Quy định Vận chuyển Hạt nhân và Phân bào bởi Ran GTPase

Nghiên cứu vai trò của GTPase Ran trong việc điều chỉnh vận chuyển hạt nhân và quá trình phân bào, mở ra hướng đi mới trong sinh học tế bào.

• Tác giả: Ting Chen
• Người hướng dẫn: lan Macara
• Trường học: Xiamen University
• Chuyên ngành: Microbiology
• Đề tài: Quy định Vận chuyển Hạt nhân và Phân bào bởi Ran GTPase
• Loại tài liệu: dissertation
• Năm xuất bản: 2007
• Địa điểm: Ann Arbor

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Ran GTPase và Vận Chuyển Hạt Nhân

Tế bào nhân thực có một đặc điểm nổi bật: màng nhân. Màng nhân là một cấu trúc màng kép liên tục, ngăn cách quá trình sao chép và phiên mã DNA với quá trình tổng hợp protein. Sự tách biệt này mang lại mức độ điều chỉnh cao, đồng thời đòi hỏi một hệ thống vận chuyển hạt nhân có kiểm soát các đại phân tử giữa tế bào chất và nhân. Sự phức tạp và quy mô của vận chuyển hạt nhân là đáng kể. Ước tính sơ bộ cho thấy hàng triệu đại phân tử di chuyển qua màng nhân mỗi phút. Các protein hạt nhân, chẳng hạn như histone, yếu tố phiên mã và polymerase, phải được nhập vào nhân sau khi tổng hợp trong tế bào chất. Ngược lại, mRNA, tRNA, rRNA, microRNA và các tiểu đơn vị ribosome cần được xuất vào tế bào chất để thực hiện chức năng dịch mã. Bên cạnh các chức năng cơ bản này, vận chuyển hạt nhân còn đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh hoạt động tế bào của nhiều protein. Ví dụ, protein ức chế khối u p53 được giữ lại trong nhân bằng cách tetramer hóa, che khuất tín hiệu xuất khẩu hạt nhân (NES).

1.1. Tầm quan trọng của vận chuyển hạt nhân trong tế bào

Vận chuyển giữa nhân và tế bào chất rất quan trọng đối với sự sống của tế bào nhân thực. Nó cho phép kiểm soát chính xác quá trình sao chép DNA, phiên mã, và dịch mã. Sự vận chuyển này đảm bảo rằng các protein và RNA cần thiết đều ở đúng vị trí và đúng thời điểm để thực hiện chức năng của chúng. Rối loạn trong vận chuyển hạt nhân có thể dẫn đến nhiều bệnh lý khác nhau.

1.2. Vai trò của Protein Ran trong điều hòa vận chuyển

Protein Ran là một Ran GTPase đóng vai trò trung tâm trong việc điều chỉnh vận chuyển hạt nhân. Nó hoạt động như một công tắc phân tử, chuyển đổi giữa trạng thái liên kết GTP (Ran-GTP) và trạng thái liên kết GDP (Ran-GDP). Sự phân bố không gian của hai trạng thái này tạo ra một gradient nồng độ, điều khiển hướng di chuyển của các protein qua phức hợp lỗ nhân (Nuclear Pore Complex - NPC).

