Luận văn bioethanol production from sugarcane bagasse by separate hydrolysis and fermentation using yeast isolated from durian

Luận văn nghiên cứu sản xuất bioethanol từ bã mía qua quá trình thủy phân và lên men riêng biệt sử dụng men phân lập từ sầu riêng.

• Tác giả: Sangvone Souliya
• Người hướng dẫn: Ph. Nguyen Huu Tho
• Trường học: Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry
• Chuyên ngành: Environmental Science and Management
• Đề tài: Bioethanol production from Sugarcane Bagasse by Separate Hydrolysis and Fermentation using Yeast Isolated from Durian (Durio zhibetinus) Fruit
• Loại tài liệu: Bachelor thesis
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thai Nguyen

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGMENT
• TABLE OF CONTENT
• 1.1. List of Figure
• 1.2. List of Tables
• 1.3. List of Abbreviations
• 1.4. Research questions and hypotheses
• 1.5. Renewable energy or alternative energy
• 1.6. Processing of lignocellulosic to ethanol
• 1.7. Separate hydrolysis and fermentation
• 1.8. List of apparatus
• 1.9. List of reagents
• 1.10. Processing of lignocellulosics to bioethanol
• 1.11. Preparation of fermentation medium
• 1.12. Preparation of YPD agar medium
• 1.13. Preparation of YPD broth
• 2. RESULT AND DISCUSSION
• 2.1. Ethanol analysis curve
• 3. LIST OF FIGURES
• 3.1. Figure 1 Classification of biofuels
• 3.2. Figure 2 Framework of Ethanol Fermentation Process
• 3.3. Figure 3 Preparation of sample
• 3.4. Figure 4 A laboratory being used for the fermentation culture medium
• 3.5. Figure 5 Preparation of inoculum growth cell
• 3.6. Figure 6 Diagram of ethanol standard curve
• 3.7. Figure 7 Comparison ethanol analysis with different hydrolysis time
• 3.8. Figure 8 Standard curve (reducing glucose)
• 3.9. Figure 9 The curve of reducing sugar in three different hydrolysis time
• 4. LIST OF TABLES
• 4.1. Table 1 The difference hydrolysis time
• 4.2. Table 2 Absorbance of glucose analysis by DNS
• 4.3. Table 3 The correlation between the concentration of glucose at various levels and the value Absorbance derived from glucose analysis by DNS
• 4.4. Table 4 Analysis of ethanol on different incubation time
• 5. PART I. Research rationale
• 5.1. Lao PDR is an agricultural based country and it is the most important economic sector of Lao PDR
• 5.2. Energy guide
• 5.3. Renewable energy or alternative energy
• 5.4. Bioethanol
• 5.4.1. First generation
• 5.4.2. Second generation
• 5.4.3. Third generation

Tóm tắt

I. Giới thiệu về sản xuất bioethanol từ bã mía

Sản xuất bioethanol từ bã mía là một phương pháp tiên tiến trong lĩnh vực năng lượng tái tạo. Bã mía, một phế phẩm nông nghiệp phổ biến, được xem là nguyên liệu sinh học lý tưởng để sản xuất bioethanol. Quá trình này bao gồm các bước chính như thủy phân và lên men riêng biệt, sử dụng men vi sinh được phân lập từ sầu riêng. Phương pháp này không chỉ giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường mà còn góp phần vào việc phát triển năng lượng sinh học bền vững.

1.1. Tầm quan trọng của bioethanol

Bioethanol là một dạng năng lượng tái tạo có thể thay thế nhiên liệu hóa thạch. Việc sản xuất bioethanol từ bã mía không chỉ giúp giảm phụ thuộc vào nhiên liệu hóa thạch mà còn góp phần giảm thiểu khí thải nhà kính. Bioethanol có thể được sử dụng trong các động cơ xăng với tỷ lệ pha trộn khác nhau, từ 5% đến 85%, mang lại hiệu quả kinh tế và môi trường cao.

1.2. Nguyên liệu và quy trình sản xuất

Bã mía là nguyên liệu sinh học chính trong quá trình sản xuất bioethanol. Quy trình sản xuất bao gồm các bước: tiền xử lý, thủy phân, và lên men. Tiền xử lý bằng phương pháp vật lý giúp loại bỏ lignin, sau đó thủy phân với axit loãng để chuyển hóa cellulose thành đường. Cuối cùng, lên men sử dụng men từ sầu riêng để chuyển hóa đường thành bioethanol.

II. Phương pháp thủy phân và lên men riêng biệt

Phương pháp thủy phân và lên men riêng biệt (SHF) là một trong những công nghệ tiên tiến trong sản xuất bioethanol. Phương pháp này cho phép tối ưu hóa từng bước trong quy trình sản xuất, từ thủy phân cellulose thành đường đến lên men đường thành bioethanol. Sử dụng men từ sầu riêng trong quá trình lên men mang lại hiệu quả cao do khả năng chuyển hóa đường nhanh chóng và ổn định.

