Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định 5 hydroxymethylfurfural trong thuốc nước ngọt bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ min

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định 5 hydroxymethylfurfural trong thuốc nước ngọt bằng phương, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Tào Thị Phương
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Thị Thanh Hà
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất
• Đề tài: Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định 5-Hydroxymethylfurfural trong thuốc, nước ngọt bằng phương pháp sắc ký khí - khối phổ
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ 5-HMF
• 1.1. Cấu trúc và công thức cấu tạo
• 1.2. Tính chất vật lý
• 1.3. Tính chất hoá học
• 1.4. Quá trình chuyển hoá và độc tính của 5-HMF
• 1.5. Một số phương pháp định lượng 5-HMF
• 1.6. Phương pháp sắc ký khí khối phổ
• 1.6.1. Đại cương về sắc ký khí
• 1.6.2. Detector khối phổ
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hoá chất và thiết bị
• 2.2.1. Hoá chất, dung môi
• 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Lấy mẫu và xử lý mẫu
• 2.4.2. Xây dựng phương pháp phân tích
• 2.4.3. Thẩm định phương pháp định lượng 5-HMF trong thuốc, nước ngọt bằng GC-MS
• 2.4.4. Bước đầu áp dụng phương pháp khảo sát một số mẫu thực tế
• 2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về 5 Hydroxymethylfurfural 5 HMF

5-Hydroxymethylfurfural (5-HMF) là một hợp chất hữu cơ được hình thành từ quá trình chuyển hóa đường trong thực phẩm và dược phẩm. Nó thường xuất hiện trong các sản phẩm như thuốc nước ngọt, mật ong, và nước ép trái cây. 5-HMF có thể gây kích ứng đường hô hấp, da, và niêm mạc, đồng thời có khả năng thúc đẩy sự phát triển của các khối u. Việc xác định chính xác hàm lượng 5-HMF là cần thiết để đảm bảo chất lượng thực phẩm và an toàn sức khỏe.

1.1. Cấu trúc và tính chất của 5 HMF

5-HMF có công thức cấu tạo C6H6O3, với nhóm hydroxymethyl và formyl. Nó tồn tại dạng tinh thể hoặc chất lỏng màu vàng, tan trong nước và các dung môi hữu cơ. 5-HMF có nhiệt độ sôi khoảng 110-116°C và cực đại hấp thụ ở bước sóng 283 nm. Tính chất hóa học của 5-HMF bao gồm khả năng tham gia phản ứng khử và oxy hóa, làm nó trở thành một hợp chất quan trọng trong phân tích hóa học.

1.2. Độc tính và quá trình chuyển hóa

5-HMF có thể chuyển hóa thành các chất độc hại như 5-sulfoxymethylfurfural (SMF), gây đột biến và ung thư. Quá trình chuyển hóa của 5-HMF trong cơ thể bao gồm sự hình thành acid 5-hydroxymethyl-2-furanoic (HMFA) và N-(5-hydroxymethyl-2-furoyl)glycin (HMFG). Các nghiên cứu cho thấy 5-HMF có độc tính cao ở liều lượng lớn, gây rối loạn chức năng gan và tăng nguy cơ ung thư.

II. Phương pháp xác định 5 HMF bằng sắc ký khí khối phổ

Sắc ký khí khối phổ (GC-MS) là phương pháp hiện đại để xác định 5-HMF trong các mẫu thuốc nước ngọt. Phương pháp này kết hợp sắc ký khí (GC) và khối phổ (MS), cho phép phân tích định tính và định lượng với độ chính xác cao. GC-MS sử dụng khí trơ làm pha động, tách các chất dựa trên sự phân bố giữa pha tĩnh và pha động. Detector khối phổ giúp xác định khối lượng phân tử và cấu trúc của 5-HMF.

2.1. Nguyên lý hoạt động của GC MS

GC-MS hoạt động dựa trên nguyên lý tách các chất trong mẫu bằng cột sắc ký và phân tích khối lượng của chúng. Mẫu được tiêm vào buồng bay hơi, sau đó được dòng khí mang đưa qua cột. Các chất được tách dựa trên thời gian lưu và được ion hóa trong buồng ion hóa. Các ion được phân tích bằng bộ phận khối phổ, tạo ra phổ khối để định danh và định lượng 5-HMF.