II. Cơ Chế Vận Chuyển Hạt Nhân Được Điều Khiển Bởi Ran GTPase

Sự vận chuyển protein vào và ra khỏi nhân là một quá trình qua trung gian tín hiệu. Các chuỗi protein hoạt động như tín hiệu nhập hoặc xuất được gọi là tín hiệu định vị hạt nhân (NLS) hoặc tín hiệu xuất khẩu hạt nhân (NES) tương ứng. NLS đầu tiên được xác định trong kháng nguyên T lớn của virus simian 40 (SV40). Chuỗi này, PKKKRK, và NLS được tìm thấy trong nucleoplasmin, KRPAATKKAGQAKKKKLD, là các nguyên mẫu của NLS đơn phân và hai phần cổ điển. Chúng giàu axit amin bazơ và đủ để kích hoạt định vị hạt nhân của các protein không được vận chuyển. Cả NLS đơn phân và hai phần đều được biết là có mặt trong nhiều protein khác nhau. Các NLS chức năng khác nhưng không cổ điển cũng đã được khám phá. Các chuỗi protein này khác với NLS cổ điển, nhưng thường có nhiều axit amin bazơ. Ví dụ, các NLS bazơ được tìm thấy trong protein virus Rev và Rex bao gồm các đoạn bazơ, giàu arginine. Gần đây, người ta đã phát hiện ra rằng các NLS được vận chuyển bằng vận chuyển (Karyopherin β 2) bao gồm các phần tử lớn (>-30 dư lượng) với dư lượng bazơ tổng thể và chứa các mô típ đồng thuận bao gồm một mô típ kỵ nước hoặc bazơ trung tâm, sau đó là một mô típ R/K/HX PY ở đầu C. Tuy nhiên, không phải NLS đều là các chuỗi protein đơn giản chứa dư lượng bazơ.

2.1. Tín Hiệu Định Vị Hạt Nhân NLS và Tín Hiệu Xuất Khẩu Hạt Nhân NES

Các protein được vận chuyển vào nhân mang theo tín hiệu NLS, được nhận diện bởi các protein vận chuyển nhập (importin). Ngược lại, các protein được vận chuyển ra khỏi nhân mang theo tín hiệu NES, được nhận diện bởi các protein vận chuyển xuất (exportin). Các tín hiệu này đóng vai trò như "mã bưu điện", đảm bảo rằng các protein đến đúng địa điểm trong tế bào.

2.2. Vai trò của Importin và Exportin trong vận chuyển

Importin và exportin là các protein thuộc họ karyopherin, đóng vai trò trung gian trong quá trình vận chuyển hạt nhân. Importin gắn với các protein mang NLS và đưa chúng qua Nuclear Pore Complex (NPC) vào trong nhân. Exportin hoạt động theo cách tương tự, nhưng vận chuyển các protein mang NES ra khỏi nhân.

2.3. Nuclear Pore Complex NPC Cổng vào và ra của hạt nhân

Nuclear Pore Complex (NPC) là một cấu trúc protein lớn nằm trên màng nhân, đóng vai trò là cổng kiểm soát vận chuyển hạt nhân. NPC cho phép các phân tử nhỏ khuếch tán tự do, nhưng cần sự hỗ trợ của importin và exportin để vận chuyển các protein và RNA lớn hơn.

III. Gradient Ran GTP Điều Hướng Vận Chuyển Hạt Nhân Như Thế Nào

Các thụ thể vận chuyển hạt nhân chứa FG, do đó tạo điều kiện cho việc đi qua các phân tử hàng hóa qua NPC. Lớp lớn nhất của các thụ thể vận chuyển hạt nhân là siêu họ protein liên quan đến importin, đôi khi được gọi là họ karyopherin. Chúng được chia thành importin hoặc exportin tùy thuộc vào việc chúng tham gia vào nhập khẩu hoặc xuất khẩu hạt nhân. Bên cạnh khả năng liên kết với nucleoporin, các thụ thể vận chuyển hạt nhân có thể tạo thành phức hợp với trạng thái liên kết GTP của Ran GTPase. Thành viên của họ karyopherin được xác định là importin-B (còn được gọi là p97, karyopherin-b, Kap95 và PTAC 95). Importin-B chuyển vị protein mang NLS bằng cách sử dụng một protein adapter gọi là importin-a (còn được gọi là karyopherin-a, Srplp, p56, PFAC 38 và pendulin). Importin-œ nhận ra NLS trong protein hàng hóa, trong khi importin-B tương tác với nucleoporin và tạo điều kiện cho việc chuyển vị của phức hợp NLS-importin-œ-importin-B trimeric thông qua NPC.

