Sàng lọc và nuôi cấy nấm sợi sinh Laccase ứng dụng loại màu thuốc nhuộm

Tài liệu nghiên cứu Sàng lọc tuyển chọn và nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy thích hợp của chủng nấm sợi có khả năng, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Đề tài: Sàng Lọc Tuyển Chọn Và Nghiên Cứu Một Số Điều Kiện Nuôi Cấy Thích Hợp Của Chủng Nấm Sợi Có Khả Năng Sinh Tổng Hợp Laccse Với Tiềm Năng Ứng Dụng Loại Màu Thuốc Nhuộm

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về laccase
• 1.2. Cấu trúc phân tử của laccase
• 1.3. Cơ chế xúc tác của laccase
• 1.4. Tính chất hóa sinh của enzyme laccase
• 1.5. Sự phân bố và khả năng sinh laccase của một số vi sinh vật
• 1.6. Ứng dụng của laccase
• 1.7. TỔNG QUAN VỀ NẤM SỢI
• 1.7.1. Khả năng sinh laccase của nấm sợi
• 1.8. Khái niệm thuốc nhuộm
• 1.9. Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và tác hại ô nhiễm của nó
• 1.9.1. Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm do thuốc nhuộm
• 1.9.2. Tác hại của ô nhiễm
• 1.10. Khả năng xử lý thuốc nhuộm bằng phương pháp sinh học
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất và môi trường nuôi cấy
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Sàng lọc các chủng nấm có khả năng sinh laccase
• 2.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính laccase
• 2.3.3. Định danh chủng nấm
• 2.3.3.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống
• 2.3.3.2. Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS (ITS1 - 5.8S - ITS2)
• 2.3.4. Nghiên cứu chọn lọc môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh laccase của chủng nấm đại diện
• 2.3.4.1. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy
• 2.3.4.2. Ảnh hưởng của chất cảm ứng
• 2.3.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng CuSO4
• 2.3.4.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon
• 2.3.4.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ
• 2.3.5. Đánh giá khả năng loại màu của dịch enzyme thô của chủng nấm được chọn
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. SÀNG LỌC CÁC CHỦNG NẤM CÓ KHẢ NĂNG SINH LACCASE
• 3.2. PHÂN LOẠI CHỦNG FAXS1
• 3.2.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống
• 3.2.2. Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS (ITS1 - 5.8S - ITS2)
• 3.3. CHỌN LỌC MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
• 3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh laccase
• 3.3.2. Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh laccase
• 3.3.3. Ảnh hưởng của chất cảm ứng lên khả năng sinh laccase
• 3.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng CuSO4 lên khả năng sinh laccase
• 3.3.5. Ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh laccase
• 3.3.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ lên khả năng sinh laccase
• 3.4. KHẢ NĂNG LOẠI MÀU CỦA DỊCH ENZYME THÔ TỪ CHỦNG NẤM MYROTHECIUM SP.
• 3.4.1. Khả năng loại màu nhóm anthraquinone của dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết
• 3.4.2. Khả năng loại màu trong nhóm màu azo của dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết
• 3.4.3. Khả năng loại màu thương mại của dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHÁO

Tóm tắt

I. Khám phá Enzyme Laccase Giải pháp sinh học khử màu nhuộm

Enzyme laccase (EC 1.10.3.2) là một loại enzyme oxy hóa khử đa đồng, có khả năng xúc tác quá trình oxy hóa nhiều hợp chất hữu cơ và vô cơ khác nhau, đặc biệt là các hợp chất phenolic. Cơ chế hoạt động của laccase dựa trên việc sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử cuối cùng, biến đổi cơ chất thành các gốc tự do, sau đó tiếp tục tham gia vào các phản ứng polymer hóa hoặc phân cắt mạch. Chính nhờ phổ cơ chất rộng và cơ chế độc đáo này, enzyme laccase đã trở thành một công cụ đầy hứa hẹn trong lĩnh vực công nghệ sinh học môi trường. Các nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng to lớn của laccase trong việc xử lý nước thải dệt nhuộm, phân hủy lignin trong công nghiệp giấy và bột giấy, và khử độc các hợp chất gây ô nhiễm. Nguồn cung cấp laccase rất đa dạng, từ thực vật, vi khuẩn đến côn trùng, nhưng nấm sợi sinh laccase được xem là nguồn tiềm năng nhất do khả năng sản xuất enzyme ngoại bào với hiệu suất cao. Các chủng nấm như Trametes versicolor, Aspergillus niger, và Phanerochaete chrysosporium đã được nghiên cứu rộng rãi. Tuy nhiên, việc tìm kiếm các chủng nấm mới với hoạt tính cao và khả năng thích ứng tốt với điều kiện công nghiệp vẫn là một hướng đi cấp thiết, mở ra cơ hội cho các giải pháp phân hủy sinh học hiệu quả và bền vững.

