Tạo nguyên liệu Paraprobiotic từ Lactobacillus acidophilus - Nguyễn Ngọc Ánh

Khóa luận nghiên cứu tạo nguyên liệu paraprobiotic từ Lactobacillus acidophilus, khảo sát phương pháp bất hoạt và hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm.

• Tác giả: Nguyễn Ngọc Ánh
• Người hướng dẫn: PGS. Đàm Thanh Xuân
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Sĩ
• Đề tài: Bước Đầu Tạo Nguyên Liệu Paraprobiotic Từ Vi Khuẩn Lactobacillus Acidophilus
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm và định nghĩa Paraprobiotic

Paraprobiotic là các chế phẩm sinh học được tạo từ vi khuẩn lợi khuẩn đã được bất hoạt hoàn toàn, trong đó các tế bào vi sinh vật không còn khả năng sinh sản nhưng vẫn giữ được những thành phần hữu ích như polysaccharide, protein và các hợp chất sinh học quý giá. Khác với probiotic là vi khuẩn sống, paraprobiotic cung cấp những lợi ích sức khỏe tương tự mà không gây ra lo ngại về độc tính từ các vi khuẩn sống. Đây là một bước tiến quan trọng trong ngành công nghệ sinh học dược, đặc biệt là trong việc ứng dụng Lactobacillus acidophilus để tạo các nguyên liệu có tính ổn định cao và an toàn cho con người.

1.1. Sự khác biệt giữa Paraprobiotic và Probiotic

Probiotic là vi khuẩn sống có khả năng sinh sản, trong khi paraprobiotic là vi khuẩn đã bất hoạt. Mặc dù vậy, cả hai đều cung cấp những lợi ích cho hệ tiêu hóa và miễn dịch. Paraprobiotic có ưu điểm là không cần bảo quản lạnh, ổn định hơn, và an toàn cho những đối tượng suy giảm miễn dịch. Các thành phần dịch nuôi cấy từ Lactobacillus acidophilus bất hoạt vẫn giữ được hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ.

1.2. Lợi ích của Paraprobiotic trong y tế

Paraprobiotic từ Lactobacillus acidophilus mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như cải thiện tiêu hóa, tăng cường miễn dịch, và ức chế các tác nhân gây bệnh. Các nghiên cứu cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của các thành phần từ dịch nuôi cấy bất hoạt có hiệu quả cao. Điều này mở ra tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng.

II. Phương pháp tạo Paraprobiotic từ Lactobacillus acidophilus

Việc tạo nguyên liệu paraprobiotic từ Lactobacillus acidophilus đòi hỏi các phương pháp xử lý khoa học để bất hoạt hoàn toàn vi khuẩn. Các phương pháp chính bao gồm xử lý nhiệt, tia UV, hoặc kết hợp cả hai để đảm bảo hiệu quả bất hoạt tối đa. Quá trình nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường thích hợp, sau đó thu hỗn dịch tế bào là bước chuẩn bị quan trọng. Việc lựa chọn thời gian xử lý và điều kiện phù hợp giúp giữ lại các thành phần sinh học quý giá trong dịch nuôi cấy, đảm bảo chất lượng của paraprobiotic cuối cùng.

2.1. Xử lý nhiệt và UV để bất hoạt vi khuẩn

Phương pháp xử lý nhiệt là cách truyền thống để bất hoạt Lactobacillus acidophilus hoàn toàn, giúp tiêu diệt khả năng sinh sản của tế bào. Tia UV có thể được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với nhiệt để tăng hiệu quả bất hoạt. Các nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa UV và nhiệt có thể bất hoạt vi khuẩn một cách hiệu quả hơn mà vẫn bảo toàn các thành phần hoạt tính kháng khuẩn.

2.2. Quá trình nuôi cấy và thu hóp dịch ngoại bào

Việc nuôi cấy Lactobacillus acidophilus được thực hiện trong môi trường thích hợp ở điều kiện kiểm soát. Sau khi nuôi cấy đạt mật độ tế bào yêu cầu, dịch ngoại bào (chứa các hợp chất tiết ra từ tế bào) được thu hóp qua ly tâm. Dịch nuôi cấy này chứa các thành phần sinh học quan trọng có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể, là nguyên liệu quý cho paraprobiotic.

III. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của Paraprobiotic

Sau khi bất hoạt, việc đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các thành phần từ dịch nuôi cấy Lactobacillus acidophilus là bước thiết yếu để xác nhận hiệu quả của paraprobiotic được tạo. Các chủng kiểm định khác nhau được sử dụng để kiểm tra khả năng ức chế của paraprobiotic đối với các tác nhân gây bệnh. Kết quả cho thấy các thành phần từ dịch ngoại bào thường có hoạt tính mạnh mẽ hơn so với dịch nội bào. Thời gian nuôi cấy cũng ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính kháng khuẩn, cho phép các nhà nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện sản xuất nguyên liệu paraprobiotic chất lượng cao.

3.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá bằng cách kiểm tra khả năng ức chế của paraprobiotic đối với các chủng kiểm định. Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa hoặc phương pháp pha loãng tuần tự, các nhà khoa học có thể đo lường hoạt tính kháng khuẩn một cách chính xác. Các thành phần từ dịch ngoại bào của Lactobacillus acidophilus bất hoạt cho thấy khả năng ức chế cao đối với các vi khuẩn gây bệnh.

3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính

Thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính kháng khuẩn của paraprobiotic. Các nghiên cứu cho thấy hoạt tính kháng khuẩn có thể thay đổi theo các giai đoạn khác nhau của nuôi cấy, với hoạt tính đạt cao nhất vào giai đoạn nhất định. Việc xác định thời điểm tối ưu cho nuôi cấy giúp tối đa hóa hoạt tính của nguyên liệu paraprobiotic cuối cùng.

IV. Ứng dụng và triển vọng của Paraprobiotic

Paraprobiotic từ Lactobacillus acidophilus có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm, thực phẩm chức năng và công nghệ sinh học. Với những ưu điểm về ổn định bảo quản, an toàn và hoạt tính kháng khuẩn vượt trội, nguyên liệu paraprobiotic được tạo từ dịch nuôi cấy bất hoạt có thể được sử dụng để phát triển các chế phẩm hỗ trợ sức khỏe tiêu hóa, miễn dịch. Xu hướng toàn cầu hướng tới các sản phẩm sinh học an toàn và hiệu quả tạo cơ hội lớn cho paraprobiotic trở thành nguyên liệu quý giá trong sản xuất dược và thực phẩm. Các nghiên cứu tiếp theo sẽ giúp mở rộng ứng dụng và nâng cao giá trị của paraprobiotic.

4.1. Ứng dụng trong ngành dược phẩm

Paraprobiotic từ Lactobacillus acidophilus có thể được sử dụng để sản xuất các chế phẩm dược hỗ trợ điều trị rối loạn tiêu hóa, tăng cường miễn dịch. Hoạt tính kháng khuẩn của paraprobiotic giúp ức chế các tác nhân gây bệnh, mang lại hiệu quả điều trị cao. Sử dụng paraprobiotic thay cho probiotic sống có ưu điểm là không cần bảo quản lạnh, dễ dàng trong quá trình sản xuất và đảm bảo an toàn cho người sử dụng.

4.2. Triển vọng phát triển trong tương lai

Xu hướng toàn cầu hướng tới các sản phẩm sinh học an toàn, tự nhiên tạo cơ hội phát triển lớn cho paraprobiotic. Các nghiên cứu tiếp tục sẽ khám phá thêm những lợi ích sức khỏe và ứng dụng mới của paraprobiotic từ Lactobacillus acidophilus. Với công nghệ tiên tiến, việc sản xuất nguyên liệu paraprobiotic chất lượng cao sẽ ngày càng hiệu quả, mở ra tiềm năng thương mại khổng lồ cho ngành dược và thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về paraprobiotic 1. Khái niệm “Probiotic” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, với danh từ “bios” – “cuộc sống” kết hợp với tiền tố Latin “pro” – “dành cho”, mang nghĩa là “dành cho sự sống”. Trong một báo cáo vào tháng 10 năm 2001, Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization – WHO) đã đưa ra định nghĩa đầy đủ về probiotic và vẫn được sử dụng cho đến hiện nay: “probiotic là những vi sinh vật phải sống, khi được bổ sung một lượng vừa đủ sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ” [3].