3.1. Chu Trình Ran GTP Chìa khóa tạo ra gradient nồng độ

Ran GTPase liên tục chuyển đổi giữa trạng thái liên kết GTP (Ran-GTP) và trạng thái liên kết GDP (Ran-GDP) thông qua chu trình Ran GTP. Protein RCC1 (Regulator of Chromosome Condensation 1) thúc đẩy chuyển đổi GDP thành GTP, trong khi RanGAP (Ran GTPase-Activating Protein) thúc đẩy thủy phân GTP thành GDP. RCC1 chủ yếu nằm trong nhân, trong khi RanGAP nằm trong tế bào chất, tạo ra gradient Ran-GTP cao trong nhân và Ran-GDP cao trong tế bào chất.

3.2. Ran GTP Giải phóng và Tải Lên Hàng Hóa Vận Chuyển

Trong nhân, nồng độ Ran-GTP cao làm cho importin giải phóng hàng hóa mang NLS của nó. Ngược lại, Ran-GTP lại cần thiết để exportin liên kết với hàng hóa mang NES của nó. Điều này đảm bảo rằng các protein được nhập vào nhân được giải phóng ở đó, và các protein được xuất khẩu ra khỏi nhân chỉ được tải lên khi chúng ở trong nhân.

3.3. Điều hòa sự phân chia tế bào thông qua Gradient Ran

Một trong những ứng dụng quan trọng của gradient Ran là điều hòa sự phân chia tế bào (Mitosis và Meiosis). Gradient Ran cần thiết cho sự hình thành thoi vô sắc, sự phân tách nhiễm sắc thể (Chromosome segregation) chính xác, và sự hình thành lại màng nhân sau phân chia tế bào.

IV. Nghiên Cứu RCC1 Yếu Tố Điều Hòa Trong Chu Trình Ran GTP

Trong giai đoạn thứ hai của dự án, đã phát hiện ra một sửa đổi duy nhất trên RCC1, trong đó dư lượng Ser/Pro N-cuối của RCC1 có vú được methyl hóa trên nhóm amino α. Một hoạt động methyltransferase cho quá trình methyl hóa N-cuối của RCC1 có trong chiết xuất hạt nhân hòa tan từ HeLa. Các đột biến khiếm khuyết methyl hóa của RCC1 không thể liên kết hiệu quả như protein loại hoang dã với nhiễm sắc chất trong quá trình phân bào, dẫn đến các trung tâm số lượng vượt quá và các khuyết tật hình thành thoi. Những khuyết tật này cộng thêm vào những khuyết tật do đột biến làm gián đoạn hoạt động trao đổi và có thể do giảm liên kết với DNA. Ghép RCC1 với histone H2A, để ép buộc gắn nhiễm sắc chất, đảo ngược các khuyết tật phân bào. Luận án này dành tặng cho mẹ tôi Guihua Li và chồng tôi Mingda Hang. Nếu không có tình yêu và sự hỗ trợ liên tục của họ, luận án này sẽ không thể thực hiện được.

4.1. Methyl hóa N terminal của RCC1 Vai trò và ý nghĩa

Nghiên cứu chỉ ra rằng methyl hóa N-terminal của RCC1 đóng vai trò quan trọng trong việc liên kết RCC1 với nhiễm sắc thể. Các đột biến làm gián đoạn quá trình methyl hóa này dẫn đến các vấn đề trong quá trình phân bào, bao gồm cả việc hình thành các trung thể thừa và các khuyết tật trong việc hình thành thoi vô sắc.

4.2. Ảnh hưởng của methyl hóa RCC1 lên sự phân chia tế bào

Methyl hóa N-terminal của RCC1 cần thiết cho việc lắp ráp thoi vô sắc chính xác và sự phân chia nhiễm sắc thể. Việc thiếu sửa đổi này có thể dẫn đến sự phân chia tế bào không chính xác và sự hình thành các tế bào có số lượng nhiễm sắc thể bất thường.