1.1. Tổng quan về enzyme laccase và cơ chế hoạt động

Laccase thuộc nhóm enzyme oxy hóa khử, chứa bốn ion đồng (Cu) trong trung tâm hoạt động, được phân thành ba loại: T1, T2, và T3. Trung tâm T1 là nơi diễn ra quá trình oxy hóa cơ chất, trong khi cụm T2/T3 liên kết và khử oxy phân tử thành nước. Cơ chế xúc tác này cho phép laccase oxy hóa một loạt các hợp chất, từ diphenol, polyphenol, amin thơm đến các hợp chất khó phân hủy như thuốc nhuộm. Đặc biệt, khi kết hợp với các chất trung gian hóa học (mediator) như ABTS hay HOBT, laccase có thể gián tiếp oxy hóa cả những cơ chất không phải phenolic, mở rộng đáng kể phạm vi ứng dụng của nó trong bioremediation.

1.2. Nấm sợi sinh laccase Nguồn cung cấp enzyme dồi dào

Nấm sợi là nguồn cung cấp enzyme laccase dồi dào và hiệu quả nhất trong tự nhiên. Các loài nấm mục trắng (white-rot fungi) như Trametes versicolor và Pleurotus ostreatus nổi tiếng với khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào mạnh mẽ để phân hủy lignin. Ngoài ra, các chi nấm sợi khác như Aspergillus, Trichoderma, và Myrothecium cũng đã được chứng minh là có khả năng sản sinh laccase với hoạt tính đáng kể. Việc phân lập chủng vi sinh vật từ các môi trường tự nhiên, đặc biệt là các khu vực có vật liệu lignocellulose phân hủy, là chiến lược quan trọng để tìm ra các chủng nấm mới có tiềm năng công nghiệp.

II. Báo động ô nhiễm từ thuốc nhuộm và nước thải dệt nhuộm

Ngành công nghiệp dệt nhuộm thải ra một lượng lớn nước thải chứa thuốc nhuộm tổng hợp, gây ra những vấn đề môi trường nghiêm trọng. Các hợp chất màu này, đặc biệt là thuốc nhuộm azo, có cấu trúc phân tử phức tạp và bền vững, khiến chúng khó bị phân hủy trong môi trường tự nhiên. Sự hiện diện của thuốc nhuộm trong nguồn nước không chỉ làm mất mỹ quan mà còn làm giảm khả năng xuyên thấu của ánh sáng, ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình quang hợp của hệ thủy sinh. Nghiêm trọng hơn, nhiều loại thuốc nhuộm và các sản phẩm phân hủy thứ cấp của chúng có độc tính cao, có khả năng gây đột biến và ung thư. Việc xử lý nước thải dệt nhuộm bằng các phương pháp truyền thống như keo tụ, hấp phụ, hay oxy hóa hóa học thường tốn kém, hiệu quả không cao và có thể tạo ra các sản phẩm phụ độc hại. Do đó, việc tìm kiếm một phương pháp xử lý màu bằng phương pháp sinh học đang trở thành ưu tiên hàng đầu, hứa hẹn một giải pháp thân thiện với môi trường, chi phí thấp và hiệu quả bền vững để giải quyết thách thức ô nhiễm này.

