Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Hemoglobin Hemoglobin là một tetramer gồm 4 chuỗi polypeptide (còn gọi là 4 chuỗi globin) gắn với 4 gốc heme, giúp hồng cầu thực hiện chức năng vận chuyển oxy. Mỗi phân tử hemoglobin bao gồm bốn tiểu đơn vị, mỗi tiểu đơn vị có một nhóm heme và một chuỗi globin [9]. Nhóm heme bao gồm một vòng porphyrin có chứa một nguyên tử sắt (Fe) ở trung tâm.
Thông thường, sắt ở trạng thái oxy hóa khử (+2) và có thể liên kết thuận nghịch với O2. Khi nguyên tử sắt trong nhóm heme bị oxy hóa (mất một electron), trạng thái hóa trị của nó thay đổi từ +2 thành +3. Khi đó, hemoglobin được gọi là methemoglobin (metHb), lượng hemoglobin ở dạng metHb được duy trì ở mức thấp, khoảng 1%, nhờ enzyme NADH- methemoglobin reductase. Có nhiều loại globin được chia làm hai họ α (alpha) và không α (non- alpha): - Các chuỗi thuộc họ α: α và ζ, mỗi chuỗi có 141 acid amin, có cấu trúc gần giống nhau.
- Các chuỗi thuộc họ không α: β, δ, γ và ε, mỗi chuỗi có 146 acid amin. Ở người có 6 loại hemoglobin bình thường thấy được trong hồng cầu qua các thời kỳ phát triển của một cá thể: - Thời kỳ phôi thai: Hb Gower 1 (ζ2ε2), Hb Gower 2 (α2ε2), và Hb Porland (ζ2γ 2). - Thời kỳ thai nhi đến trưởng thành: HbF (α2γ2), HbA2 (α2δ2) và HbA (α2β2). Một số bệnh hemoglobin Thời gian xuất hiện và thành phần từng loại hemoglobin thay đổi theo từng thời kỳ phát triển của cơ thể.
Ở thời kỳ thai nhi, hemoglobin chủ yếu là HbF. Ở người trưởng thành, HbA chiếm 96-98% lượng Hb. Còn HbA2 tăng dần sau khi sinh, chiếm lượng ít từ 1-3,2%. Thành phần các loại hemoglobin có một tỷ lệ giới hạn nhất định theo lứa tuổi, tỷ lệ này thay đổi là biểu hiện tình trạng bệnh lý hemoglobin [21].
Đột biến gen globin có thể gây giảm cả số lượng chuỗi globin lẫn thay đổi trật tự acid amin của chuỗi polypeptide. Giảm số lượng chuỗi dẫn đến thalassemia và thay đổi cấu trúc gọi là Hb biến thể. Dựa vào cấu trúc và sinh tổng hợp chuỗi polypeptide trong globin của Hb, phân loại bệnh Hb di truyền thành hai nhóm chính: - Hội chứng thalassemia: là nhóm bệnh Hb di truyền do thiếu hụt tổng hợp một hay nhiều chuỗi polypeptide trong globin của hemoglobin, không thay đổi cấu trúc chuỗi. - Hemoglobin bất thường: là một nhóm bệnh hemoglobin do rối loạn cấu trúc chuỗi polypeptide của globin, một hay nhiều acid amin trong chuỗi bị thay thế vị trí bằng acid amin khác.
- Ngoài hai nhóm chính trên, còn gặp bệnh hemoglobin phối hợp. Sự thay đổi thành phần hemoglobin thường gặp như: - Tăng HbF: tỷ lệ HbF ở người trưởng thành tăng trên 1% (0,4-1%). - Tăng HbA2: tỷ lệ HbA2 ở người trưởng thành tăng trên 3,2% (2-3,2%). - Giảm HbA: tỷ lệ HbA ở người trưởng thành giảm dưới 96% (96-98%).
Sự xuất hiện của các hemoglobin bất thường như: - HbH: là sự xuất hiện của 4 chuỗi β trong cấu trúc hemoglobin. - Hb Bart’s: là sự xuất hiện của 4 chuỗi γ trong cấu trúc hemoglobin. 5 - HbE: là một biến thể Hb quan trọng và phổ biến nhất trong cộng đồng người Đông Nam Á. Tại Việt Nam tỷ lệ HbE từ 0,95-55,9% tùy theo dân tộc.