V. Ứng Dụng Ran GTPase và Các Bệnh Liên Quan Đặc Biệt Là Ung Thư

Sự mất điều hòa Ran GTPase và vận chuyển hạt nhân đã được liên kết với nhiều bệnh khác nhau, bao gồm ung thư. Sự biểu hiện quá mức hoặc đột biến của các protein liên quan đến Chu Trình Ran GTP có thể góp phần vào sự tăng sinh, di căn và kháng thuốc của tế bào ung thư. Do đó, Ran GTPase đang trở thành một mục tiêu đầy hứa hẹn cho các liệu pháp điều trị ung thư.

5.1. Ung Thư và sự mất điều hòa Ran GTPase

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức của Ran GTPase có liên quan đến sự tiến triển của nhiều loại ung thư. Điều này có thể là do Ran GTPase đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa chu kỳ tế bào, sự hình thành mạch máu và di căn.

5.2. Tiềm năng điều trị ung thư bằng cách nhắm mục tiêu Ran GTPase

Việc ức chế hoạt động của Ran GTPase có thể là một chiến lược điều trị ung thư hiệu quả. Các nhà nghiên cứu đang tích cực tìm kiếm các phân tử nhỏ có thể ức chế Ran GTPase hoặc các protein liên quan đến chu trình Ran GTP, nhằm phát triển các liệu pháp nhắm mục tiêu điều trị ung thư.

VI. Tương Lai Nghiên Cứu Ran GTPase và Các Hướng Tiếp Cận Mới

Nghiên cứu về Ran GTPase và vận chuyển hạt nhân vẫn còn nhiều tiềm năng khám phá. Các hướng nghiên cứu tương lai có thể tập trung vào việc tìm hiểu sâu hơn về cơ chế điều hòa Ran GTPase, xác định các mục tiêu mới cho liệu pháp điều trị ung thư, và phát triển các công cụ và phương pháp mới để nghiên cứu vận chuyển hạt nhân trong tế bào sống.

6.1. Khám phá các yếu tố điều hòa mới của Ran GTPase

Việc xác định và mô tả đặc điểm của các protein và con đường tín hiệu mới điều hòa hoạt động của Ran GTPase sẽ giúp chúng ta hiểu rõ hơn về vai trò của nó trong tế bào và có thể mở ra các mục tiêu mới cho can thiệp điều trị.

6.2. Phát triển các công cụ để theo dõi vận chuyển hạt nhân trong tế bào sống

Việc phát triển các công cụ và phương pháp mới để theo dõi vận chuyển hạt nhân trong tế bào sống, chẳng hạn như các cảm biến huỳnh quang hoặc các phương pháp hình ảnh tiên tiến, sẽ cho phép chúng ta nghiên cứu động lực học của quá trình này một cách chi tiết hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Regulation of Nuclear Transport and Mitosis by Ran GTPase Ting Chen Changsha, Hunan, P., Xiamen University, 2001 A Dissertation presented to the Graduate Faculty of the University of Virginia in Candidacy for the Degree of Doctor of Philosophy Department of Microbiology University of Virginia January, 2007 linn fee p~ maA UMI Number: 3238148 INFORMATION TO USERS The quality of this reproduction is dependent upon the quality of the copy submitted. Broken or indistinct print, colored or poor quality illustrations and photographs, print bleed-through, substandard margins, and improper alignment can adversely affect reproduction. In the unlikely event that the author did not send a complete manuscript and there are missing pages, these will be noted. Also, if unauthorized copyright material had to be removed, a note will indicate the deletion.

® UMI UMI Microform 3238148 Copyright 2007 by ProQuest Information and Learning Company. All rights reserved. This microform edition is protected against unauthorized copying under Title 17, United States Code. ProQuest Information and Learning Company 300 North Zeeb Road P.

Box 1346 Ann Arbor, MI 48106-1346 Abstract One of the hallmarks of the eukaryotic cell is the possession of a nuclear envelope. Transport of macromolecules between the nuclear and cytoplasmic compartments is mainly regulated by the small GTPase, Ran. The nucleotide exchange factor RCC1 catalyzes formation of RanGTP, whereas the hydrolysis of RanGTP is stimulated by RanGAP1 and RanBPI. Because RCC1 is chromatin-bound throughout the cell cycle while RanGAP1 and RanBPI are cytoplasmic, the concentration of RanGTP is high near the chromatin.