2.1. Quy trình thủy phân

Thủy phân là bước quan trọng trong quy trình sản xuất bioethanol. Trong nghiên cứu này, thủy phân được thực hiện với axit loãng 5% trong thời gian 30 phút. Kết quả cho thấy, thời gian thủy phân ảnh hưởng trực tiếp đến lượng đường được tạo ra, từ đó ảnh hưởng đến hiệu suất lên men.

2.2. Quy trình lên men

Lên men là bước cuối cùng trong quy trình sản xuất bioethanol. Men từ sầu riêng được sử dụng trong quá trình này cho thấy hiệu quả cao trong việc chuyển hóa đường thành bioethanol. Quá trình lên men được thực hiện trong 8 ngày với điều kiện pH 4, mang lại nồng độ bioethanol cao nhất là 0.041ml.

III. Ứng dụng và giá trị thực tiễn

Nghiên cứu về sản xuất bioethanol từ bã mía bằng phương pháp thủy phân và lên men riêng biệt sử dụng men từ sầu riêng mang lại nhiều giá trị thực tiễn. Bioethanol được sản xuất từ bã mía không chỉ là một nguồn năng lượng tái tạo mà còn góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tận dụng phế phẩm nông nghiệp. Phương pháp này cũng mở ra hướng đi mới trong việc phát triển công nghệ sinh học và năng lượng sinh học bền vững.

3.1. Giá trị kinh tế

Sản xuất bioethanol từ bã mía mang lại giá trị kinh tế cao do chi phí nguyên liệu thấp và quy trình sản xuất đơn giản. Việc tận dụng bã mía, một phế phẩm nông nghiệp, giúp giảm chi phí sản xuất và tăng hiệu quả kinh tế. Bioethanol có thể được sử dụng trong nhiều lĩnh vực, từ nhiên liệu đến công nghiệp hóa chất.

3.2. Giá trị môi trường

Bioethanol là một dạng năng lượng tái tạo thân thiện với môi trường. Việc sản xuất bioethanol từ bã mía giúp giảm thiểu khí thải nhà kính và ô nhiễm môi trường. Phương pháp này cũng góp phần vào việc tái chế bã mía, một phế phẩm nông nghiệp, thành sản phẩm sinh học có giá trị.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sự phụ thuộc vào nguồn nhiên liệu hóa thạch không tái tạo đang đối mặt với thách thức cạn kiệt tài nguyên và gây ra những tác động môi trường nghiêm trọng. Quá trình đốt cháy hydrocarbon giải phóng lượng lớn khí nhà kính (GHG) như carbon dioxide ($CO_2$) và methane ($CH_4$), thúc đẩy hiện tượng biến đổi khí hậu, nước biển dâng và suy thoái hệ sinh thái toàn cầu. Riêng lĩnh vực giao thông vận tải đã chiếm khoảng 60% tổng lượng tiêu thụ dầu mỏ toàn cầu, đóng góp 19% lượng phát thải $CO_2$ và 70% lượng khí carbon monoxide ($CO$). Trước thực trạng đó, việc tìm kiếm các nguồn năng lượng thay thế, có khả năng tái tạo và thân thiện với môi trường như nhiên liệu sinh học (biofuel), đặc biệt là cồn sinh học (bioethanol), trở thành yêu cầu cấp thiết.

Nhiên liệu sinh học thế hệ thứ nhất sản xuất từ cây lương thực (ngô, mía đường, sắn, lúa mì) bộc lộ hạn chế lớn do cạnh tranh trực tiếp với quỹ đất nông nghiệp và nguồn cung cấp thực phẩm, dẫn đến nguy cơ mất an ninh lương thực và biến động giá nông sản. Do đó, xu hướng nghiên cứu chuyển dịch mạnh mẽ sang nhiên liệu sinh học thế hệ thứ hai—sử dụng nguồn sinh khối lignocellulose từ phụ phẩm nông nghiệp như bã mía, rơm rạ, mùn cưa và phế thải hữu cơ. Tại các quốc gia nông nghiệp như Lào (Lao PDR) và Việt Nam, khối lượng phụ phẩm từ trồng trọt và chế biến sau thu hoạch thải ra môi trường hàng năm rất lớn nhưng chưa được tận dụng triệt để. Bã mía (sugarcane bagasse) là nguồn nguyên liệu giàu cellulose và hemicellulose, tạo tiền đề thuận lợi cho quá trình chuyển hóa sinh học thành đường lên men và cồn sinh học.

Đề tài khóa luận cử nhân ngành Quản lý và Khoa học Môi trường của tác giả Sangvone Souliya tập trung vào việc nghiên cứu thực nghiệm quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía thông qua phương pháp Thủy phân và Lên men riêng rẽ (Separate Hydrolysis and Fermentation - SHF), sử dụng tác nhân sinh học là chủng nấm men phân lập từ quả sầu riêng (Durio zibethinus).