Thuật ngữ paraprobiotic được đề cập sau các nghiên cứu chỉ ra rằng các tế bào đã chết hoặc sau khi bị bất hoạt vẫn có tác động đáng kể đến sức khỏe con người. Tiền tố “para” (từ tiếng Hy Lạp cổ đại, παρά) đã được chọn vì nghĩa của nó là “cùng với” hoặc “không điển hình”. Paraprobiotic đã được mô tả như probiotic bất hoạt và probiotic không sống (chết) [4]. Paraprobiotic bao gồm các phân tử hợp chất thành tế bào vi khuẩn như peptidoglycan, axit lipoteichoic (LTA), polysaccharid và protein bề mặt tế bào, được sản xuất bằng nhiều kỹ thuật khác nhau như: xử lý nhiệt, áp suất cao, tia cực tím, siêu âm, bức xạ ion hóa hoặc điều chỉnh pH.

Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp/Tổ chức Y tế Thế giới (FAO/WHO), paraprobiotic được định nghĩa là các tế bào vi khuẩn nguyên vẹn đã bị bất hoạt (không còn khả năng sống), khi được quản lý với số lượng đủ sẽ mang lại lợi ích cho người tiêu dùng [5]. Tổng quan các phương pháp bất hoạt vi khuẩn tạo paraprobiotic Paraprobiotic có thể được tìm thấy trong các công thức probiotic ở nồng độ từ 1×105 đến 1×1014 vi sinh vật trên một đơn vị liều (mL, gam, viên nén hoặc nang) [6]. Paraprobiotic có thể được thu nhận từ probiotic bất hoạt thông qua nhiều phương pháp, bao gồm xử lý nhiệt [7], [8], áp suất cao [9], chiếu xạ [10], tia cực tím [11], trường điện xung, sấy khô, siêu âm [12] và thay đổi pH. Các phương pháp này ảnh hưởng đến màng tế bào, có khả năng dẫn đến sự tương tác thay đổi của các thành phần màng tế bào, làm biến tính và thay đổi cấu hình của protein.

Hơn nữa, phương pháp bất hoạt có thể tác động đến cấu trúc tế bào vi khuẩn, cho phép tương tác tiềm tàng của các thành phần có hoạt tính sinh học nội bào với các tế bào vật chủ khi sử dụng [4]. Đặc biệt, phương pháp xử lý nhiệt là quy trình được sử dụng rộng rãi nhất để sản xuất paraprobiotic ở cấp độ phòng thí nghiệm và công nghiệp vì khả năng vô hiệu hóa tế bào sinh dưỡng, bào tử vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Từng loại vi sinh vật có mức độ bất hoạt khác nhau tùy thuộc vào cường độ xử lý. Điều này là do khả năng chịu nhiệt của các nhóm vi sinh vật khác nhau, bắt nguồn từ sự khác biệt về cấu trúc, thành phần 2 tế bào và cơ chế kháng của chúng.

Công nghệ này đã được áp dụng và tối ưu hóa để bất hoạt vi khuẩn probiotic Lactobacillus acidophilus, Lacticaseibacillus casei và Bifidobacterium animalis [13]. Quá trình xử lý nhiệt chịu ảnh hưởng của nhiệt độ, môi trường nuôi cấy, giá trị pH, chế độ gia nhiệt, hoạt độ nước (Aw) và loại tế bào. Cơ chế bất hoạt bằng xử lý nhiệt là sự phá vỡ các sợi ADN, kết tụ ribosome, cạn kiệt chất dinh dưỡng và ion, tổn thương màng, đông tụ protein và bất hoạt enzym. Các điều kiện xử lý nhiệt thay đổi rất nhiều (60-90°C trong 5-30 phút) và phụ thuộc vào từng loại chủng [7].