This RanGTP gradient is essential for many cellular processes, including nuclear transport during interphase, mitotic spindle formation, and nuclear envelope assembly during mitosis. During the initial phase of my project I examined the nucleocytoplasmic shuttling of an unusual protein called JAZ, which does not contain classical dsRNA binding domains but instead binds RNA with high affinity through C2H2 zinc fingers. I showed that JAZ is a nuclear protein at steady state but is highly dynamic within the nucleus and undergoes nucleocytoplasmic shuttling. JAZ associates with Exp-5 in the presence of RanGTP and a hairpin RNA, and nuclear export of JAZ requires Exp-5.

However, JAZ also binds to ILF3, in an RNA-independent manner, and JAZ and ILF3 can form a heteromeric complex with Exp-5 and RanGTP. Unlike ILF3, JAZ does not contain a classical NLS. In principle it could diffuse passively through the nuclear pores, and | showed that import is indeed independent of soluble transport factors. However, import ii is inhibited by wheat germ agglutinin and by low temperatures, which do not inhibit passive diffusion.

In the second phase of my project, I discovered a unique modification on RCC1, in which the N-terminal Ser/Pro residue of mammalian RCC1 is methylated on its œ- amino group. A methyltransferase activity for N-terminal methylation of RCC1 is present in soluble nuclear extracts from HeLa cells. Methylation-defective mutants of RCC1 are unable to bind as effectively as wild type protein to chromatin during mitosis, — which results in supernumerary centrosomes and spindle formation defects. These defects are additive to those caused by a mutation that disrupts exchange activity, and may result from decreased binding to DNA.

Coupling RCC1 to histone H2A, to force chromatin attachment, reverses the mitotic defects. ili Dedication This dissertation is dedicated to my mom Guihua Li and my husband Mingda Hang. Without their constant love and support, this dissertation would never have been possible. iv Acknowledgements First, I owe my deepest thanks to my dissertation mentor, lan Macara.

lan's enthusiasm for science, breadth of knowledge, willingness to share his time, and high stands of scientific merit made great impact upon my graduate study. This work would not have been possible without his guidance and support. I also thank all members of my dissertation committee— Ann Beyer, Mitch Smith, Lucy Pemberton, Marty Mayo, and Lou Hammarskjold. Their advice was always helpful, and they were extremely supportive throughout my graduate studies.

I’d like to thank all members of the Macara laboratory, past and present, for their support to my graduate study. In particular, I thank: Amy Brownawell, Kendra Plafker, Scott Plafker, Quansheng Du, Lin Gao, Greg Riddick, Christine Schaner-Tooley, Yi Qin, Julia Dorfman, Claudia Low, Brandon Kremer, Chris Capaldo, Huaye Zhang, Xinyu Chen, and Jim Crawford. I hope that they enjoyed our time together as much as I did. I am grateful to many individuals within the Center for.Cell Signaling for their help: Dr.

Pemberton, and Dr. I also thank Mary Beth, Patricia Arkhurst, Drew Thomas, Flora Terry, and Karen Neale for their daily assistance in the Center for Cell Signaling. I would like to thank Martha Campbell and Sandy Weirich for their kindness and help throughout my study within the Microbiology Department. Finally, I would like to thank my family for all their love and support.

Without them this would not be worthwhile. Table of Contents ABSTRACT | I DEDICATION m ACKNOWLEDGEMENTS IV TABLE OF CONTENTS M LIST OE FIGURES VII LIST OF ABBREVIATIONS : xX CHAPTER I. GENERAL INTRODUCTION 1 RANGTP AND NUCLEAR TRANSPORT. 0 HH TH nh ng TH ng Tu HT TT TH ng g0 2 The Nuclear Localization SiBTIQÌ.