2.2. Ưu điểm của GC MS

GC-MS có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp, và khả năng phân tích đồng thời nhiều chất. Phương pháp này không bị ảnh hưởng bởi các chất nền phức tạp, phù hợp để xác định 5-HMF trong thuốc nước ngọt. Ngoài ra, GC-MS cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử, giúp đảm bảo độ chính xác trong kiểm soát chất lượng.

III. Ứng dụng và ý nghĩa thực tiễn

Việc xác định 5-HMF bằng GC-MS có ý nghĩa quan trọng trong kiểm soát chất lượng thực phẩm và dược phẩm. Phương pháp này giúp phát hiện và định lượng chính xác 5-HMF, đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Ngoài ra, GC-MS còn được ứng dụng trong nghiên cứu hóa học thực phẩm và phân tích các chất độc hại trong thực phẩm.

3.1. Ứng dụng trong kiểm soát chất lượng

GC-MS được sử dụng rộng rãi trong kiểm soát chất lượng các sản phẩm thuốc nước ngọt. Phương pháp này giúp xác định hàm lượng 5-HMF một cách chính xác, đảm bảo sản phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh các quy định về chất lượng thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt.

3.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu khoa học

Nghiên cứu về 5-HMF và phương pháp xác định bằng GC-MS đóng góp vào sự phát triển của hóa học thực phẩm. Các kết quả nghiên cứu giúp hiểu rõ hơn về quá trình hình thành và độc tính của 5-HMF, từ đó đề xuất các biện pháp giảm thiểu nguy cơ trong sản xuất và bảo quản thực phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

5-Hydroxymethylfurfural (5-HMF) là một hợp chất chuyển hóa từ đường, xuất hiện phổ biến trong nhiều sản phẩm thực phẩm và dược phẩm như thuốc, thực phẩm chức năng và nước ngọt. Theo báo cáo của ngành, hàm lượng 5-HMF trong một số sản phẩm có thể lên đến 1 g/kg, gây ra những lo ngại về an toàn do độc tính và khả năng gây ung thư của hợp chất này. Nghiên cứu về 5-HMF ngày càng được quan tâm bởi tác động tiêu cực của nó đến sức khỏe con người, đặc biệt là khả năng kích thích đường hô hấp, da, niêm mạc và thúc đẩy sự phát triển của các khối u.

Mục tiêu chính của luận văn là xây dựng và thẩm định một phương pháp xác định 5-HMF trong thuốc, thực phẩm chức năng và nước ngọt bằng kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ (GC-MS) với độ nhạy và tính chọn lọc cao. Phạm vi nghiên cứu tập trung trên các mẫu thu thập tại quận Hoàn Kiếm, Hà Nội trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến tháng 2 năm 2016. Việc phát triển phương pháp này có ý nghĩa quan trọng trong kiểm nghiệm chất lượng thuốc và an toàn thực phẩm, góp phần nâng cao hiệu quả giám sát hàm lượng tạp chất độc hại trong các sản phẩm tiêu dùng phổ biến.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình phân tích hóa học hiện đại, trong đó:

• Lý thuyết sắc ký khí (GC): Phân tách các thành phần trong mẫu dựa trên sự phân bố giữa pha tĩnh (cột sắc ký) và pha động (khí mang). Sắc ký khí cho phép tách các hợp chất dễ bay hơi hoặc có thể biến đổi thành dạng bay hơi.

• Lý thuyết khối phổ (MS): Xác định cấu trúc và định lượng các hợp chất dựa trên khối lượng ion phân tử và các mảnh ion đặc trưng. Kỹ thuật MS sử dụng nguồn ion hóa va chạm điện tử (EI) và bộ phân tích khối tứ cực chập ba (Triple Quad) để tăng độ chọn lọc và độ nhạy.

• Khái niệm chính: 5-HMF, ion mẹ (m/z = 126), ion con (m/z = 97), năng lượng va chạm tối ưu (2 V), giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ đúng, độ chính xác, hệ số bất đối (AF), số đĩa lý thuyết (N).

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu thuốc, thực phẩm chức năng và nước ngọt được thu thập tại các cửa hàng, siêu thị và nhà thuốc trên địa bàn quận Hoàn Kiếm, Hà Nội.

• Phương pháp phân tích: Xây dựng phương pháp sắc ký khí kết nối khối phổ (GC-MS) với cột HP-5MS, khí mang heli, chế độ tiêm chia dòng 1:2, chương trình nhiệt độ cột được tối ưu hóa. Phân tích ion mẹ và ion con trong chế độ MRM để tăng độ chọn lọc.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu thực hiện trong năm 2016, với giai đoạn thu thập mẫu và phân tích từ tháng 1 đến tháng 2.