HbE được tạo ra do sự thay thế acid glutamic bởi lysin ở vị trí thứ 26 của gen globin-β, bệnh HbE có thể gây thiếu máu hoặc không, hồng cầu nhỏ, nhược sắc hoặc bình thường. HbE thường gặp nhất ở khu vực Đông Nam Á và kết hợp với đột biến gen globin gây nên nhiều bệnh thalassemia kết hợp [9]. Ảnh hưởng của hemoglobin đến kết quả định lượng HbA1c Kết quả định lượng HbA1c là tỷ lệ phần trăm giữa HbA1c với tổng HbA và HbA1c. Có hai sự thay đổi làm ảnh hưởng đến kết quả định lượng HbA1c: thứ nhất là các yếu tố làm thay đổi gắn kết giữa glucose và hemoglobin, thứ hai là sự thay đổi nồng độ của HbA nói riêng và các loại Hb nói chung.
Sự hình thành HbA1c dựa vào sự kết hợp giữa glucose và hemoglobin, nên khi có bất thường về hemoglobin thì cũng ảnh hưởng tới sự đường hóa này. Một số bất thường liên quan đến nồng độ HbA1c cũng được ghi nhận trong bệnh thalassemia, bệnh hồng cầu hình liềm, tăng HbF, giảm HbA, giảm HbA2 hoặc các biến thể của hemoglobin như: HbH, Hb Bart’s, HbCS, HbE và một số biến thể khác [47]. Các phương pháp, thiết bị xét nghiệm không phát hiện ra bất thường của hemoglobin thì có thể đưa ra kết quả HbA1c giảm hoặc tăng giả tạo gây ảnh hưởng đến việc chẩn đoán cũng như điều trị đái tháo đường. Phương pháp định lượng HbA1c 1.
HbA1c HbA1c là một phức hợp được tạo thành khi phân tử glucose gắn với một hoặc cả hai N-valin-amin tận cùng của chuỗi -polypeptid của hemoglobin ở người trưởng thành bình thường (Hình 1. HbA1c thông thường chiếm 75- 80% lượng HbA1, tương đương với khoảng 4-6% tổng lượng hemoglobin trong cơ thể [13]. 6 Glucose + Hemoglobin Nhanh HbA1c α2(β-N-glucose)2 (không bền) Chậm HbA1c α2(β-N-glucose)2 (ổn định) Sản phẩm đường hóa bền Glucose Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys os Hình 1. Sự đường hóa hemoglobin (Nguồn: Diabetes care, 2011 [16]) Trong trường hợp tăng đường huyết mạn tính, tỷ lệ HbA1c trong cơ thể sẽ tăng cao hơn bình thường.
Do phản ứng đường hoá là phản ứng không đảo ngược nên HbA1c sẽ tồn tại trong suốt đời sống hồng cầu (khoảng 120 ngày), vì vậy xét nghiệm tỷ lệ HbA1c sẽ giúp phản ánh mức đường huyết trung bình trong vòng khoảng 8-12 tuần trước thời điểm xét nghiệm [45]. Nghiên cứu của một tác giả đã công bố cho thấy 50% giá trị HbA1c phụ thuộc vào chỉ số glucose huyết thanh trong 1 tháng trước thời điểm xét nghiệm, 25% phụ thuộc vào mức đường huyết 2 tháng trước đó và 25% còn lại dựa vào mức đường huyết của 3-4 tháng trước đó. Hiện nay trên thế giới, xét nghiệm HbA1c được khuyến cáo báo cáo kết quả theo một trong 2 dạng đơn vị: đơn vị phần trăm (%) theo Chương trình Quốc gia về chuẩn hóa Glycohemoglobin (NGSP-National Glycohemoglobin Standardization Program) hoặc đơn vị mmol/mol theo Liên đoàn Hoá học và Xét nghiệm lâm sàng Quốc tế (International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine-IFCC). Hai đơn vị của HbA1c có thể quy đổi lẫn nhau bằng công thức [46]: NGSP (%) = [0,0915 x IFCC (mmol/mol)] + 2,15 IFCC (mmol/mol) = [10,93 x NGSP (%)] - 23,50 7 1.
Vai trò của HbA1c trong chẩn đoán đái tháo đường HbA1c là một xét nghiệm quan trọng để tầm soát, chẩn đoán xác định và theo dõi hiệu quả điều trị đái tháo đường. Được đưa vào sử dụng trong thực hành lâm sàng điều trị đái tháo đường từ những năm 1980 [48], tuy nhiên đến năm 2011, HbA1c mới được ADA [16] và sau đó là WHO [48] đồng thuận lựa chọn trở thành 1 trong các tiêu chuẩn chẩn đoán đái tháo đường với điểm cut- off ≥6,5%. Ngưỡng HbA1c 6,5% được lựa chọn dựa trên phân tích của tác giả Colagiuri trên khoảng 28000 bệnh nhân cho thấy, bắt đầu từ giá trị HbA1c >6,5%, tỷ lệ biến chứng võng mạc mức độ trung bình liên quan tăng lên đáng kể so với tỷ lệ mắc của dân số chung [44]. Cần lưu ý theo ADA, HbA1c phải được xét nghiệm bằng phương pháp được chứng nhận và chuẩn hoá bởi NGSP theo phương pháp xét nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu DCCT (Diabetes Control and Complications Trial) [17].
