Chương 1. Tổng quan về 5-HMF 1. Cấu trúc và công thức cấu tạo [21] Công thức cấu tạo Hình 1. Công thức cấu tạo của 5-HMF 1.
Tính chất vật lý [29] - Khối lượng phân tử: M = 126,11 g. - Dạng tinh thể, chất lỏng màu vàng đậm hoặc dạng bột, có mùi hoa cúc. - Nhiệt độ sôi: Ở áp suất 0,002 mmHg sôi ở 110 oC; ở áp suất 1 mmHg sôi ở 114-116 oC. - Nhiệt độ nóng chảy: 31,5 oC.
- Độ tan: Tan trong nước, methanol, ethanol, aceton, ethyl acetat, dimethylformamid; tan được trong ether, benzen, cloroform; ít tan trong CCl4. - Cực đại hấp thụ: 283 nm 1. Tính chất hoá học [21] Trong phân tử 5-HMF có chứa nhóm hydroxymethyl nên mang đầy đủ tính chất hóa học của một alcol. Bên cạnh đó, 5-HMF cũng dễ tham gia phản ứng khử do có nhóm formyl.
Điều chế Quá trình phản ứng tạo 5-HMF là một quá trình phức tạp, nó trải qua các phản ứng isomer hoá, phản ứng loại nước, phản ứng tách và phản ứng ngưng tụ. 5-HMF được tổng hợp chủ yếu do quá trình mất nước của các phân tử monosacharid (glucose, fructose), disacharid hoặc polysacharid [21]. 3 Luan van thac si Haworth [15] là người đầu tiên đề cập đến cơ chế dehydrat hoá fructose để tạo 5-HMF. Sau đó, Kuster [19], [21] đã đưa ra hai con đường chuyển hoá của hexose thành 5-HMF: con đường a là quá trình chuyển đổi qua các hợp chất vòng trong khi con đường b lại thông qua các hợp chất mạch hở.
Phản ứng tổng hợp 5-HMF từ đường 1. Quá trình chuyển hoá và độc tính của 5-HMF Hầu hết các thực phẩm hoặc sản phẩm chứa đường đều có thể chứa 5- HMF với hàm lượng khác nhau. Đặc biệt có những sản phẩm có thể chứa 5- HMF với hàm lượng lên đến 1 g/kg. 5-HMF cũng được tìm thấy trong một số sản phẩm tự nhiên như mật ong, nước ép hoa quả [26].
a) Quá trình chuyển hoá của 5-HMF Để theo dõi quá trình chuyển hoá của 5-HMF người ta gắn đồng vị phóng xạ C14+ vào 5-HMF. Sau khi sử dụng, 5-HMF được hấp thu nhanh chóng, chuyển hóa và đào thải qua đường nước tiểu [5]. 5-HMF được chuyển thành acid 5-hydroxymethyl-2-furanoic (HMFA), sau đó HMFA kết hợp với glycin tạo N-(5-hydroxymethyl-2-furoyl)glycin (HMFG) – đây là sản phẩm chuyển hoá chính của 5-HMF, được đào thải chủ 4 Luan van thac si yếu qua đường nước tiểu. Ở cả chuột và người, tỷ lệ HMFA/HMFG giảm khi mà 5-HMF tăng và glycin tự do giảm, kết quả dẫn tới sự đào thải acid furoic (FA) hoặc 2,5-furandicarboxylic acid theo con đường thứ hai.
Người ta đã tìm thấy cả HMFA, HMFG và FDCA trong nước tiểu của chuột. Tuy nhiên khi cho chuột sử dụng nước quả mận khô thì chỉ tìm thấy HMFG, (5-carboxylic acid-2-furoyl) amino methan (CAFAM) mà không thấy có FDCA. Với những người sử dụng đến 3944 µmol (497 mg) HMF, sau 6h thu được 36,9 % HMFG; 4,2 % CAFG và 1,9% CAFGM so với hàm lượng 5-HMF ban đầu [5]. Quá trình chuyển hoá của 5-HMF Trong các quá trình chuyển hoá của 5-HMF thì quá trình quan trọng nhất là quá trình chuyển thành SMF dưới tác dụng của SULTs, đây là một chất có độc tính cao do tính ái điện tử của carbocation allyl.
Sự hình thành 5-SMF đã được nghiên cứu trên chuột FVB/N. Sau khi tiêm tĩnh mạch 793 µmol 5 Luan van thac si HMF/kg, thời gian bán thải của pha đầu và pha cuối là 1,7 và 2,8 phút. Nồng độ SMF đạt cực đại sau 2,5 phút. Có khoảng 452 đến 551 ppm 5-HMF được chuyển thành SMF [5].
b) Độc tính Trong nghiên cứu của Edoardo Capuano và Vincenzo Fogliano [9] đã chỉ ra rằng ở liều cao cho thấy 5-HMF có độc tính, nó có tác dụng kích thích thị giác, kích thích đường hô hấp, da và niêm mạc. Đối với chuột, khi sử dụng đường uống, LD50= 3,1 g/kg. Trong một nghiên cứu khác, đối với chuột cái LD50= 2,5 g/kg còn đối với chuột đực thì LD50= 2,5-5,0 g/kg. Khi nghiên cứu về tác dụng gây ung thư của 5-HMF, Archer và cộng sự đã chứng minh được rằng 5-HMF có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của khối u và các tổn thương trong chuột.