Mục tiêu nghiên cứu

1. Tìm hiểu và mô tả quá trình sản xuất cồn sinh học (bioethanol).
2. Xác định việc tận dụng nguồn phụ phẩm chứa lignocellulose trong sản xuất cồn sinh học.
3. Xác định các điều kiện tối ưu của quá trình lên men để sản xuất bioethanol từ sinh khối lignocellulose.
4. Thực hiện thực nghiệm sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose.
5. So sánh khía cạnh kinh tế và hiệu suất thu hồi ethanol khi ứng dụng quy trình thủy phân và lên men riêng rẽ (SHF).

Câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết

• Câu hỏi a: Liệu có thể sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu thô là bã mía kết hợp với tác nhân sinh học là nấm men phân lập từ quả sầu riêng (Durio zibethinus) hay không?
• Câu hỏi b: Lượng bioethanol thu được thông qua quy trình thủy phân và lên men riêng rẽ (SHF) là bao nhiêu?
• Câu hỏi c: Cân bằng năng lượng giữa đầu vào của quy trình sản xuất và đầu ra của sản phẩm ethanol diễn ra như thế nào?

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Phụ phẩm bã mía (sugarcane bagasse) và chủng nấm men phân lập từ quả sầu riêng (Durio zibethinus).
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm thuộc Khoa Hóa học, Trường Đại học Sriwijaya (Palembang, Indonesia) và Chương trình Quốc tế, Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên (Việt Nam).
• Phạm vi thời gian: Thực nghiệm thực hiện trong các mốc thời gian thủy phân (30, 45, 60 phút) và theo dõi động thái lên men trong chu kỳ 8 ngày (lấy mẫu phân tích định kỳ 2 ngày một lần).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và khái niệm

Phân loại thế hệ nhiên liệu sinh học

Nhiên liệu sinh học được phân loại thành sơ cấp (củi, mùn cưa, phụ phẩm chưa chế biến) và thứ cấp. Nhiên liệu sinh học thứ cấp gồm ba thế hệ:

• Thế hệ thứ nhất (1st generation): Sản xuất từ cây lương thực chứa tinh bột hoặc đường (ngô, mía, củ cải đường, sắn, dầu cọ) bằng công nghệ truyền thống; hạn chế lớn là đe dọa an ninh lương thực.
• Thế hệ thứ hai (2nd generation / Advanced biofuels): Sản xuất từ sinh khối lignocellulose phi lương thực (phụ phẩm đồng ruộng, tàn dư rừng, cỏ năng lượng nhanh). Ưu điểm vượt trội là không cạnh tranh đất canh tác lương thực, giảm phát thải khí nhà kính toàn diện.
• Thế hệ thứ ba (3rd generation): Sản xuất từ vi tảo (microalgae) và các vi sinh vật quang hợp có hàm lượng lipid/carbohydrate cao hoặc thực vật biến đổi gen giảm hàm lượng lignin.

Cấu trúc sinh khối Lignocellulose của bã mía

Bã mía cấu tạo từ ba thành phần polyme chính liên kết chặt chẽ với nhau:

• Cellulose (25–45%): Polysaccharide mạch thẳng gồm hàng trăm đến hàng nghìn đơn vị D-glucose liên kết qua cầu nối $\beta$-1,4-glycosidic, có cấu trúc kết tinh bền vững.
• Hemicellulose (28–32%): Polysaccharide phân nhánh dị thể, gồm các chuỗi ngắn từ 500 đến 3.000 đơn vị đường, chứa cả đường hexose (glucose, galactose, mannose) và đường pentose (xylose, arabinose).
• Lignin (15–25%): Polyme thơm không đồng nhất ba chiều cấu tạo từ các đơn vị phenylpropane, bao bọc bên ngoài màng cellulose và hemicellulose, đóng vai trò tạo khung cơ học và chống lại sự phân hủy sinh học/hóa học.

Quy trình chuyển hóa Lignocellulose thành Bioethanol

Quy trình chuyển hóa bao gồm bốn công đoạn cơ bản:

1. Tiền xử lý (Pretreatment): Phá vỡ cấu trúc phức hợp lignocellulose, loại bỏ hoặc tái phân bố lignin và hemicellulose, làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc của cellulose.
2. Thủy phân (Hydrolysis/Saccharification): Cắt đứt liên kết glycosidic trong cellulose và hemicellulose bằng axit hoặc enzyme để tạo thành các phân tử đường đơn: $$(C_6H_{10}O_5)n + nH_2O \rightarrow nC_6H{12}O_6$$
3. Lên men (Fermentation): Vi sinh vật (nấm men hoặc vi khuẩn) chuyển hóa đường đơn thành ethanol và khí carbon dioxide trong điều kiện yếm khí.
4. Tách chiết/Chưng cất (Separation/Distillation): Thu hồi và tinh chế cồn sinh học đạt độ tinh khiết yêu cầu.

