Nghiên Cứu Phương Pháp Xác Định Vi Khuẩn Bacillus Thuringiensis Trong Chế Phẩm Sinh Học Bio-B

Nghiên cứu phương pháp xác định vi khuẩn Bacillus thuringiensis trong chế phẩm sinh học Bio B, góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng.

• Tác giả: Đặng Trung Quân
• Người hướng dẫn: TS. Ninh Thị Thảo
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phương Pháp Xác Định Bacillus Thuringiensis Trong Chế Phẩm Sinh Học Bio-B
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. LỜI CAM ĐOAN
• 1.2. DANH MỤC BẢNG
• 1.3. DANH MỤC HÌNH
• 1.4. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• 1.5. LỜI CẢM ƠN
• 1.6. Mục tiêu và yêu cầu
• 1.7. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.7.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus thuringiensis
• 1.7.2. Lịch sử phát hiện và khám phá
• 1.7.3. Đặc điểm hình thái
• 1.7.4. Đặc điểm sinh hóa
• 1.7.5. Độc tố và cơ chế gây độc của Bacillus thuringiensis
• 1.7.6. Phân loại gen sinh độc tố
• 1.7.7. Ứng dụng của các chế phẩm sinh học của Bacillus thuringiensis
• 1.7.8. Các phương pháp nghiên cứu xác định Bacillus thuringiensis
• 1.7.9. Giới thiệu sản phẩm sinh học “Bio B”
• 1.8. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 1.8.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 1.8.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 1.8.2.1. Nội dung 1: Phân lập Bacillus thuringiensis từ chế phẩm sinh học “Bio B”
• 1.8.2.2. Nội dung 2: Đánh giá các đặc điểm hình thái và sinh hoá của các mẫu vi khuẩn Bt giả định phân lập từ chế phẩm “Bio B”
• 1.8.2.3. Nội dung 3: Định danh vi khuẩn Bt giả định bằng phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu
• 1.8.2.4. Nội dung 4: Thiết lập phản ứng PCR khuẩn lạc cho vi khuẩn Bt
• 1.8.3. Định lượng và hóa chất
• 1.9. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.9.1. Phân lập Bacillus thuringiensis từ chế phẩm “Bio B”
• 1.9.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến kết quả phân lập vi khuẩn Bt
• 1.9.3. Ảnh hưởng của nồng độ pha loãng mẫu thử đến kết quả phân lập vi khuẩn Bt
• 1.9.4. Xác định vi khuẩn Bt phân lập dựa vào đặc điểm hình thái
• 1.9.4.1. Hình thái khuẩn lạc
• 1.9.4.2. Hình thái tế bào
• 1.9.4.3. Thử nghiệm catalase
• 1.9.5. Định danh vi khuẩn Bt phân lập bằng phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu
• 1.9.6. Thiết lập phản ứng PCR khuẩn lạc cho vi khuẩn Bt
• 1.10. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phương Pháp Xác Định Bacillus Thuringiensis Trong Chế Phẩm Sinh Học Bio B

Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) là một trong những vi sinh vật quan trọng trong nông nghiệp, đặc biệt trong việc phát triển các chế phẩm sinh học như Bio-B. Phương pháp xác định Bt trong chế phẩm này không chỉ giúp đảm bảo chất lượng sản phẩm mà còn hỗ trợ trong việc kiểm soát dịch hại hiệu quả. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp xác định chính xác vi khuẩn Bt là cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chế phẩm sinh học trong nông nghiệp.

1.1. Giới Thiệu Về Bacillus Thuringiensis Và Chế Phẩm Bio B

Bacillus thuringiensis là vi khuẩn Gram dương, có khả năng sản sinh độc tố diệt côn trùng. Chế phẩm Bio-B chứa Bt được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp nhờ tính an toàn và hiệu quả cao trong việc kiểm soát sâu bệnh.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Việc Xác Định Bacillus Thuringiensis

Việc xác định chính xác Bacillus thuringiensis trong chế phẩm sinh học là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả diệt côn trùng và an toàn cho môi trường. Điều này giúp nông dân yên tâm hơn khi sử dụng sản phẩm.

II. Những Thách Thức Trong Việc Xác Định Bacillus Thuringiensis

Mặc dù Bacillus thuringiensis có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, nhưng việc xác định chính xác vi khuẩn này trong chế phẩm sinh học vẫn gặp nhiều thách thức. Các phương pháp hiện tại có thể không đủ nhạy hoặc không thể phân biệt giữa các chủng khác nhau của Bt.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Phân Lập Vi Khuẩn Bt

Quá trình phân lập Bacillus thuringiensis từ chế phẩm sinh học có thể gặp khó khăn do sự hiện diện của các vi sinh vật khác. Điều này đòi hỏi các phương pháp phân lập phải được tối ưu hóa để đạt được kết quả chính xác.