2.1. Tác hại của thuốc nhuộm azo đối với môi trường sống

Thuốc nhuộm azo là nhóm thuốc nhuộm lớn nhất, chiếm khoảng 60-70% tổng lượng thuốc nhuộm tổng hợp. Cấu trúc của chúng chứa một hoặc nhiều liên kết azo (-N=N-), vốn rất bền với ánh sáng và các tác nhân oxy hóa. Khi bị phân hủy trong điều kiện kỵ khí, liên kết azo có thể bị phá vỡ, giải phóng ra các amin thơm, nhiều trong số đó đã được chứng minh là chất gây ung thư. Tác động của chúng không chỉ giới hạn ở độc tính mà còn ảnh hưởng đến cân bằng sinh thái của các hệ sinh thái nước, đặt ra yêu cầu cấp thiết về các biện pháp khử màu thuốc nhuộm hiệu quả.

2.2. Hạn chế của các phương pháp xử lý màu hóa lý truyền thống

Các phương pháp hóa lý như hấp phụ bằng than hoạt tính, keo tụ - tạo bông, hay lọc màng chỉ chuyển pha chất ô nhiễm từ dạng lỏng sang dạng rắn (bùn thải) chứ không phân hủy hoàn toàn chúng. Quá trình này tạo ra một lượng lớn bùn thải độc hại cần được xử lý tiếp. Các phương pháp oxy hóa hóa học bậc cao tuy hiệu quả nhưng đòi hỏi chi phí vận hành cao và sử dụng các hóa chất mạnh, có thể tạo ra các sản phẩm phụ không mong muốn. Những hạn chế này thúc đẩy sự phát triển của công nghệ sinh học môi trường như một giải pháp thay thế ưu việt.

III. Phương pháp sàng lọc nấm sợi sinh laccase hiệu quả cao

Để tìm ra các chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất laccase vượt trội, quá trình sàng lọc và tuyển chọn đóng vai trò then chốt. Nghiên cứu của Nguyễn Hoài Thu (2015) đã tiến hành sàng lọc các chủng nấm sợi được phân lập từ Vườn Quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ) và tỉnh Bình Định. Quy trình bắt đầu bằng việc nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) có bổ sung guaiacol, một chất chỉ thị màu. Các chủng có khả năng oxy hóa guaiacol sẽ tạo ra một vòng màu nâu đỏ xung quanh khuẩn lạc, cho thấy sự hiện diện của enzyme laccase. Từ kết quả sàng lọc sơ bộ, các chủng tiềm năng được tiếp tục nuôi cấy trong môi trường lỏng để định lượng hoạt tính laccase. Chủng FAXS1 đã thể hiện hoạt tính cao nhất, đạt 12.689 U/l sau 8 ngày, vượt xa các chủng còn lại. Chủng này sau đó được định danh bằng cả phương pháp hình thái truyền thống và sinh học phân tử, xác định là thuộc chi Myrothecium, đặt tên là Myrothecium sp. FAXS1. Quá trình sàng lọc kỹ lưỡng này là bước nền tảng để xác định được một ứng viên sáng giá cho các nghiên cứu tối ưu hóa và ứng dụng sau này.

3.1. Quy trình phân lập chủng vi sinh vật từ tự nhiên

Quá trình sàng lọc bắt đầu với việc phân lập chủng vi sinh vật từ các mẫu đất và lá mục. Các chủng này được nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa chứa chất chỉ thị màu. Những khuẩn lạc tạo ra vòng oxy hóa rõ rệt được xem là có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase. Trong số 6 chủng được khảo sát, 5 chủng cho kết quả dương tính, trong đó chủng FAXS1 cho thấy tiềm năng vượt trội nhất. Đây là bước đầu tiên nhưng quan trọng nhất trong việc khám phá các nguồn enzyme mới.

3.2. Định danh chủng nấm Myrothecium sp. FAXS1 tiềm năng

Sau khi được lựa chọn, chủng FAXS1 được định danh dựa trên đặc điểm hình thái khuẩn lạc, sợi nấm, bào tử và so sánh trình tự vùng gen ITS (Internal Transcribed Spacer). Kết quả phân tích trình tự cho thấy chủng FAXS1 có độ tương đồng 99% với chủng Myrothecium roridum. Việc xác định chính xác danh tính của chủng nấm là cơ sở khoa học vững chắc cho các nghiên cứu sâu hơn về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy và khai thác tiềm năng ứng dụng của nó.