Phương pháp Thủy phân và Lên men riêng rẽ (SHF)

Quy trình SHF (Separate Hydrolysis and Fermentation) thực hiện bước thủy phân đường và bước lên men cồn trong hai thiết bị phản ứng tách biệt. Ưu điểm cốt lõi của SHF là cho phép tối ưu hóa độc lập các điều kiện vận hành (nhiệt độ, pH, thời gian) cho từng giai đoạn, đồng thời cho phép loại bỏ cặn lignin trước khi nạp dịch đường vào bình lên men. Nhược điểm của SHF là nguy cơ nhiễm khuẩn do thời gian xử lý kéo dài và khả năng xảy ra hiện tượng ức chế sản phẩm cuối (end-product inhibition).

+--------------------------+     +--------------------------+     +--------------------------+     +--------------------------+
|  Sinh khối Lignocellulose | --> |   Tiền xử lý nhiệt ẩm    | --> | Thủy phân axit H2SO4 5%  | --> |     Lên men bằng nấm men |
|       (10g bã mía)       |     |  (Autoclave 121°C, 1h)   |     |    (30, 45, 60 phút)     |     |   sầu riêng (8 ngày, pH4)|
+--------------------------+     +--------------------------+     +--------------------------+     +--------------------------+

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Chuẩn bị nguyên liệu và tiền xử lý vật lý

• Bã mía thô được rửa sạch bằng nước máy, cắt nhỏ thành các mảnh vụn và sấy khô trong tủ sấy từ 3 đến 5 ngày ở nhiệt độ kiểm soát để bảo toàn cấu trúc tự nhiên.
• Cân 10g bã mía khô cho vào các bình tam giác, bổ sung 50 mL nước cất.
• Tiền xử lý vật lý bằng phương pháp nhiệt ẩm trong nồi hấp tiệt trùng (steam autoclave) ở 121°C trong 1 giờ nhằm phá vỡ mạng lưới liên kết lignin và tăng khả năng tiếp xúc bề mặt.

2. Thủy phân bằng axit loãng (Dilute Acid Hydrolysis)

• Dịch huyền phù bã mía sau tiền xử lý được bổ sung dung dịch axit sulfuric ($H_2SO_4$) nồng độ 5%.
• Quá trình thủy phân nhiệt ẩm thực hiện trong nồi hấp tiệt trùng ở 121°C với 3 mức thời gian khảo sát: 30 phút, 45 phút và 60 phút.

3. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy và nấm men

• Chủng giống: Nấm men phân lập từ quả sầu riêng (Durio zibethinus), do sinh viên Khoa Hóa học - Đại học Sriwijaya cung cấp.
• Môi trường phục hồi (Refresher medium): 1g yeast extract, 2g peptone, 2g glucose, 2g dextrose, 2g bacto agar pha trong 100 mL nước cất.
• Môi trường thạch YPD (YPD Agar medium): 1g yeast extract, 2g peptone, 2g glucose/dextrose, 2g agar pha trong 100 mL nước cất, hấp vô trùng ở 121°C trong 15 phút, đổ vào 5 đĩa petri để cấy truyền khuẩn lạc.
• Môi trường dịch thể YPD (YPD Broth): 1g yeast extract, 2g peptone, 2g dextrose pha trong 100 mL nước cất, chia vào 10 ống giống vô trùng (121°C, 15 phút), cấy 1 khuẩn lạc nấm men và ủ lắc ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
• Môi trường khoáng lên men (Fermentation Medium): 4g potassium dihydrogen phosphate ($KH_2PO_4$), 2g ammonium sulfate ($(NH_4)_2SO_4$), 2g magnesium sulfate ($MgSO_4$), 2g yeast extract hòa tan trong 500 mL nước cất, hấp khử trùng ở 121°C trong 60 phút.

4. Quy trình lên men và kiểm soát pH

• Lấy 20 mL dịch thủy phân từ mỗi bình (tương ứng với thời gian thủy phân 30, 45, 60 phút) cho vào các chai lên men vô trùng.
• Bổ sung 25 mL môi trường khoáng dinh dưỡng vào mỗi mẫu.
• Chuẩn bị dung dịch natri hydroxide ($NaOH$) bằng cách hòa tan 20g $NaOH$ trong 100 mL nước cất (hấp vô trùng 121°C trong 15 phút). Bổ sung từ 3–5 mL dung dịch $NaOH$ để hiệu chỉnh pH dịch lên men về mức tối ưu pH 4.0 – 4.5.
• Bổ sung 2 mL dịch nhân giống nấm men sầu riêng vào hỗn hợp lên men.
• Tiến hành lên men trong máy lắc ủ (shaking incubator) ở nhiệt độ phòng trong 8 ngày. Lấy 2 mL mẫu định kỳ mỗi 2 ngày (ngày 0, 2, 4, 6, 8) để phục vụ công tác phân tích.