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: Lấy mẫu ngẫu nhiên từ thị trường, xử lý mẫu bằng pha loãng và lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi phân tích.

• Phương pháp xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm Agilent MassHunter và Microsoft Excel để tính toán các đặc trưng thống kê như độ lệch chuẩn tương đối (RSD), hệ số tương quan hồi quy tuyến tính (r), độ thu hồi và phân tích phương sai.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phổ khối và năng lượng va chạm tối ưu: Phổ khối của 5-HMF xác định ion mẹ m/z = 126 và ion con m/z = 97. Năng lượng va chạm 2 V cho cường độ tín hiệu ion con cao nhất, đảm bảo độ nhạy và chọn lọc trong phân tích.

2. Chương trình nhiệt độ và tốc độ khí mang: Chương trình nhiệt độ tối ưu là bắt đầu ở 50°C giữ 2 phút, tăng 10°C/phút đến 200°C, sau đó tăng 25°C/phút đến 295°C giữ 1 phút. Tốc độ khí mang 1 ml/phút cho sắc ký đồ có số đĩa lý thuyết cao (110,736) và hệ số bất đối gần 1, biểu thị pic sắc ký cân đối, sắc nét.

3. Thẩm định phương pháp: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic lần lượt là 0,07% và 0,45%, đáp ứng yêu cầu độ lặp lại. Giới hạn phát hiện (LOD) là 2 µg/ml, giới hạn định lượng (LOQ) là 10 µg/ml, cho thấy phương pháp có độ nhạy cao. Khoảng tuyến tính từ 200 µg/ml đến 800 µg/ml với hệ số tương quan r = 0,9987, chứng tỏ tính tuyến tính tốt.

4. Độ đúng và độ chính xác: Độ thu hồi nằm trong khoảng 97,95% đến 100,14%, RSD từ 2,76% đến 3,65%, phù hợp với tiêu chuẩn AOAC (độ thu hồi 90-107%, RSD ≤ 5,3%).

5. Ứng dụng thực tế: Phân tích 21 mẫu thực tế gồm thuốc, thực phẩm chức năng và nước ngọt cho thấy hàm lượng 5-HMF dao động từ khoảng 200 µg/ml đến hơn 1100 µg/ml, với sự ổn định nồng độ sau 1 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Thảo luận kết quả

Phổ khối và năng lượng va chạm được tối ưu giúp tăng độ nhạy và chọn lọc, giảm nhiễu nền, phù hợp với yêu cầu phân tích tạp chất trong mẫu phức tạp. Chương trình nhiệt độ và tốc độ khí mang được điều chỉnh để cân bằng giữa thời gian phân tích và chất lượng sắc ký, đảm bảo pic sắc ký sắc nét, tách biệt hoàn toàn với các tạp chất khác.

Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp GC-MS xây dựng có độ chính xác và độ đúng cao, giới hạn phát hiện thấp, phù hợp để áp dụng trong kiểm nghiệm thực tế. So sánh với các phương pháp đo quang và sắc ký lỏng hiệu năng cao trước đây, phương pháp này có ưu thế vượt trội về độ chọn lọc và độ nhạy, giảm thiểu ảnh hưởng của nền mẫu phức tạp.

Biểu đồ sắc ký và bảng số liệu thẩm định minh họa rõ ràng sự ổn định của hệ thống, tính đặc hiệu và độ tuyến tính của phương pháp. Kết quả phân tích mẫu thực tế chứng minh tính ứng dụng thực tiễn, góp phần nâng cao chất lượng kiểm nghiệm thuốc và an toàn thực phẩm.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai áp dụng phương pháp GC-MS trong kiểm nghiệm định kỳ: Các cơ quan kiểm nghiệm thuốc và an toàn thực phẩm nên áp dụng phương pháp này để giám sát hàm lượng 5-HMF, nhằm đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Thời gian thực hiện: trong vòng 6 tháng tới.

2. Đào tạo kỹ thuật viên và cán bộ phân tích: Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật sắc ký khí khối phổ và thẩm định phương pháp để nâng cao năng lực phân tích. Chủ thể thực hiện: các trường đại học, viện nghiên cứu, phòng kiểm nghiệm.