«cty TH HH TH TT 1T 016 KT 4 The Nuclear Pore COTHDÏ6X. Ăn HH HH HH Hà. 8 The Nuclear Transport ReC€jÍOFS. LH HH HH HH HH HH 01H HH 13 ý, 8.

25 Detection of RanGTP Gradients on Mitotic Chromosomes in vitro and in VÌVO.c 26 Function Of Ran in Spindle FOTiidfiOH. ch HH ng HH nh 28 Function of Ran in Centrosome FOTI[ÍO. cà ch HH HH HT HH HT Là HH. THE NUCLEOCYTOPLASMIC SHUTTLING OF JAZ 36.

(5G <4 H91 T9 10T Ầ TT HT TT T9 040041.00 4106 41 JAZ is a nucleocytoplasmic shuttling DFOÍGH. ch HH HH ng HH r 41 Nuclear export of JAZ is dependent on Exp-5 in both digitonin-permeabilized cells and intact cells. 44 JAZ binds ILF3 independently of dsRÌA. HH HH HH TH He Ho TH n0 000k.

53 JAZ, ILF3 and Exp-5 can form heterotrimeric COTIDÍGX. Ăn HH HH ghg 62 JAZ is imported into the nucleus by a nonclassical meCh@HÌSTH. cành re, 65 DISCUSSION 00105777. 74 MATERIALS AND METHODS.

HH HT Họ. ch TL HT 0 016 2H 0.0301 11m 76 Cloning, antibody and recombinant protein €XDT€SSỈOH,.à s cnhnHnnHnH Hà H Hg 76 Yeast dihybrid and conjugation (5S/3. Gà LH nu HH TH TH g2. 77 Cell culture, transfection, and pFOCGSSÍH.

ch HH1 2 1 HH HH rệt 77 RNA binding assays .2 200 nẼnBẼn0Ẽn0nẺ000 0n. 79 MICrOINJCCEION EEEEEEEETE Sổ 0n CỐ ca na cố cố nan. 80 FateroKar yon fusiOn ASSAYS 0000000808080 060 nh. 81 Permeabilized cell transport GSSÿ.

ST HH HH HH HH TH Tà HH Hi TH 001011. N-TERMINAL œ-AMINO METHYLATION OF RCCI 83 9): am na. (HH TH TH TH TH TT HT TT T1 Tre nhẾ ng re 89 Mammalian RCC] is N-terminally mefHyÏqfed. 89 N-terminal methylation motif o.cccccccccccccccsssscsseccesecsscessseeveseseseseesensseceseseseesecesseqesneasatseeeseqsetesssesseaseensaseens 94 N-terminal methyltransferase đC[[VỈDJ.

ánh HH TH KH H0 11111101 HH H110 0 rau 98 Anti-d-N-me2/anti-œ-N-me2/3Ser2-RCC1 antibOdÌlớg. ngrong 101 N-terminal methylation facilitates RCC1 interaction with chrOmdfÏH. cccceieeierierree 104 N-terminal methylation on RCC] is necessary for normal THÍÍOSÏS. cv LH HH xe, Ill N-terminal methylation likely facilitates RCC1 bind to DÌNÀ.

re 121 N-terminal tail of RCC1 alone binds chromatin in a N-terminal methylation dependent manner. 130 Constructs And aHfÌPOÏÌð$. HH TH TH HT 01111 HH go 130 Mass spectrometric analysis of RCC] modjficafiOH. các sọc HH 11211212 rrea 13] Tmmunofluorescence THỈCFOSCODD.