IV. Bí quyết tối ưu hóa môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp laccase

Sau khi sàng lọc được chủng Myrothecium sp. FAXS1, việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy là bước tiếp theo để tối đa hóa hiệu suất sinh tổng hợp enzyme. Nhiều yếu tố đã được khảo sát, bao gồm thành phần môi trường, pH, chất cảm ứng, và nguồn carbon và nito. Nghiên cứu cho thấy môi trường TSHj là thích hợp nhất, giúp chủng nấm đạt hoạt tính laccase cao. Về pH, chủng FAXS1 hoạt động tối ưu trong môi trường hơi kiềm, với pH 8. Một trong những phát hiện quan trọng nhất là vai trò của chất cảm ứng. Khi bổ sung ion đồng (CuSO4) vào môi trường nuôi cấy, hoạt tính laccase tăng vọt. Nồng độ CuSO4 tối ưu được xác định là 2mM. Bên cạnh đó, nguồn carbon và nito cũng ảnh hưởng lớn. Lactose được xác định là nguồn carbon tốt nhất, trong khi KNO3 là nguồn nito vô cơ hiệu quả nhất, giúp hoạt tính enzyme đạt mức kỷ lục 60.527 U/l. Những kết quả này cung cấp một công thức nuôi cấy tối ưu, giúp khai thác tối đa tiềm năng sản xuất laccase từ chủng Myrothecium mới này.

4.1. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nito đến hoạt tính laccase

Việc lựa chọn nguồn carbon và nito phù hợp là yếu tố quyết định đến hiệu suất sản xuất enzyme. Thí nghiệm thay thế glucose bằng các loại đường khác như lactose, saccharose, xylose cho thấy lactose là nguồn carbon hiệu quả nhất để chủng Myrothecium sp. FAXS1 sản sinh laccase, đạt 35.987 U/l. Đối với nguồn nito, KNO3 tỏ ra vượt trội so với các muối amoni khác, cho thấy chủng nấm này có cơ chế chuyển hóa nitrat hiệu quả để sinh tổng hợp enzyme.

4.2. Tác động của pH và chất cảm ứng CuSO4 đến enzyme

pH và chất cảm ứng là hai yếu tố điều khiển quan trọng. Chủng FAXS1 thể hiện khả năng thích ứng tốt với dải pH rộng nhưng hoạt động mạnh nhất ở pH 8. Đặc biệt, việc bổ sung CuSO4 ở nồng độ 2mM đã có tác dụng cảm ứng mạnh mẽ, làm tăng đáng kể hoạt tính laccase. Ion Cu2+ được cho là thành phần cấu trúc của trung tâm hoạt động laccase và cũng có thể đóng vai trò như một tín hiệu điều hòa biểu hiện gen mã hóa cho enzyme này, một chiến lược tối ưu hóa môi trường nuôi cấy hiệu quả.

V. Đánh giá khả năng khử màu thuốc nhuộm của enzyme laccase

Mục tiêu cuối cùng của nghiên cứu là đánh giá tiềm năng ứng dụng thực tiễn của dịch enzyme laccase thô từ chủng Myrothecium sp. FAXS1 trong việc khử màu thuốc nhuộm. Các thí nghiệm được tiến hành trên nhiều loại thuốc nhuộm khác nhau, bao gồm nhóm anthraquinone (NY5, RBBR) và nhóm azo (NY1, NY7). Kết quả cho thấy dịch enzyme laccase có khả năng loại màu hiệu quả, tuy nhiên hiệu suất phụ thuộc vào cấu trúc của từng loại thuốc nhuộm. Đáng chú ý, hiệu quả phân hủy sinh học tăng lên đáng kể khi có sự tham gia của các chất gắn kết (mediator) như VIO và HOBT. Các chất này hoạt động như những con thoi vận chuyển điện tử, giúp laccase có thể oxy hóa gián tiếp các phân tử thuốc nhuộm cồng kềnh. Ví dụ, chất gắn kết VIO đã làm tăng hiệu suất loại màu NY5 lên 51% sau 24 giờ. Những kết quả này khẳng định mạnh mẽ rằng xử lý màu bằng phương pháp sinh học sử dụng laccase từ nấm sợi là một giải pháp khả thi và đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp dệt nhuộm.