3. Mở rộng nghiên cứu ứng dụng cho các sản phẩm khác: Nghiên cứu áp dụng phương pháp cho các loại thực phẩm chức năng, mật ong, nước ép hoa quả để đánh giá mức độ 5-HMF trong đa dạng sản phẩm. Thời gian: 12 tháng.

4. Xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật và quy trình kiểm nghiệm: Đề xuất Bộ Y tế và Bộ Giáo dục ban hành tiêu chuẩn kỹ thuật về xác định 5-HMF bằng GC-MS, làm cơ sở pháp lý cho công tác kiểm nghiệm. Chủ thể thực hiện: các cơ quan quản lý nhà nước.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Cán bộ kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm: Nắm bắt phương pháp phân tích hiện đại, nâng cao hiệu quả kiểm soát chất lượng sản phẩm.

2. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Dược học, Hóa phân tích: Tham khảo quy trình xây dựng và thẩm định phương pháp sắc ký khí khối phổ, phục vụ nghiên cứu khoa học và học tập.

3. Cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm và dược phẩm: Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chính sách, tiêu chuẩn kỹ thuật và quy trình kiểm nghiệm.

4. Doanh nghiệp sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng: Áp dụng phương pháp để kiểm soát chất lượng nguyên liệu và sản phẩm cuối cùng, đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp GC-MS có ưu điểm gì so với phương pháp đo quang trong xác định 5-HMF?
   Phương pháp GC-MS có độ nhạy và tính chọn lọc cao hơn, giảm thiểu ảnh hưởng của các chất nền phức tạp, cho kết quả chính xác và đặc hiệu hơn. Ví dụ, phương pháp đo quang dễ bị nhiễu bởi các thành phần khác trong mẫu.

2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp này là bao nhiêu?
   LOD là 2 µg/ml và LOQ là 10 µg/ml, cho thấy phương pháp có khả năng phát hiện và định lượng 5-HMF ở nồng độ rất thấp, phù hợp với yêu cầu kiểm nghiệm.

3. Phương pháp này có thể áp dụng cho những loại mẫu nào?
   Phương pháp được áp dụng thành công cho thuốc, thực phẩm chức năng và nước ngọt, có thể mở rộng cho các sản phẩm chứa đường khác như mật ong, nước ép hoa quả.

4. Thời gian phân tích một mẫu bằng phương pháp GC-MS là bao lâu?
   Thời gian phân tích khoảng 21 phút cho mỗi mẫu, bao gồm giai đoạn tách sắc ký và phân tích khối phổ, cân bằng giữa độ chính xác và hiệu quả công việc.

5. Phương pháp có đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế không?
   Phương pháp thẩm định theo hướng dẫn của AOAC và ICH, đáp ứng các chỉ tiêu về độ đúng, độ chính xác, tính chọn lọc và độ nhạy, phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công phương pháp sắc ký khí - khối phổ (GC-MS) xác định 5-HMF trong thuốc, thực phẩm chức năng và nước ngọt với độ nhạy cao, tính chọn lọc tốt.
• Phương pháp có giới hạn phát hiện 2 µg/ml, giới hạn định lượng 10 µg/ml, khoảng tuyến tính rộng từ 200 đến 800 µg/ml.
• Độ đúng và độ chính xác của phương pháp đáp ứng yêu cầu AOAC với độ thu hồi 97,95-100,14% và RSD ≤ 3,65%.
• Ứng dụng thành công phương pháp phân tích trên các mẫu thực tế thu thập tại Hà Nội, cho kết quả ổn định sau 1 tháng bảo quản.
• Đề xuất triển khai áp dụng rộng rãi phương pháp trong kiểm nghiệm định kỳ, đào tạo nhân lực và xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật liên quan.

Next steps: Mở rộng nghiên cứu ứng dụng, đào tạo kỹ thuật viên, đề xuất tiêu chuẩn kiểm nghiệm.

Call-to-action: Các cơ quan kiểm nghiệm và doanh nghiệp sản xuất nên áp dụng phương pháp để nâng cao chất lượng sản phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. Tổng quan về 5-HMF 1. Cấu trúc và công thức cấu tạo [21] Công thức cấu tạo Hình 1. Công thức cấu tạo của 5-HMF 1.

Tính chất vật lý [29] - Khối lượng phân tử: M = 126,11 g. - Dạng tinh thể, chất lỏng màu vàng đậm hoặc dạng bột, có mùi hoa cúc. - Nhiệt độ sôi: Ở áp suất 0,002 mmHg sôi ở 110 oC; ở áp suất 1 mmHg sôi ở 114-116 oC. - Nhiệt độ nóng chảy: 31,5 oC.