So với xét nghiệm glucose huyết tương khi đói hay nghiệm pháp dung nạp glucose, tiêu chuẩn HbA1c sử dụng để chẩn đoán đái tháo đường có một số ưu điểm bao gồm: thuận tiện hơn cho lấy mẫu xét nghiệm (không yêu cầu bệnh nhân nhịn đói), kết quả ít bị ảnh hưởng bởi tình trạng tăng glucose đột ngột do stress hoặc tình trạng bệnh lý cấp tính của bệnh nhân, mẫu xét nghiệm ổn định hơn ở nhiệt độ phòng. HbA1c cũng được sử dụng để theo dõi và đánh giá mức độ kiểm soát glucose máu của bệnh nhân đái tháo đường theo thời gian do đây là chỉ số có mối tương quan với các nguy cơ biến chứng dài hạn của đái tháo đường. Thử nghiệm lâm sàng thực hiện tại 23 trung tâm tại Anh với dân số nghiên cứu 5102 bệnh nhân đái tháo đường típ 2 mới mắc cho thấy cứ mỗi 1% giá trị HbA1c giảm được sẽ giúp giảm 25% nguy cơ tử vong liên quan đái tháo đường, 7% nguy cơ tử vong do mọi nguyên nhân, 35% nguy cơ biến chứng mạch máu nhỏ, cũng như 18% nguy cơ nhồi máu cơ tim [17]. 8 Theo quyết định số 5481/QĐ-BYT ngày 30/12/2020 của Bộ Y tế về việc ban hành tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đái tháo đường típ 2”, thì HbA1c là một trong số tiêu chuẩn có giá trị kết luận và phân loại mức đái tháo đường, cụ thể trong bảng 1.
Phân mức đái tháo đường theo kết quả xét nghiệm (Nguồn: Bộ y tế, 2020 [2]) Xét nghiệm Bình thường Tiền đái tháo đường Đái tháo đường Glucose <100 mg/dL, 100-125mg/dL ≥126 mg/dL lúc đói <5,6 mmol/L hay 5,6-6,9mmol/L hay 7 mmol/L Nghiệm pháp <140 mg/dL, 140 -199mg/dL ≥200 mg/dL dung nạp (2g) <7,8 mmol/L 7,8-11mmol/L hay 11,1 mmol/L <5,7 %, 5,7-6,4% ≥6,5% HbA1c <39 mmol/mol 39-47mmol/mol hay 48 mmol/mol <140 mg/dL ≥200 mg/dL Ngẫu nhiên Chưa đủ tiêu chuẩn 7,8 mmol/L hay 11,1 mmol/L HbA1c được khuyến cáo kiểm tra lại sau 1-3 năm đối với người khỏe mạnh, với các bệnh nhân đái tháo đường cần điều trị và xét nghiệm theo dõi theo phác đồ, ADA-2018 khuyến cáo nên tiến hành định lượng HbA1c hàng quý (4 lần/năm) [17]. Các phương pháp định lượng HbA1c Hiện nay, có nhiều phương pháp định lượng HbA1c, dựa trên hai nguyên lý chính là khác nhau về điện tích và khác nhau về cấu trúc của hemoglobin; với năm phương pháp thường được sử dụng gồm: phương pháp miễn dịch (Immunoassays), phương pháp enzyme (Enzymatic Asays), sắc ký ái lực Boronat (Boronat Affinity Chromatography), sắc ký lỏng áp lực cao trao đổi ion (ion exchange High Performance Liquid Chromatography) và điện di mao quản (Capillary Electrophoresis) [47]. Phương pháp enzyme trong định lượng HbA1c A VAL HIS LEU THR PRO GLU GLU LYS Ly giải protein B LEU VAL GLU LYS HIS GLU THR PRO Tách đường C VAL H2O2 Màu H2O2 Glucose Amino acid Hydro peroxid Hình 1. Nguyên lý định lượng HbA1c bằng phương pháp enzyme (Nguồn: American journal of clinical pathology, 2014 [35]) Mẫu máu phân tích ban đầu được xử lý bằng các chất oxy hoá để tạo thành Met-hemoglobin (Met-Hb).
Tiến hành đo mật độ quang để xác định tổng lượng hemoglobin. Sau đó enzym fructosyl peptide protease được thêm vào để tách ra sản phẩm fructosyl dipeptide ở đầu N tận cùng trên chuỗi β của HbA1c. Sản phẩm này là cơ chất đặc hiệu của enzym fructosyl peptide oxidase (FPOX), và sẽ phản ứng với enzym FPOX được thêm vào để tạo thành hydrogen peroxide.