2.2. Độ Nhạy Của Các Phương Pháp Xác Định

Nhiều phương pháp hiện tại có thể không đủ nhạy để phát hiện nồng độ thấp của Bacillus thuringiensis trong chế phẩm sinh học. Việc cải thiện độ nhạy của các phương pháp này là cần thiết để đảm bảo kết quả chính xác.

III. Phương Pháp Xác Định Bacillus Thuringiensis Trong Chế Phẩm Bio B

Để xác định Bacillus thuringiensis trong chế phẩm sinh học Bio-B, nhiều phương pháp khác nhau đã được nghiên cứu và áp dụng. Các phương pháp này bao gồm phân lập vi khuẩn, đánh giá đặc điểm hình thái và sinh hóa, cũng như sử dụng kỹ thuật PCR.

3.1. Phân Lập Vi Khuẩn Bt Từ Chế Phẩm Bio B

Quá trình phân lập Bacillus thuringiensis từ chế phẩm Bio-B được thực hiện thông qua các phương pháp nuôi cấy chọn lọc. Điều này giúp tách biệt vi khuẩn Bt khỏi các vi sinh vật khác có trong chế phẩm.

3.2. Đánh Giá Đặc Điểm Hình Thái Và Sinh Hóa

Đặc điểm hình thái và sinh hóa của Bacillus thuringiensis được đánh giá thông qua các thử nghiệm như nhuộm Gram và thử nghiệm catalase. Những đặc điểm này giúp xác định chính xác vi khuẩn Bt.

3.3. Sử Dụng Phương Pháp PCR Để Định Danh Vi Khuẩn Bt

Phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để định danh Bacillus thuringiensis. Kỹ thuật này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của vi khuẩn Bt trong chế phẩm sinh học.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Phương Pháp Xác Định Bacillus Thuringiensis

Việc xác định Bacillus thuringiensis trong chế phẩm sinh học Bio-B không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có ứng dụng thực tiễn trong nông nghiệp. Các phương pháp xác định chính xác giúp nâng cao hiệu quả sử dụng chế phẩm sinh học và bảo vệ môi trường.

4.1. Tăng Cường Hiệu Quả Kiểm Soát Dịch Hại

Việc xác định chính xác Bacillus thuringiensis giúp nông dân sử dụng chế phẩm Bio-B một cách hiệu quả hơn, từ đó nâng cao năng suất cây trồng và giảm thiểu thiệt hại do sâu bệnh.

4.2. Đảm Bảo An Toàn Thực Phẩm

Sử dụng chế phẩm sinh học chứa Bacillus thuringiensis giúp giảm thiểu dư lượng hóa chất độc hại trên nông sản, từ đó đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.

V. Kết Luận Về Phương Pháp Xác Định Bacillus Thuringiensis

Phương pháp xác định Bacillus thuringiensis trong chế phẩm sinh học Bio-B là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng. Việc phát triển và tối ưu hóa các phương pháp này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả sử dụng chế phẩm mà còn góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Về Bacillus Thuringiensis

Nghiên cứu về Bacillus thuringiensis sẽ tiếp tục phát triển, với mục tiêu cải thiện các phương pháp xác định và mở rộng ứng dụng của vi khuẩn này trong nông nghiệp.

5.2. Khuyến Khích Sử Dụng Chế Phẩm Sinh Học

Khuyến khích nông dân sử dụng chế phẩm sinh học chứa Bacillus thuringiensis như một giải pháp thay thế an toàn và hiệu quả cho thuốc trừ sâu hóa học, từ đó thúc đẩy nền nông nghiệp bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------- ------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC “BIO-B” Hà Nội – 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -------------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC “BIO-B” Họ Tên : Đặng Trung Quân Lớp : K63CNSHD Mã sinh viên : 637351 Khoa : Công nghệ sinh học Giáo viên hướng dẫn : TS Ninh Thị Thảo Hà Nội – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây toàn bộ là kết quả nghiên cứu do tôi thực hiện. Số liệu và kết quả trong khóa luận này là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn đều được ghi rõ nguồn gốc và mọi sự giúp đỡ đều được cảm ơn. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực hiện, Đặng Trung Quân i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.

ii DANH MỤC BẢNG. iv DANH MỤC HÌNH. v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT. vi LỜI CẢM ƠN.

Mục tiêu và yêu cầu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Lịch sử phát hiện và khám phá.

Đặc điểm hình thái. Đặc điểm sinh hóa. Độc tố và cơ chế gây độc của Bacillus thuringiensis. Phân loại gen sinh độc tố.