Ăn Là HH1 TT HH Ho ko TH TH Tà HỘ kg nh HH. 132 In vitro methylation ASSQV.ecccccsecccssssesessscieveseseiesesesececssnsesssecensaeneseneseucsdedeaeseneneesetecssusaaraneteresetenssberaees 133 Live cell imaging, fluorescence recovery after photobleaching, and fluorescence loss in PHOLODL CACHING oo eececscsssscscesesesenssessssesensscsneseaseasacsassscsaesssesesenseneaensecesseceuenssaeeesaeiauceasaanecaesasaeeteeseaeneeasaaeees 133 CHAPTER IV. GENERAL DISCUSSION 135 JAZ AND DSRNA BINDING PROTEINS 010777. 136 RCC1 AS A CHROMATIN MARKER \.cccssccsssssssscecesseccsssssncesesssesesaccesecsssasesseseseessceesscseeaesacecesssssseeseseeesteasstease 141 N-TERMINAL METHYLATION 2002127.

146 REFERENCE 149 Vill List of Figures FIGURE 1.1 NUCLEAR TRANSPORT SIGNALS.2 SCHEMATIC REPRESENTATION OF THE NUCLEAR PORE COMPLEX. A MODEL OF NUCLEAR IMPORT PATHWAY.1 110110901 vn ng ng ng ng 011012589 16 FIGURE 1.4 A MODEL OF NUCLEAR EXPORT PATHWAY. ong ng HH T4 Hàng 0101 ke 18 FIGURE 1.5 THE GUANINE NUCLEOTIDE CYCLE OF THE RAN OTPASE.90 101 tt H14 1 re23 FIGURE 1.6 A MODEL OF HOW THE RANGTP GRADIENT REGULATES SPINDLE FORMATION, .1 JAZ 1S ANUCLEOCYTOPLASMIC SHUTTLING PROTEIN.- G01 SH HH1 1n g0 1 11c42 FIGURE2.2 EXPORTIN-5 BINDS TO JAZ AND STIMULATES JAZ SHUTTLING IN INTACT CELLS. EXPORTIN-5 IS REQUIRED FOR JAZ SHUTTLING IN INTACT CELLS.4 EXP-5 MEDIATES EXPORT OF JAZ IN DIGITONIN-PERMEABILIZED CELLS.5 JAZ IS A BINDING PARTNER OF ILLE.

Q0 911 1 TH HH ng ng 44 15 T1 KH 1401 14 35 FIGURE2.6 JAZ INTERACTS WITH THE DSRNA BINDING DOMAINS (DSRBDS) OF ILF3.7 JAZ BINDS DIRECTLY TO ILF3, INDEPENDENTLY OF DSRNA.8 JAZ CAN INTERACT WITH ILF3 AND EXP-5 SIMULTANEOUSLY.9 CELLULAR LOCALIZATION OF DIFFERENT TRUNCATIONS OF JÁ Z.10 NUCLEAR IMPORT OF JAZ.ccccccscsscsssssessesseeccesseaesnesseeans secseteseeeee 69 FIGURE 2.11 JAZ IS IMPORTED INTO NUCLEI BY A NON-CLASSICAL PATHWAY. Gà HH HH 1418111 72 FIGURE 3.1 REPRESENTATION OF THE INTERACTION BETWEEN RCC1 AND CHROMATTM.2 RCCI N-TERMINAL METHYLATION. HH TH TH TT TH TT 1304001140 90 FIGURE 3.3 RCC1 N-TERMINAL PHOSPHORYLA TION. con HH H491 1g TH HH0 011031010314 1010101 1x9 92 FIGURE 3.4 IDENTIFICATION OF N-TERMINAL METHYLATION MOTIF.5 IDENTIFICATION OF œ-N-TERMINAL METHYLTRANSFERASE ACTIVITY.6 DETECTION OF ENDOGENOUS RCCI N-TERMINAL METHYLATION.7 METHYLATION OF RCC] REGULATES ITS INTERACTION WITH CHROMOSOMES.8 METHYLATION OF RCC1 REGULATES ITS INTERACTION WITH CHROMOSOMES IN LIVE CELLS.9 METHYLATION OF RCCI IS REQUIRED FOR CORRECT SPINDLE ASSEMBLY AND CHROMOSOME SEGREGATHION.10 ‘TIME-LAPSE IMAGES OF NORMAL AND DEFECTIVE MITOSIS.ccsscsecsssessesceeessaseesessesssesenessescanes 115 TABLE 1, QUANTIFICATION OF MITOTIC DEFECTS IN TRANSFECTED.11 TETHER RCC1 TO CHROMATIN BY FUSION TO HISTONE H2A.12 METHYLATION OF RCC] FACILITATES ITS INTERACTION WITH DNA.13 METHYLATION PROMOTES BINDING OF THE RCC1 TAIL TO MITOTIC CHROMOSOMES IN LIVING UNFIXED MDCK CELLS.