5.1. Hiệu quả xử lý màu bằng phương pháp sinh học bioremediation

Khả năng loại màu của dịch enzyme thô được đánh giá trên các thuốc nhuộm có cấu trúc hóa học khác nhau. Đối với nhóm anthraquinone, hiệu suất loại màu NY5 là 45% và có thể tăng lên 51% với chất gắn kết VIO. Trong khi đó, màu RBBR gần như không bị phân hủy nếu không có chất gắn kết, nhưng hiệu suất đạt 35% khi có mặt Acetosyringone (Ace). Điều này cho thấy tính đặc hiệu của enzyme và vai trò quan trọng của hệ thống laccase-mediator trong ứng dụng bioremediation.

5.2. Vai trò của chất gắn kết trong việc tăng hiệu suất phân hủy

Chất gắn kết (mediator) là các phân tử nhỏ, có khả năng bị oxy hóa bởi laccase để tạo thành các gốc tự do có hoạt tính cao. Các gốc tự do này sau đó sẽ oxy hóa các phân tử thuốc nhuộm lớn mà không thể tiếp cận trực tiếp trung tâm hoạt động của enzyme. Thí nghiệm đã chứng minh rõ vai trò này: các chất như VIO, HOBT, Ace và Syr đã cải thiện đáng kể hiệu quả khử màu thuốc nhuộm, đặc biệt là với các màu thuộc nhóm anthraquinone. Việc lựa chọn chất gắn kết phù hợp là chìa khóa để tối ưu hóa quá trình xử lý nước thải dệt nhuộm.

VI. Tiềm năng ứng dụng laccase trong công nghệ sinh học môi trường

Nghiên cứu về sàng lọc, tối ưu hóa và ứng dụng chủng nấm sợi sinh laccase Myrothecium sp. FAXS1 đã mở ra một hướng đi mới đầy triển vọng. Kết quả không chỉ xác định được một chủng nấm mới có khả năng sản xuất enzyme với hoạt tính cực cao mà còn xây dựng được một quy trình nuôi cấy vi sinh vật tối ưu. Khả năng khử màu thuốc nhuộm hiệu quả, đặc biệt là các thuốc nhuộm azo và anthraquinone, cho thấy tiềm năng ứng dụng trực tiếp trong việc xử lý nước thải dệt nhuộm. Hướng phát triển trong tương lai có thể tập trung vào việc cố định enzyme để tái sử dụng nhiều lần, cải tiến chủng nấm bằng kỹ thuật di truyền để tăng cường hơn nữa hiệu suất sản xuất, và mở rộng thử nghiệm trên quy mô pilot. Với những ưu điểm như thân thiện với môi trường, chi phí thấp và hiệu quả cao, enzyme laccase hứa hẹn sẽ trở thành một công cụ quan trọng trong ngành công nghệ sinh học môi trường, góp phần giải quyết các vấn đề ô nhiễm dai dẳng hiện nay.

6.1. Tổng kết kết quả nghiên cứu và ý nghĩa khoa học

Công trình đã sàng lọc và định danh thành công chủng nấm sợi Myrothecium sp. FAXS1 có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase với hoạt tính rất cao (đạt 60.527 U/l). Nghiên cứu đã xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu về môi trường, pH, chất cảm ứng, nguồn C/N. Hơn nữa, nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng ứng dụng của enzyme trong phân hủy sinh học thuốc nhuộm. Đây là những đóng góp khoa học quan trọng, cung cấp một chủng vi sinh vật và quy trình công nghệ tiềm năng.