Ứng dụng của các chế phẩm sinh học của Bacillus thuringiensis. Các phương pháp nghiên cứu xác định Bacillus thuringiensis. Giới thiệu sản phẩm sinh học “Bio B”. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Nội dung và phương pháp nghiên cứu. Nội dung 1: Phân lập Bacillus thuringiensis từ chế phẩm sinh học “Bio B”. Nội dung 2: Đánh giá các đặc điểm hình thái và sinh hoá của các mẫu vi khuẩn Bt giả định phân lập từ chế phẩm “Bio B”.

Nội dung 3: Định danh vi khuẩn Bt giả định bằng phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. Nội dung 4: Thiết lập phản ứng PCR khuẩn lạc cho vi khuẩn Bt. Định lượng và hóa chất. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

Phân lập Bacillus thuringiensis từ chế phẩm “Bio B”. Ảnh hưởng của tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến kết quả phân lập vi khuẩn Bt. Ảnh hưởng của nồng độ pha loãng mẫu thử đến kết quả phân lập vi khuẩn Bt. Xác định vi khuẩn Bt phân lập dựa vào đặc điểm hình thái.

Hình thái khuẩn lạc. Hình thái tế bào. Thử nghiệm catalase. Định danh vi khuẩn Bt phân lập bằng phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu.

Thiết lập phản ứng PCR khuẩn lạc cho vi khuẩn Bt. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 44 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.

Phân loại của các gen Bt. Các mồi PCR được sử dụng trong nghiên cứu. Ảnh hưởng của tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến sự phát triển của vi khuẩn sau 18h nuôi cấy. Ảnh hưởng của độ pha loãng mẫu đến sự phát triển của vi khuẩn sau 18h nuôi cấy.

Mật độ khuẩn lạc có hình thái đặc trưng của chế phẩm sinh học “Bio B”.4: Đặc điểm hình thái của các chủng phân lập. Kết quả thử nghiệm sinh hóa trên chủng phân lập giả định “BT” so với chủng chuẩn “4T1”. 37 iv DANH MỤC HÌNH Hình 2. Hình thái của khuẩn lạc Bacillus thuringiensis.

Ảnh hiển vi điện tử minh họa Bacillus thuringiensis var. Bào tử và tinh thể Bacillus thuringiensis. Tinh thể của Bacillus thuringiensis. Cơ chế hoạt động của Bacillus thuringiensis đối với sâu bướm Lepidoptera.

Hình tóm tắt vật chủ và độc tố của Bt δ-endotoxins (Cry and Cyt). Chế phẩm sinh học “Bio B”. Hình thái khuẩn lạc của các chủng Bt chuẩn và giả định. Kết quả nhuộm gram tế bào vi khuẩn quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 1000X.

Bào tử và tinh thể của vi khuẩn Bt quan sát dưới kính hiển vi ở ở độ phóng đại 1000X sau khi nhuộm với comassie. Kết quả phản ứng lecithinase. Kết quả phản ứng catalase. Kết quả phản ứng lên men sucrose.

Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen Cry. Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen GroEl. Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen Gyrb. Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen XRE.

Kết quả phản ứng PCR khuẩn lạc với quy trình 1, 2 và 3. 41 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Diễn giải chữ viết tắt Bt Bacillus thuringiensis CT Công thức DNA Deoxyribonucleic acid ICP Insecticidal crystal protein LB Luria Bertani Broth LD Lethal dose MYP Mannitol egg yolk polymyxin PCR Polymerase chain reaction vi LỜI CẢM ƠN Trong thời gian 6 tháng làm khoá luận tốt nghiệp tại Khoa Công nghệ Sinh học Thực vật – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, được sự quan tâm giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các Thầy Cô giáo, các cán bộ, anh chị tại phòng thí nghiệm của khoa và nhóm sinh viên nghiên cứu cùng với sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã có cơ hội củng cố và rèn luyện kiến thức cũng như kỹ năng học tập để có thể hoàn thành tốt khoá luận của mình. Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới thầy, cô giáo TS. Ninh Thị Thảo đã hỗ trợ tôi hoàn thành luận văn bằng sự kiên nhẫn và kiến thức của mình.

Hơn nữa, sự hướng dẫn của cô đã giúp đỡ tôi trong thời gian viết luận văn này. Thứ hai, tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học, đặc biệt là Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật. Thầy/cô đã cung cấp những kiến thức khoa học cũng như kỹ thuật hữu ích cho tôi. Đây là một trong những điều quan trọng nhất giúp tôi thực hiện thành công khóa luận của mình.