5. Phương pháp phân tích và đo đạc

• Phân tích đường khử: Sử dụng phương pháp quang phổ so màu với thuốc thử Axit 3,5-Dinitrosalicylic (DNS), đo độ hấp thụ quang (Absorbance) để xây dựng đường chuẩn glucose và xác định hàm lượng đường khử giải phóng.
• Phân tích nồng độ Ethanol: Sử dụng hệ thống sắc ký khí (Gas Chromatography - GC) để tách và định lượng các hợp chất bay hơi. Nồng độ ethanol được xác định thông qua diện tích pic sắc ký (Peak Area) đối chiếu với đường chuẩn ethanol.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần mở đầu và Tổng quan nghiên cứu (PART I. Research rationale & Literature Review)

Chương này thiết lập nền tảng lý luận về sự cấp thiết của việc phát triển năng lượng tái tạo thay thế nhiên liệu hóa thạch. Tác giả phân tích số liệu từ Cơ quan Năng lượng Quốc tế (IEA) và các tổ chức quốc tế về tỷ trọng tiêu thụ dầu mỏ của ngành giao thông, thực trạng biến đổi khí hậu do khí thải nhà kính và nguy cơ khủng hoảng an ninh năng lượng toàn cầu.

Văn bản so sánh chi tiết ưu nhược điểm của các thế hệ nhiên liệu sinh học:

• Thế hệ 1: Cạnh tranh lương thực, làm tăng giá lương thực và chịu ảnh hưởng tiêu cực về mặt đạo đức xã hội.
• Thế hệ 2: Tận dụng tối đa phế phụ phẩm nông - lâm nghiệp (như bã mía với tỷ lệ 25–45% cellulose, 28–32% hemicellulose, 15–25% lignin), giúp giảm áp lực khai thác rừng và giảm phát thải vòng đời.
• Thế hệ 3: Tiềm năng từ vi tảo không sử dụng đất nông nghiệp nhưng chi phí nuôi cấy và thu hồi còn cao.

Tác giả đi sâu phân tích cơ chế hóa học của ba cấu tử lignocellulose, so sánh các công nghệ tiền xử lý (cơ học, nổ hơi, nổ sợi amoniac AFEX, xử lý siêu tới hạn $CO_2$, tiền xử lý kiềm/axit, ozon và tiền xử lý sinh học), cũng như so sánh phương thức SHF với phương thức đường hóa và lên men đồng thời (SSF).

Phương pháp nghiên cứu và Thực nghiệm (METHODS)

Chương phương pháp mô tả chi tiết toàn bộ các bước thực nghiệm, từ khâu xử lý nguyên liệu bã mía, thiết bị phân tích, danh mục hóa chất đến các công thức môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh.

Thành phần hóa chất / Môi trường	Khối lượng / Thể tích	Mục đích sử dụng
Bã mía khô (Sugarcane bagasse)	10 g / bình	Nguồn cơ chất lignocellulose thô
Nước cất (Distilled water)	50 mL	Tạo huyền phù tiền xử lý
Axit Sulfuric ($H_2SO_4$)	Dung dịch 5%	Tác nhân xúc tác thủy phân cellulose
Môi trường thạch YPD Agar	2g agar, 2g glucose, 2g peptone, 1g yeast extract / 100 mL	Phân lập và nuôi cấy đĩa thạch nấm men
Môi trường dịch thể YPD Broth	2g dextrose, 2g peptone, 1g yeast extract / 100 mL	Nhân sinh khối giống nấm men trong 24h
Môi trường khoáng lên men	4g $KH_2PO_4$, 2g $(NH_4)_2SO_4$, 2g $MgSO_4$, 2g yeast extract / 500 mL	Cung cấp dinh dưỡng đa - vi lượng cho nấm men
Dung dịch điều chỉnh pH ($NaOH$)	20g $NaOH$ / 100 mL nước cất	Hiệu chỉnh dịch lên men đạt pH 4.0 – 4.5

Quy trình bố trí thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức thời gian thủy phân (30, 45, 60 phút) kết hợp với chu kỳ lên men 8 ngày trong máy lắc ủ, lấy mẫu tại các thời điểm 0, 2, 4, 6, 8 ngày.

Kết quả và Thảo luận (CHAPTER IV. RESULTS AND DISCUSSION)

Chương này trình bày các số liệu thực nghiệm đo đạc từ sắc ký khí GC và phân tích quang phổ đường khử DNS:

1. Xây dựng đường chuẩn phân tích Ethanol

Đường chuẩn ethanol được thiết lập ở các dải nồng độ 1%, 2%, 3%, 5% và 10% ethanol tiêu chuẩn trên hệ thống GC. Phương trình hồi quy tuyến tính thu được: $$y = 1\times 10^6 x \quad (R^2 = 0.9047)$$ Trong đó:

• $y$: Diện tích pic sắc ký (Sample peak area).
• $x$: Nồng độ phần trăm thể tích ethanol (% EtOH).
• Công thức quy đổi nồng độ thực tế: $x = \frac{y}{1\times 10^6}$.