MODEL FOR RCC1 INTERACTION WITH NUCLEOSOME. HH H010 110 n0 ko 128 List of Abbreviations Abbreviation Meaning A Alanine ATP Adenosine 5’-Triphosphate BIB Beta-Like Import Receptor Binding Domain bp Base Pair BSA Bovine-Serum Albumin Cysteine Aspartate Da Dalton DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole DHCC 3,3’-dihexyloxacarbocyanine DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DNA Deoxyribonucleic Acid DTT Dithiothreitol Glutamate EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid Phenylalanine FITC Fluoroscein Isothiocyanate Glycine GDP Guanosince 5’-Diphosphate xi GEF Guanine Nucleotide Exchange Factor GFP Green Fluorescent Protein GGNLS GST-GFP-NLS GlcNAc N-acetylglucosamine GppNHp 5’-Guanylylimidodiphosphate GST Glutathione-S-Transferase GTP Guanosine 5’-Triphosphate H Histidine HEPES N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N’-(2- ethanesulfonic Acid) His, Six-Histidine Tag; Sequence: HHHHHH hnRNP Heterogeneuos Nuclear Ribonucleoparticle protein I Isoleucine IgG Immunoglobulin-y IPTG Isopropylthio-B-D-galactoside Lysine kilo- KCl Potassium Chloride hnRNP K Nuclear Shuttling Signal KOAc Potassium Acetate Kerr Dissociation Rate Constant xii KOH Potassium Hydroxide L Leucine M Methionne MDa Megadalton MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase MeOH Methanol MEK Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase MgCl, Magnesium Chloride MgOAc Magnesium Acetate yg, pl, or ym Microgram, Microliter or Micrometer ml or mg Milliliter or Milligram min Minute MOPS 3-(N-morpholino)propanesulfonic Acid mRNA Messenger RNA | N Asparagine n nano NaCl Sodium Chloride NES Nuclear Export Signal NF-AT Nuclear Factor of Activated T-Cells NLS Nuclear Localization Signal NPC Nuclear Pore Complex NpIC Nucleoplasmin Core Domain xiii NH,-Terminal Domain Nup Nucleoporin Proline PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis PBS Phosphate-Buffered Saline PFA Paraformaldehyde Isoelectric Point PKA cAMP-Dependent Protein Kinase PKI PKA Inhibitor PMSF Phenylmethylsulfonyl Fluoride Q Glutamine R Arginine Ran Ras-like Nuclear Protein RanBP1, RanBP2, RanBP3 Ran-Binding Protein 1, 2, or 3 RBD Ran-Binding Domain RCCI Regulator of Chromosome Condensation 1 Rabbit Reticulcyte Lysate Ribonucleic Acid Ribonucleoparticle rRNA Ribosomal RNA Serine SDS Sodium Dodecyl Sulfate XIV SV40 Simian Virus 40 Threonine TBE Tris-Borate-EDTA TCA Trichlroroacetic Acid TMRM Tetramethylrhodamine-5-Maleimide TR Texas Red Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane tRNA Transfer RNA TX-100 Triton X-100 Unit Valine Tryptophan WGA Wheat Germ Agglutinin wt Wild-Type Tyrosine IgG-Binding Domain from Protein A Chapter I. General Introduction RanG TP and nuclear transport One of the defining features of a eukaryotic cell is the possession of a nuclear envelope. The nuclear envelope is a continuous double membrane structure that spatially and temporally separates DNA replication and transcription from protein synthesis.