- Độ tan: Tan trong nước, methanol, ethanol, aceton, ethyl acetat, dimethylformamid; tan được trong ether, benzen, cloroform; ít tan trong CCl4. - Cực đại hấp thụ: 283 nm 1. Tính chất hoá học [21] Trong phân tử 5-HMF có chứa nhóm hydroxymethyl nên mang đầy đủ tính chất hóa học của một alcol. Bên cạnh đó, 5-HMF cũng dễ tham gia phản ứng khử do có nhóm formyl.

Điều chế Quá trình phản ứng tạo 5-HMF là một quá trình phức tạp, nó trải qua các phản ứng isomer hoá, phản ứng loại nước, phản ứng tách và phản ứng ngưng tụ. 5-HMF được tổng hợp chủ yếu do quá trình mất nước của các phân tử monosacharid (glucose, fructose), disacharid hoặc polysacharid [21]. 3 Luan van thac si Haworth [15] là người đầu tiên đề cập đến cơ chế dehydrat hoá fructose để tạo 5-HMF. Sau đó, Kuster [19], [21] đã đưa ra hai con đường chuyển hoá của hexose thành 5-HMF: con đường a là quá trình chuyển đổi qua các hợp chất vòng trong khi con đường b lại thông qua các hợp chất mạch hở.

Phản ứng tổng hợp 5-HMF từ đường 1. Quá trình chuyển hoá và độc tính của 5-HMF Hầu hết các thực phẩm hoặc sản phẩm chứa đường đều có thể chứa 5- HMF với hàm lượng khác nhau. Đặc biệt có những sản phẩm có thể chứa 5- HMF với hàm lượng lên đến 1 g/kg. 5-HMF cũng được tìm thấy trong một số sản phẩm tự nhiên như mật ong, nước ép hoa quả [26].

a) Quá trình chuyển hoá của 5-HMF Để theo dõi quá trình chuyển hoá của 5-HMF người ta gắn đồng vị phóng xạ C14+ vào 5-HMF. Sau khi sử dụng, 5-HMF được hấp thu nhanh chóng, chuyển hóa và đào thải qua đường nước tiểu [5]. 5-HMF được chuyển thành acid 5-hydroxymethyl-2-furanoic (HMFA), sau đó HMFA kết hợp với glycin tạo N-(5-hydroxymethyl-2-furoyl)glycin (HMFG) – đây là sản phẩm chuyển hoá chính của 5-HMF, được đào thải chủ 4 Luan van thac si yếu qua đường nước tiểu. Ở cả chuột và người, tỷ lệ HMFA/HMFG giảm khi mà 5-HMF tăng và glycin tự do giảm, kết quả dẫn tới sự đào thải acid furoic (FA) hoặc 2,5-furandicarboxylic acid theo con đường thứ hai.

Người ta đã tìm thấy cả HMFA, HMFG và FDCA trong nước tiểu của chuột. Tuy nhiên khi cho chuột sử dụng nước quả mận khô thì chỉ tìm thấy HMFG, (5-carboxylic acid-2-furoyl) amino methan (CAFAM) mà không thấy có FDCA. Với những người sử dụng đến 3944 µmol (497 mg) HMF, sau 6h thu được 36,9 % HMFG; 4,2 % CAFG và 1,9% CAFGM so với hàm lượng 5-HMF ban đầu [5]. Quá trình chuyển hoá của 5-HMF Trong các quá trình chuyển hoá của 5-HMF thì quá trình quan trọng nhất là quá trình chuyển thành SMF dưới tác dụng của SULTs, đây là một chất có độc tính cao do tính ái điện tử của carbocation allyl.

Sự hình thành 5-SMF đã được nghiên cứu trên chuột FVB/N. Sau khi tiêm tĩnh mạch 793 µmol 5 Luan van thac si HMF/kg, thời gian bán thải của pha đầu và pha cuối là 1,7 và 2,8 phút. Nồng độ SMF đạt cực đại sau 2,5 phút. Có khoảng 452 đến 551 ppm 5-HMF được chuyển thành SMF [5].

b) Độc tính Trong nghiên cứu của Edoardo Capuano và Vincenzo Fogliano [9] đã chỉ ra rằng ở liều cao cho thấy 5-HMF có độc tính, nó có tác dụng kích thích thị giác, kích thích đường hô hấp, da và niêm mạc.