2. Phân tích hàm lượng và động thái sinh tổng hợp Bioethanol

Dữ liệu sắc ký khí phân tích quá trình lên men từ ngày 0 đến ngày 8 cho thấy đáp ứng bậc hai (quadratic response) có ý nghĩa thống kê giữa thời gian ủ và thể tích ethanol tạo thành. Mẫu E1 (thời gian thủy phân 30 phút) tại thời điểm ngày 0 ghi nhận diện tích pic ban đầu là 8423. Kết quả so sánh giữa các mốc thời gian thủy phân chứng minh thời gian thủy phân 30 phút cho hiệu quả chuyển hóa ethanol cao nhất qua 8 ngày lên men.

3. Đánh giá hàm lượng đường khử (Glucose) bằng phương pháp DNS

Đường chuẩn glucose được xây dựng từ các nồng độ chuẩn đã biết qua phép đo độ hấp thụ quang. Phân tích động thái đường khử trong quá trình lên men cho thấy đường cong biến thiên nồng độ glucose có sự bất thường (bắt đầu từ mức thấp và tăng dần lên mức cao, trái ngược với đồ thị tiêu thụ cơ chất thông thường), phản ánh quá trình thủy phân tiếp diễn hoặc các điều kiện thực nghiệm lên men chưa đạt trạng thái tối ưu hoàn toàn.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính

• Thể tích bioethanol cao nhất thu được trong thực nghiệm là 0.041 mL tại điều kiện thủy phân 30 phút bằng $H_2SO_4$ 5% kết hợp hấp nhiệt 121°C và thời gian lên men 8 ngày trong máy lắc ủ.
• Xác định môi trường khoáng tối ưu bổ sung cho nấm men gồm $KH_2PO_4$ (8 g/L), $(NH_4)_2SO_4$ (4 g/L), $MgSO_4$ (4 g/L) và yeast extract (4 g/L).
• Khoảng pH thích hợp cho hoạt động của nấm men sầu riêng trong hệ lên men được xác lập là pH 4.0 – 4.5 (điều chỉnh bằng dung dịch $NaOH$ 20%).
• Thời gian ủ lắc thích hợp cho quá trình chuyển hóa đường thành cồn diễn ra tích cực từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 6, đạt đỉnh vào ngày thứ 8.

Thông số thực nghiệm	Điều kiện tối ưu / Giá trị ghi nhận	Ghi chú kỹ thuật
Phương pháp tiền xử lý	Hấp nhiệt ẩm (Autoclave) 121°C trong 1 giờ	Tiền xử lý vật lý phá vỡ cấu trúc lignin
Nồng độ axit thủy phân	Dung dịch $H_2SO_4$ 5%	Xúc tác phân cắt liên kết glycosidic
Thời gian thủy phân tối ưu	30 phút (ở 121°C)	Cho hiệu suất ethanol cao hơn mốc 45 và 60 phút
Độ pH môi trường lên men	pH 4.0 – 4.5	Hiệu chỉnh bằng dung dịch $NaOH$
Tác nhân sinh học	Nấm men phân lập từ quả sầu riêng (Durio zibethinus)	Lên men kỵ khí
Thời gian lên men tối ưu	8 ngày (lắc ủ liên tục)	Lấy mẫu kiểm tra mỗi 2 ngày
Phương trình đường chuẩn GC	$y = 10^6 x$ ($R^2 = 0.9047$)	Phân tích định lượng ethanol
Lượng Bioethanol cực đại	0.041 mL	Thu được từ 10g bã mía nguyên liệu

Đóng góp của đề tài

• Chứng minh tính khả thi của việc sử dụng chủng nấm men bản địa phân lập từ quả sầu riêng (Durio zibethinus) để sản xuất bioethanol từ phụ phẩm bã mía theo quy trình SHF.
• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về mối tương quan giữa thời gian thủy phân axit loãng (30–60 phút), thời gian lên men (0–8 ngày) và hiệu suất tạo thành cồn sinh học.
• Đóng góp vào chuỗi giải pháp tận dụng phụ phẩm nông nghiệp tại các quốc gia Đông Nam Á (Lào, Việt Nam, Indonesia), hướng đến mô hình kinh tế tuần hoàn và giảm thiểu ô nhiễm môi trường do đốt hoặc thải bỏ bã mía.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được chỉ ra trong nghiên cứu

1. Khả năng chuyển hóa đường của vi sinh vật: Chủng nấm men sầu riêng tự nhiên chỉ chuyển hóa chủ yếu đường hexose (glucose), không thể đồng hóa các loại đường pentose phong phú trong hemicellulose bã mía như xylose và arabinose.
2. Hiệu suất thu hồi cồn còn thấp: Lượng bioethanol thu được tối đa chỉ đạt 0.041 mL do thời gian lên men thực tế chưa đạt điểm cân bằng tối ưu và các thông số công nghệ chưa được đồng bộ hóa hoàn toàn.
3. Cản trở của cấu trúc Lignin: Phương pháp tiền xử lý nhiệt ẩm đơn thuần chưa loại bỏ triệt để lignin, gây cản trở sự tiếp cận của axit và enzyme đến các sợi cellulose.
4. Hạn chế của quy trình SHF: Thời gian lưu của quá trình kéo dài làm tăng nguy cơ nhiễm tạp vi sinh vật trong dung dịch đường và dễ xảy ra hiện tượng ức chế sản phẩm cuối (end-product inhibition).