Tôi muốn cảm ơn những người bạn đồng hành trong phòng thí nghiệm của tôi vì sự hỗ trợ đáng kể của mọi người. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè và người thân trong gia đình đã luôn động viên, cổ vũ tinh thần và giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực hiện, Đặng Trung Quân vii TÓM TẮT Hiện nay, Bacillus thuringiensis (Bt) là một trong những loài vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất để kiểm soát côn trùng gây hại trong nhiều chế phẩm sinh học, tạo ra nhiều loại độc tố khác nhau trong quá trình phát triển của chúng: 3 ngoại độc tố và 1 nội độc tố. Ngoại độc tố α, ngoại độc tố β (β-exotoxin), ngoại độc tố γ (γ- endotoxin) và nội độc tố (-endotoxin) có hoạt tính diệt côn trùng đặc hiệu.“Bio B” là một trong những chế phẩm sinh học có chứa Bacillus thuringiensis (Bt) có thể thay thế các loại thuốc hóa học vì những ưu điểm của chúng như tính đặc hiệu cao cho côn trùng mục tiêu, an toàn và đặc biệt là thân thiện với môi trường.

Trong đề tài này, chúng tôi đã tập trung vào việc nghiên cứu các phương pháp tiếp cận khác nhau bao gồm phân tích hình thái, đặc điểm sinh hóa và phân tử để xác định và định lượng Bt trong chế phẩm sinh học “Bio B”. Vi khuẩn Bt giả định được phân lập từ mẫu chế phẩm "Bio B" đều thể hiện đặc trưng về mặt hình thái khuẩn lạc, tế bào và bào tử của vi khuẩn Bt và tương tự như chủng chuẩn “4T1”. Hơn thế nữa, chủng Bt này cho phản ứng dương tính trong thử nghiệm lethicinase, sucrose và catalase. Ngoài ra, chúng tôi tính số khuẩn lạc dựa trên tỉ lệ 1:19 với nồng độ pha loãng trên mỗi tỉ lệ là 10-4 và 10-5, kết quả được làm tròn đến số nguyên gần nhất (4,1x108).

Kết quả cho thấy, tổng số vi khuẩn Bt trong chế phẩm sinh học “Bio B” là phù hợp với thông tin của nhà sản xuất. Sự hiện diện của bốn gen của Bt bao gồm XRE (gen điều hòa phiên mã), GroEL (gen protein chaperonin), GyrB (gen enzyme topoisomerase) và Cry2 (gen protein tinh thể) trong mẫu Bt phân lập đã được kiểm tra bằng PCR cách sử dụng mồi đặc hiệu cụ thể. Kết quả cho thấy các băng ADN đặc thù tương ứng với gen mục tiêu: XRE (~ 246 bp), GroEL (~600 bp), GyrB (~ 221 bp), Cry2 (~ 700 bp) đều quan sát được ở mẫu Bt phân lập. Ngoài ra, chúng tôi thiết lập được phản ứng PCR khuẩn lạc để định danh vi khuẩn Bt bằng phương pháp PCR.

viii Do đó, chúng tôi kết luận rằng có thể sử dụng các phương pháp phân tích về mặt hình thái, đặc điểm sinh hóa và phân tử có thể sử dụng kết hợp để phân lập và xác định vi khuẩn Bacillus thuringiensis trong chế phẩm “Bio B”. Lời nói đầu Từ thời xa xưa, ngành nông nghiệp đã phải đối mặt với sự tàn phá của nhiều loài dịch hại như nấm, cỏ dại và côn trùng, dẫn đến làm giảm đáng kể sản lượng nông nghiệp. Dịch hại không ngừng được du nhập vào các khu vực mới một cách tự nhiên hay tình cờ hoặc trong một số trường hợp, các sinh vật vô tình lại trở thành dịch hại. Các hoạt động thương mại toàn cầu đã làm gia tăng số lượng các loài dịch hại phi bản địa xâm lấn tại các khu vực mới và việc kiểm soát các loài xâm lấn này là thách thức lớn trên toàn thế giới.

Ngành nông nghiệp có vai trò quan trọng để duy trì hệ thống kinh tế, xã hội và môi trường toàn cầu. Nhưng vấn đề đặt ra là làm sao để vừa tạo ra các sản phẩm nông nghiệp thân thiện với môi trường vừa đảm bảo năng suất và chất lượng nông sản. Các biện pháp hóa học để bảo vệ cây trồng chiếm lĩnh vị trí hàng đầu trong hoạt động kiểm soát dịch hại tổng hợp và các bệnh của cây trồng. Nhưng thuốc trừ sâu lại gây tác hại đến con người và môi trường.

Mặc dù thuốc trừ sâu hóa học đã được sử dụng nhiều năm qua để kiểm soát dịch hại, nhưng một số yếu tố đang đe dọa hiệu quả của thuốc cũng như việc sử dụng liên tục loại thuốc này, đó là sự phát triển khả năng kháng thuốc và quy định ngừng sử dụng hoặc hủy đăng ký một số loại thuốc trừ sâu do lo ngại đến sức khỏe con người và môi trường. Do đó, việc tìm ra giải pháp thay thế thân thiện sinh học là yêu cầu cấp thiết. Phát triển thuốc trừ sâu sinh học có hiệu quả, phân hủy sinh học và thân thiện với môi trường là một hướng đi phù hợp.