Paraprobiotic chủ yếu được sử dụng dưới dạng tế bào vi khuẩn toàn phần đã bất hoạt hoàn toàn (thường bằng nhiệt), tức vẫn giữ cấu trúc nguyên vẹn nhưng không còn khả năng sống sót hay sinh trưởng [2]. Mô hình cấu trúc lớp vỏ của tế bào nguyên vẹn cụ thể được minh họa trong hình dưới đây: Hình 1. Cấu trúc bề mặt tế bào vi khuẩn Lactobacilli [14]. Sau khi bất hoạt, hiệu quả của phương pháp được đánh giá thông qua việc nuôi cấy đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch MRS.

Việc kiểm tra tính toàn vẹn và hoạt tính còn lại của paraprobiotic là cần thiết, bởi dù không còn khả năng sinh trưởng, tế bào sau bất hoạt vẫn có thể duy trì một phần hoạt động trao đổi chất, từ đó góp phần vào hiệu quả sinh học [2]. Chức năng và cơ chế tác dụng của paraprobiotic ❖ Chức năng: Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các sản phẩm chứa tế bào vi khuẩn đã bất hoạt vẫn có khả năng tạo ra các phản ứng sinh học có lợi. Các lợi ích sinh học của paraprobiotic chủ yếu được thể hiện qua sự tương tác giữa các thành phần cấu trúc tế bào hoặc sản phẩm chuyển hóa của vi khuẩn với các thụ thể miễn dịch của vật chủ. Những tương tác này có thể kích hoạt đáp ứng miễn dịch bẩm sinh, điều hòa quá trình viêm và góp phần bảo vệ niêm mạc.

Ngoài ra, khi đã bất hoạt, các thành phần “xác” vi 3 khuẩn vẫn có thể bám dính vào bề mặt niêm mạc ruột và cạnh tranh vị trí với vi khuẩn gây bệnh, từ đó góp phần duy trì cân bằng hệ vi sinh đường ruột [14], [15]. Đối với các chủng Lactobacillus – ngay cả khi đã bị bất hoạt – chúng vẫn có khả năng tạo phản ứng sinh học có lợi thông qua các thành phần mà chúng giải phóng. Cụ thể là các phân tử liên quan đến vi khuẩn (MAMPs – Microbe-Associated Molecular Patterns), bao gồm peptidoglycan, axit lipoteichoic (LTA), protein lớp S (SlpA), polysaccharid ngoại bào (EPS) và ADN hệ gen [14]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các MAMPs này khi gắn vào các thụ thể nhận diện mẫu (PRRs) như TLR2, TLR9 có thể kích hoạt các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và thích ứng, từ đó góp phần tăng cường miễn dịch, giảm phản ứng viêm, chống dị ứng và cải thiện hàng rào bảo vệ ruột.

Đặc biệt, các phân tử như SlpA và EPS còn cho thấy khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh, điều hòa hệ vi sinh vật ruột và có các tác dụng chống oxy hóa, chống dị ứng trong các mô hình thực nghiệm [16]. ❖ Cơ chế tác dụng: Một số cơ chế tác dụng của paraprobiotic đã được ghi nhận trong hình 1. Một số cơ chế tác dụng của paraprobiotic [15]. Mặc dù cơ chế chức năng của paraprobiotic chưa thực sự rõ ràng, một số nghiên cứu đã đưa ra các cơ chế hoạt động có thể có đối với các tác dụng có lợi của chúng cụ thể là: ▪ Paraprobiotic có hiệu quả trong việc điều chỉnh hệ thống miễn dịch tổng thể, kích thích đáp ứng miễn dịch tại chỗ và toàn thân sau khi nhiễm virus bằng cách tăng tỷ lệ tế bào điều hòa T CD4+ & CD25+ có tác dụng trong các bệnh lý về đường hô hấp [4], [17].

▪ Paraprobiotic cũng được chứng minh có khả năng điều hòa miễn dịch thông qua ảnh hưởng đến sự cân bằng giữa các tế bào Th1 và Th2. Cụ thể, chúng có thể thúc đẩy sản xuất các cytokin Th1 (như IFN-γ, IL-12), qua đó tăng cường miễn dịch tế bào, đồng thời ức chế các cytokin Th2 (như IL-4, IL-5), giúp giảm các phản ứng dị ứng hoặc viêm mạn tính [7], [18], [19], [20]. ▪ Ức chế sự xâm nhập và bám dính của vi khuẩn có hại trong ruột, cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột ứng dụng với các bệnh lý về đường tiêu hóa như: tiêu chảy, viêm ruột, viêm loét đại tràng [21], [22]. ▪ Ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư thông qua việc kích hoạt các thụ thể miễn dịch TLR, từ đó thúc đẩy hoạt động của tế bào NK và đại thực bào, cảm ứng sản xuất các cytokin chống ung thư như IFN-γ và IL-12.