6.2. Hướng phát triển tương lai cho enzyme xử lý ô nhiễm

Tương lai của việc ứng dụng laccase nằm ở việc tối ưu hóa quy trình ở quy mô công nghiệp. Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc giảm giá thành sản xuất enzyme, ví dụ như sử dụng các phế phẩm nông nghiệp làm môi trường nuôi cấy chìm (submerged fermentation). Kỹ thuật cố định enzyme trên các vật liệu mang cũng cần được phát triển để tăng tính ổn định và khả năng tái sử dụng. Cuối cùng, việc kết hợp laccase với các phương pháp xử lý khác có thể tạo ra một hệ thống tích hợp, nâng cao toàn diện hiệu quả xử lý màu bằng phương pháp sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

SVTH: Nguyen Hoài Thu VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HẢ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đê tài: Thư viện • Viện ■ Đại • học Mở Hà Nội SÀNG LỌC, TUYÊN CHỌN VÀ NGHIÊN cứu MỘT SỐ ĐIÈU KIỆN NUÔI CÁY THÍCH HỢP CỦA CHỦNG NÁM SỢI CÓ KHÁ NĂNG SINH TÓNG HỢP LACCSE VỚI TIÈM NÀNG ỨNG DỤNG LOẠI MÀU THUÓC NHUỘM Người hướng dẫn:TS. Đinh Thị Thu Hằng Sinh viên thực /ỉ/ện.-Nguyền Hoài Thu Lớp: 11-04 Hà Nội - 2015 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyen Hoài Thu Lời Cảm ơn ! Trước hết, tôi xin bày tó sự biết ơn chân thành và sâu sac tới PGS. Đặng Thị Cấm Hà, TS. Dinh Thị Thu Hang đã tận tình chi bảo, quan tâm hướng dan và dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, giúp tôi có thêm nhiều kiên thức và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học.

Tôi cũng xin giá lời cảm ơn tớiKS. Trần Thị Thu Hiển, Th.s Đào Thị Ngọc Ánh, Th.s Ngô Thị Huyền Trang, KS. Nguyễn Hái Vân, KS. Hoàng Thị Nhung, CN.

Nguyễn Văn Huynh và các anh chị trong phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cồng nghệ Việt Nam đã quan tâm, giúp đỡ và dạy bảo tận tình cho tôi trong quá trình làm khóa luận tot nghiệp. Tôi cũng xin bày tò lòng biết an đối với thầy cộ trong Khoa Công Nghệ Sinh Học- Viện Đại học Mớ Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và thực hiện khóa luận này. Bên cạnh đó, tôi xin cảm on bo mẹ và những người thân yêu nhát đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cà về vật chát và tinh than đê tôi có thê hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2015 Nguyễn Hoài Thu Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyen Hoài Thu MỤC LỤC LỜI CẢM ON MỤC LỰC DANH MỤC CÁC CHỦ VIÉT TẤT DANH MỤC CÁC BÁNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐÀU.

TÔNG QUAN TÀI LIỆU.1 Giới thiệu về laccase.2 Cấu trúc phân tử của laccase.3 Cơ chế xúc tác cùa laccase.Vien Đai hoc Mở Hà Nội 1.4 Tính chât hóa sinh cua enzyme laccase.5 Sự phân bố và khã năng sinh laccase của một số vsv.6 ưng dụng cùa laccase.2 TÓNG QUAN VÊ NẤM SỢI.2 Khả năng sinh laccase cùa nấm sợi.1 Khái niệm thuốc nhuộm.2 Ô nhiễm nước thái dệt nhuộm và tác hại ô nhiễm của nó.1 Ô nhiễm nước thài dệt nhuộm do thuốc nhuộm.2 Tác hại của ô nhiễm.3 Khá năng xử lý thuốc nhuộm bằng phương pháp sinh học. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu. 18 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyền Hoài Thu 2.1 Đối tượng nghiên cứu.2 Hóa chất và môi trường nuôi cấy.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ.1 Sàng lọc các chùng nấm có khả năng sinh laccase.2 Phương pháp xác định hoạt tính laccase.3 Định danh chúng nấm.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống.2 Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS (1TS1 -5.4 Nghiên cứu chọn lọc môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh laccase cùa chùng nấm đại diện.2 Ảnhhưởng của pH môi trường nuôi cấy.3 Anh hướng cúa chất cảm ứng.4 Anh hưởng cứa nồng độ chất câmứng C11SO4.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon.6 Ânh hường cùa nguồn nitơ vô cơ.5 Dánh giá khâ năng loại màu của dịch enzyme thô cùa chúng nấm được chọn 25 CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.1 SÀNG LỌC CÁC CHỦNG NÁM CÓ KHẢ NĂNG SINH LACCASE 27 3.2 PHÂN LOẠI CHỦNG FAXS1.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống.