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Nghiên cứu ứng dụng các chủng vi sinh vật biến đổi gen hoặc hệ vi sinh vật phối hợp có khả năng đồng lên men cả đường 6 carbon (glucose) và đường 5 carbon (xylose, arabinose).
• Khảo sát kết hợp các phương pháp tiền xử lý tiên tiến (tiền xử lý hóa học, nổ hơi nước, hoặc nổ sợi amoniac AFEX) để nâng cao tỷ lệ tách bỏ lignin trước khi thủy phân.
• Tối ưu hóa sâu hơn các thông số công nghệ: nồng độ axit sulfuric, tỷ lệ rắn/lỏng, nhiệt độ thủy phân và tốc độ lắc ủ.
• Đánh giá khả năng chuyển đổi quy trình từ SHF sang đường hóa và lên men đồng thời (Simultaneous Saccharification and Fermentation - SSF) hoặc lên men liên tục có thu hồi tế bào để hạn chế nguy cơ nhiễm khuẩn và tăng hiệu suất thu hồi bioethanol ở quy mô lớn.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng:
  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Khoa học Môi trường, Quản lý Môi trường, Công nghệ Sinh học và Kỹ thuật Hóa học.
  • Các kỹ sư và nhà nghiên cứu làm việc trong lĩnh vực năng lượng sinh học, tái chế phụ phẩm nông nghiệp và công nghệ lên men.
• Các phần có giá trị tham khảo cao:
  • Quy trình chi tiết pha chế các hệ môi trường nuôi cấy nấm men (YPD Agar, YPD Broth, Fermentation Medium).
  • Phương pháp thiết lập đường chuẩn phân tích ethanol trên sắc ký khí (GC) và đường chuẩn glucose bằng phương pháp đo màu DNS.
  • Bố trí thực nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân axit loãng và thời gian lên men kỵ khí.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nguyên liệu bã mía và chủng nấm men trong nghiên cứu có nguồn gốc từ đâu?

Nguồn nguyên liệu bã mía (sugarcane bagasse) và chủng nấm men phân lập từ quả sầu riêng (Durio zibethinus) được cung cấp và thực hiện tại phòng thí nghiệm của Khoa Hóa học, Trường Đại học Sriwijaya (Palembang, Indonesia).

2. Phương pháp tiền xử lý và thủy phân bã mía trong khóa luận được thực hiện như thế nào?

• Tiền xử lý: Sử dụng phương pháp vật lý bằng nồi hấp tiệt trùng (steam autoclave) ở nhiệt độ 121°C trong thời gian 1 giờ nhằm phá vỡ cấu trúc nền lignocellulose.
• Thủy phân: Bổ sung dung dịch axit sulfuric ($H_2SO_4$) nồng độ 5% vào mẫu bã mía đã tiền xử lý, tiếp tục hấp nhiệt ở 121°C với 3 mốc thời gian khảo sát là 30 phút, 45 phút và 60 phút.

3. Phương trình đường chuẩn và công thức xác định nồng độ Ethanol trên sắc ký khí (GC) là gì?

Đường chuẩn ethanol được xây dựng với phương trình tuyến tính $y = 1\times 10^6 x$ ($R^2 = 0.9047$). Công thức tính phần trăm nồng độ ethanol (% EtOH) từ diện tích pic GC ($y$) là: $$x = \frac{y}{1\times 10^6}$$

4. Kết quả sản xuất bioethanol cao nhất thu được trong nghiên cứu là bao nhiêu?

Hàm lượng bioethanol cao nhất thu được là 0.041 mL, đạt được ở mẫu có thời gian thủy phân 30 phút và trải qua 8 ngày lên men trong máy lắc ủ ở điều kiện pH 4.0 – 4.5.

5. Những nguyên nhân chính khiến hiệu suất thu hồi ethanol trong nghiên cứu này chưa cao là gì?

Các nguyên nhân chính gồm:

• Chủng nấm men sầu riêng chưa thể chuyển hóa các loại đường pentose (xylose, arabinose) có trong bã mía thành ethanol mà chỉ chuyển hóa được glucose.
• Quá trình tiền xử lý vật lý chưa loại bỏ hoàn toàn lignin cản trở.
• Thời gian lên men và các điều kiện môi trường chưa được tối ưu hóa đồng bộ, dẫn đến quá trình chuyển hóa đường chưa triệt để.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Sangvone Souliya đã hoàn thành việc nghiên cứu thực nghiệm quy trình sản xuất cồn sinh học (bioethanol) từ phụ phẩm bã mía thông qua phương pháp thủy phân và lên men riêng rẽ (SHF) với chủng nấm men phân lập từ quả sầu riêng (Durio zibethinus). Nghiên cứu đã xác định được điều kiện thủy phân bằng axit sulfuric 5% trong 30 phút và lên men kỵ khí trong 8 ngày cho lượng ethanol thu được cực đại là 0.041 mL. Mặc dù hiệu suất chuyển hóa tổng thể còn hạn chế do đặc tính cơ chất lignocellulose phức tạp và khả năng đồng hóa đường C5 của nấm men chưa hoàn thiện, công trình đã cung cấp dữ liệu thực nghiệm có giá trị khoa học về việc tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp làm nguồn năng lượng tái tạo thân thiện với môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

THAI NGUYEN UNIVERSITY UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND FORESTRY SRIWIJAYA UNIVERSITY SANGVONE SOULIYA BACHELOR THESIS Study Mode : Full-time Major : Environmental Science and Management Faculty : International Programs Office Batch : K45 AEP (2013-2017) Thai Nguyen,22/10/ 2017 Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry Degree Program Bachelor of Environmental Science and Management Student Name Sangvone Souliya Student ID DTN1454290077 Thesis Title ―Bioethanol production from Sugarcane Bagasse by Separate Hydrolysis and Fermentation using YEAST ISOLATED FROM DURIAN ((Durio zhibetinus) FRUIT‖ Supervisor (s) 1. Nguyen Huu Tho,Ph. Supervisor‘s signature (s) Abstract: Sugarcane bagasse is the most abundant agriculture waste in the world. It is an attractive feedstock for large-scale biological production of bioethanol.

Therefore, production of ethanol (bioethanol) from lignocellulosic biomass is one way to reduce environment pollution and crude oil from fossil. Bioethanol can produce biofuel by fuel in gasoline engine mixed with ethanol. Bioethanol production from sugarcane bagasse can produce with three main steps by pretreatment, hydrolysis and fermentation. In this study Pretreatment or delignification conducted physical method using steam autoclave for 1 hour to remove lignin.

Followed by hydrolysis in addition of 5% in each samples to dilute or concentration acid hydrolysis. Fermentation used Na-OH to measure ethanol concentration was obtained pH 4. The results showed that the highest of ethanol production was 0.041ml during 30 minutes hydrolysis timed and fermentation process by shaking incubator was 8 days. Keywords: Bioethanol production; Biofuel; Feedstock; Lignocellulosic biomass; Pretreatment; Hydrolysis; Fermentation ii Number of 44 pages Date of October, 2017 Submission iii ACKNOWLEDGMENT I gratefully acknowledge the support and guidance of faculty members of Chemistry Department of Mathematic and Natural Science Faculty in Sriwijaya University, Indonesia.

Most particularly I would like to express my deep thanks to my supervisors Hermansyah,Ph. of Chemistry Department of Mathematic and Natural Science Faculty in Sriwijaya University, Indonesia and Nguyen Huu Tho,Ph. of Department of Science Management and International Relation, Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry (TUAF), Vietnam who so kindly participated in this research by giving their generously of their time. Without their thoughtful encouragement and careful supervision.

This thesis would never have taken shape. I am also deeply thankful to Mr. Deddy and Prof Aldes from research laboratory and all of my friends from Indonesia for giving me very kindly and helpful during doing the experiment. Finally, I would like to express my deepest thanks from my heart to my family for their very supportive in every way and all good friends that beside me for along.

iv TABLE OF CONTENT List of Figure………………………………………………………………….vii List of Tables……………………………………………………………….…viii List of Abbreviations………………………………………………….3 Research questions and hypotheses .2 Renewable energy or alternative energy .5 Processing of lignocellulosic to ethanol .4 Separate hydrolysis and fermentation.2 List of apparatus.3 List of reagents.1 Processing of lignocellulosics to bioethanol.1 Preparation of fermentation medium.2 Preparation of YPD agar medium .3 Preparation of YPD broth. RESULT AND DISCUSSION .3 Ethanol analysis curve. 44 vi LIST OF FIGURES Figure 1 Classification of biofuels. 9 Figure 2 Framework of Ethanol Fermentation Process…………………….17 Figure 3 Preparation of sample.

21 Figure 4 A laboratory being used for the fermentation culture medium…. 23 Figure 5 Preparation of inoculum growth cell.24 Figure 6 Diagram of ethanol standard curve. 27 Figure 7 Comparison ethanol analysis with different hydrolysis time. 30 Figure 8 Standard curve (reducing glucose).

31 Figure 9 The curve of reducing sugar in three different hydrolysis time….32 vii LIST OF TABLES Table 1 The difference hydrolysis time. 22 Table 2 Absorbance of glucose analysis by DNS. 25 Table 3 The correlation between the concentration of glucose at various levels and the value Absorbance derived from glucose analysis by DNS. 33 Table 4 Analysis of ethanol on different incubation time .