có độ nhạy trung bình khoảng 10% nhƣ phân tích tế bào sử dụng các kháng nguyên hồng cầu hoặc kháng nguyên bề mặt tới các kỹ thuật có độ nhạy cao hơn (5-10%) nhƣ lai huỳnh quang tại chỗ NST giới (FISH X/Y).
Các khác biệt về hệ kháng nguyên hồng cầu và nhiễm sắc thể giới tính chỉ có thể sử dụng trong các trƣờng hợp ngƣời hiến và ngƣời nhận khác nhóm máu và khác giới. So với những phƣơng pháp khác, phƣơng pháp phân tích chimerism dựa vào sự khác biệt giữa các dấu ấn phân tử ADN đặc trƣng ở mỗi cá thể có ƣu thế là sử dụng đƣợc cho tất cả các trƣờng hợp ghép TBGTMĐL. Các chỉ thị ADN nhƣ đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP: restriction fragment length polymorphism), đa hình đơn nucleotide (SNP: Single Nucleotide Polymorphism), đa hình số lần lặp lại ngẫu nhiên (VNTR: variable number of tandem repeats), đa hình đoạn lặp lại ngắn (STR: short tandem repeat) và các đa hình chèn/xoá (indel: insert/ deletion) có độ chính xác cao trong định danh đặc trƣng cá thể. Do vậy, các chỉ thị phân tử này đang đƣợc sử dụng làm công cụ chính để đánh giá tình trạng mọc mảnh ghép ở ghép TBGTMĐL.
Trong những năm gần đây, các phƣơng pháp sinh học phân tử dựa trên nguyên lý PCR ngày càng trở nên phổ biến vì các phƣơng pháp này không phụ thuộc vào sự khác biệt giới tính, có độ nhạy cao từ 0,1 – 0,001% và chỉ cần một lƣợng nhỏ vật liệu di truyền ban đầu (16).