28 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyền Hoài Thu 3.2 Phân loại bàng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS (ITS1 -5.3 CHỌN LỌC MÔI TRUÔNG VÀ ĐIÊU KIỆN NUÔI CÁY.1 Ảnh hưởng cùa môi trường nuôi cấy lên khá năng sinh laccase.2 Ảnh hưởng cùa pH lên khà năng sinh laccase.3 Anh hưởng của chất căm ứng lên khả năng sinh laccase.4 Anh hường cùa nồng độ chất cám ứng CuSO4lên khá năng sinh laccase.5 Anh hưởng cùa nguồn carbon lên khả năng sinh laccase.6 Anh hưởng của nguôn nitơ vô cơ lên khá nâng sinh laccase.4 KHẢ NĂNG LOẠI MÀU CỦA DỊCH ENZYME THÔ TỪ CHỦNG NÁM MYROTHECIVM SP.1 Khà năng loại màu nhóm anthraquinone của dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết.2 Khả tUn<x lồựí màu trông nhóm màu azo của dịch enzyme thô từ chùng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết.3 Khà năng loại màu thương mại của dịch enzyme thô từ chúng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gan kết.

KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ. 46 TÀI LIỆU THAM KHÁO. 48 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyen Hoài Thu DANH MỤC CÁC CHỦ VIẾT TẤT ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid Ace Acetosyringone bp Base pair CLS Dimaren Black CLS DDT Dichloro - Trichloroethane Diphenyl DNA Deoxyribonucleic acid Dig Đồng tác giả HCH Hexachlorocyclohexane HOBT Hydroxybenzotriazole ITS Internal transcribed spacer Lac Laccase LF-2B Everzol Red LiP Lignin peroxidase h?c Mở Hà Nội MnP NY1 Acid red 299 NY5 Acid red 266 NY7 Acid blue 281 PCR Polymerase Chain Reaction RBBR Remazol brilliant blue R Si Sinapic acid Syr Syringaldehyde TNT Trinitrotoluen VIO Violuric acid vsv Vi sinh vật Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyen Hoài Thu DANH MỤC CÁC BANG Báng 1. Một so vi sinh vật có khá năng sinh laccase.

Một số loại thuốc nhuộm đại diện. Danh sách các màu sứ dụng trong nghiên cứu. Thành phần môi trường nuôi cấy. Thành phần phân ứng xác định hoạt tính laccase.

Thành phần phản ứng. Chu trình nhiệt. Thành phần các chất trong phàn ứng loại màu. Hình thái khuấn lạc của 6 chủng nấm trên môi trường PDA chứa guaiacol.

Hoạt tính laccase của 6 chúng nam sau 8 ngày. 28 Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyen Hoài Thu DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Cấu trúc không gian 3 chiều cùa laccase. Trung tâm hoạt động của laccase.

Cơ chế xúc tác của laccase. Cơ chế xúc tác của laccase trong công nghiệp. Màu Orange II (nhóm màu azo) bị phân hủy dưới tác dụng cúa hydrogenase.Hình thái cùa chúng FAXSI dưới hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần. Điện di đồ sán phẩm PCR trình tự vùng ITS cùa chủng nấm FAXS1.

Cây phát sinh chúng loại cùa chúng nam sợi FASX1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh laccase của chúng Myrothecium sp. Anh hưởng của pH lên hoạt tính laccase chủng Myrothecium sp. Ảnh hường của một số chất cảm ứng lên hoạt tính laccase cúa chủng Myrothecium sp.

Ảnh hưởng cua nồrig độ GuSCXt lênììồầt tỉẤhlẩdcàse^cÌiủng Myrothecium sp. Ảnh hướng cùa nguồn carbon lên hoạt tính laccase chùng Myrothecium sp. Ánh hướng của nguồn nitơ lên hoạt tính laccase chúng Myrothecium sp. Khá năng loại màu thuốc nhuộm NY5 (A); RBBR (B) cùa dịch enzyme thô từ chúng Myrothecium sp.