Ngoài ra, một số thành phần của màng tế bào như peptidoglycan và LTA còn điều hòa quá trình apoptosis và ức chế vi môi trường viêm quanh khối u, góp phần ngăn chặn sự tăng sinh tế bào ác tính [23]. ▪ Ức chế enzym tổng hợp cholesterol, giảm hấp thu và thải trừ cholesterol do sự can thiệp vào quá trình tái chế muối mật. Paraprobiotic ức chế sự tái hấp thu axit mật tự do (dạng không hòa tan), dẫn đến tổng hợp axit mật từ cholesterol trong gan. Ngoài ra, thành tế bào của paraprobiotic có khả năng kết hợp cholesterol, gây ra sự cạn kiệt este cholesteryl từ các hạt LDL [24], [25].

▪ Làm chậm quá trình thoái hóa và lão hóa xương qua cơ chế ức chế sản xuất interleukin-6 (IL-6) và nitric oxid (NO) trong đại thực bào khi bị kích thích bởi lipopolysaccharid (LPS), từ đó làm giảm tình trạng viêm mạn tính liên quan đến hủy xương. Đồng thời, paraprobiotic còn góp phần tăng cường quá trình khoáng hóa canxi, hỗ trợ duy trì cấu trúc và mật độ xương [26], [27]. ▪ Điều hòa đáp ứng đau nội tạng do căng phồng bằng cách giảm hoạt động của đơn vị hạch rễ lưng (dorsal root ganglion – DRG), đơn vị dẫn truyền tín hiệu đau từ nội tạng lên hệ thần kinh trung ương [10]. Vi sinh vật sử dụng để tạo paraprobiotic Để sản xuất paraprobiotic, vi sinh vật trước hết cần đáp ứng những tiêu chuẩn của probiotic, cụ thể như sau [28]: ▪ Nguồn gốc rõ ràng, thuần chủng (chủng phải được lưu giữ tại ngân hàng giống quốc tế).

▪ Thuộc nhóm vi sinh vật an toàn (GRAS hoặc QPS), không gây bệnh, không sinh độc tố, không mang gen kháng kháng sinh có khả năng di truyền. ▪ Có đặc tính probiotic rõ ràng trước khi bất hoạt (đã được chứng minh có hoạt tính sinh học như điều hòa miễn dịch, kháng khuẩn, bảo vệ niêm mạc ruột…). ▪ Sau khi bất hoạt vẫn giữ được các cấu trúc tế bào quan trọng (như peptidoglycan, axit teichoic, protein bề mặt…) để đảm bảo hiệu quả sinh học. ▪ Ổn định trong quá trình xử lý (nhiệt, chiếu xạ, áp suất cao) và bảo quản, phù hợp với quy trình sản xuất công nghiệp.

▪ Dễ nuôi cấy, có khả năng tạo sinh khối cao để phục vụ sản xuất quy mô lớn. Một số vi sinh vật được báo cáo là nguyên liệu sử dụng để tạo paraprobiotic cụ thể gồm: Bảng 1. Tên các vi sinh vật dùng làm paraprobiotic [6], [29], [30] Chi Loài acidophilus, casei, gasseri, rhamnosus, reuteri, sporogenes, Lactobacillus spp. paracasei, plantarum, farciminis Bifidobacterium spp.

brev, bifidum, longum Bacillus spp. coagulans, clausii, subtilis Streptococus spp. thermophilus, intermedius Enterococus spp. faecium, mundtii Lactococus spp.

Xu hướng và tiềm năng mới của paraprobiotic Việc sử dụng men vi sinh đang tăng lên theo thời gian và ngày càng có nhiều chức năng mới được phát hiện.