FAXS1 khi có mặt các chất gan kết. Sự thay đối màu NY5 bởi laccase thô từ chùng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết. Sự thay đôi màu RBBR bời laccase thô từ chúng Myrothecium sp.

FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết. Khá năng loại màu thuốc nhuộm NY 1 (A), NY7 (B) cùa dịch enzyme thô từ chúng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết. Sự thay dối màu NY 1 bởi laccase thô từ chúng Myrothecium sp.

FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết. Sự thay đổi màu NY7 bởi lacase thô từ chùng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết. Khà năng loại màu CLS (A) và LF-2B (B) cùa dịch enzyme thô từ chúng Myrothecium sp.

FAXS1 khi có mặt các chất gan kết. 44 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyen Hoài Thu Hình 3. Sự thay đối màu CLS bởi dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết.

Sự thay đối màu LF-2B bởi dịch enzyme thô từ chùng Myrothecium sp. FAXS1 khi có mặt các chất gắn kết. 45 Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyen Hoài Thu MÓ ĐÀU Ngày nay, ô nhiễm môi trường, đặc biệt ô nhiễm môi trường nước ngày càng tăng và trờ nên nghiêm trọng. Ô nhiễm môi trường do tác động của thiên tai và các hoạt động của con người (sàn xuất công nghiệp, nông nghiệp, sinh hoạt, vui chơi V.

Trong đó, nước thải từ hoạt động công nghiệp có ánh hướng nhiều nhất đến môi trường nước do tính đa dạng và phức tạp. Một trong những ô nhiễm do sản xuất công nghiệp gây ra dược quan tâm hiện nay là ô nhiễm thuốc nhuộm. Việt Nam là một trong những nước có tình trạng ô nhiễm môi trường bời thuốc nhuộm đang trớ nên báo động,do đó cần phái thực hiện nghiêm ngặt các tiêu chuẩn đối với việc thải chất thải vào môi trường. Các phương pháp xử lý đang được áp dụng phố biến hiện nay như hấp phụ.

keo tụ-tạo bông kết hợp lọc, oxy hoá hoá học, phương pháp điện hoá v. thường không đạt hiệu quá cao. loại màu và phân hủy thuốc nhuốm bạng con đư^ng sinh học đang được quan tâm vì vừa mang lại hiệu quá kinh tế và đặc biệt rất thân thiện với môi trường. Trong đó, việc sừ dụng các enzyme ngoại bào do các vi sinh vật sinh ra để xừ lý, loại bỏ các chất ô nhiễm là một lựa chọncó tiềm năng ứng dung cao.

Các enzyme ngoại bào như laccase, maganese peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP) từ lâu đã được sứ dụng để xừ lý ô nhiễm môi trường. Trong đó, laccase là enzyme được nghiên cứu và sừ dụng nhiều nhất. Laccase xuất hiện nhiều ở các loại thực vật bậc cao và nấm, hoạt động ở dái pH tối thích rộng và có khá năng chịu nhiệt cao. Chúng có khả năng phân húy phenol và các dẫn xuất cùa phenol.

Ngoài ra, laccase còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như khứ độc và loại màu thuốc nhuộm do các ngành công nghiệp dệt nhuộm thái ra. xử lý nước thài, trong công nghiệp giây và thực phàm, mỹ phâm v. Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới về laccase, chủ yếu tập trung vào các chúng nấm đám vì chúng có khá năng sinh tông hợp enzyme ngoại bào cao. Các nghiên cứu tìm kiếm và khai thác enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoreductase và Khóa luận tốt nghiệp Trang I SVTH: Nguyền Hoài Thu peroxidase từ nam đàm dã đạt những bướe tiến rất lớn.

Đã có tới gần 100 loại enzyme laccase đã được xác định với trọng lượng phân tứ khác nhau với các tính chất khác nhau. Những năm gần đây, việc sãn xuất enzyme ngoại bào nói chung và laccase nói riêng từ nam sợi đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Tuy nhiên laccase từ nấm sợi được tìm thấy chưa nhiều.