Gần đây, một số báo cáo cho thấy rằng 5- HMF là một yếu tố có thể gây ung thư đối với chuộc thí nghiệm. 5-HMF làm tăng tỷ lệ mắc u gan đối với chuột cái B6C3F1 khi sử dụng liều 188 và 375 mg/kg [7]. Trong quá trình nghiên cứu cho thấy, trong cơ thể, 5-HMF được chuyển thành SMF dưới tác dụng của SULT1A1. Đây là một chất có độc tính mạnh hơn 5-HMF do có nhóm sulfat ở vị trí allylic có thể dễ dàng bị cắt tạo electropin, một chất gây ảnh hưởng tới protein và ADN [31].
Năm 1984, Ulbricht và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu trên chuột cống thu được LD50= 3100 mg/kg, trong khi với chuột nhắt thì LD50= 1910 mg/kg. Khi cho chuột sử dụng liều 310 mg/kg/ngày trong 2 tháng dẫn đến sự rối loạn chức năng gan, thay đổi tỷ lệ protein huyết tương, làm tăng men gan tributyrinase, tăng hoạt tính của một số men trong đường ruột như phosphomonoesterase và enterokinase [34]. Một số nghiên cứu in vitro trên tế bào của một số động vật có vú và một số loài chim cho thấy, với mức liều 1,0 mg/ml đã có thể gây ức chế quá trình tăng trưởng tế bào. 6 Luan van thac si Trong nghiên cứu dài hạn, khi sử dụng liều 0, 40, 80 và 160 mg mỗi ngày, mỗi tuần sử dụng 6 ngày trong vòng 11 tháng.
Kết quả cho thấy, chuyển hoá protein, lipid, nồng độ acid ascorbic và hoạt động của succinat dehydrogenase không thay đổi. Tuy nhiên với nồng độ 160 mg/kg đã có sự thay đổi một số thông số lâm sàng như: tăng nồng độ γ-globulin, tăng hoạt tính của tributyrinase, tăng khối lượng lách [34]. 7 Luan van thac si 1. Một số phương pháp định lượng HMF Trên thực tế đã có nhiều nghiên cứu định lượng 5-HMF trong một số sản phẩm khác nhau.
Có thể tóm tắt các phương pháp nghiên cứu trong các bảng sau: Bảng 1.1: Một số nghiên cứu bằng phương pháp đo quang STT Mẫu phân tích Thuốc thử Bước sóng TLTK 1 Mật ong p-toluidin 550 nm [25] 2 Siro và mật ong p-toluidin 550 nm [20] Bảng 1.2 : Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ STT Mẫu Cột Pha động TLTK 1 Thực phẩm - Acid acetic 0,01 mM [14] RP 100 2 Nước tiểu MeOH : H2O (5:95) [24] (55x2mm;3µm) 8 Luan van thac si Bảng 1.3: Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Bước sóng STT Mẫu phân tích Cột sắc ký Pha động TLTK (nm) XBridge C18 A: H2O : ACN: acid percloric (97:3:0,01) 1 Mật ong, nước ngọt 280 [12] (250x4,6mm;5µm) B: ACN: acid percloric (100:0,1) RP-18 2 Mật ong Dd acid acetic 1% : ACN (90:10) 285 [11] (125x4mm,5µm) Mật ong, nước giải 3 C18 (5µm) Acid acetic 5% : MeOH (80:20) 285 [23] khát RP-18 LiChcrosphere 4 Đường H2O : MeOH (9:1) 285 [17] (250x4mm; 10µm) C18 5 Thực phẩm H2O : MeOH (9:1) 285 [35] (150x3,9mm; 4µm) C18 6 Thực phẩm Dd acid acetic 1% : ACN (95:5) 284 [33] (250x4,6mm;5µm) 9 Luan van thac si Synergy Fusion A: H2O : ACN (70:30) 7 Mật ong 263** [36] (75x4,6mm; 4µm) B: ACN 100% Star PR-18 8 Thực phẩm H2O:MeOH (92:8) 284 [8] (250x4,6mm;5µm) HPX-87H 9 Glucose Acid H2SO4 5Mm - [37] (300x7,8mm) XBP-C18 10 Thực phẩm MeOH:H2O (5:95) 284 [38] (250x4,6mm;5µm) ODS 11 Thực phẩm Natri acetat 0,04M : MeOH (70:30) - [28] (250x4,6mm;5µm) Ghi chú: **: sau khi dẫn xuất hóa 10 Luan van thac si Bảng 1.4 : Một số nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ Khí STT Cột sắc ký CTNĐ TLTK mang Nhiệt độ tiêm 250oC, DB5 1 - Lúc đầu 37oC, giữ 2 phút, sau đó tăng 30 oC/phút đến 100 oC, rồi [22] (50mx0,2mm;0,33µm) tăng đến 250 oC với tốc độ 8 oC/phút, giữ 5 phút Nhiệt độ tiêm 250oC. ZB-Wax 2 - Nhiệt độ ban đầu 150oC, sau tăng 4oC/phút đế 240oC, giữ 40 [13] 60mx0,32mm;0,5 µm) phút. Nhiệt độ tiêm 290oC. SPB-5 3 He Nhiệt độ ban đầu 40oC giữ trong 5 phút, sau tăng đến 200oC với [10] (60mx0,32mm;1,0µm) tốc độ 3oC/phút, giữ trong 5 phút.
HP-5MS Nhiệt độ tiêm 250oC. 4 (30mx0,25mm;0,25 He Nhiệt độ ban đầu 50oC, giữ trong 2 phút, sau đó tăng đến 250oC [18] µm) với tốc độ 10oC/phút giữ trong 5 phút. 11 Luan van thac si Nhiệt độ ban đầu 50oC giữ trong 1 phút, tăng 25oC/phút đến 5 DB5 He 150oC, sau đó tăng 20oC/phút đến 170oC, sau đó tăng 80oC/phút [27] đến 250oC rồi giữ trong 3 phút. Nhiệt độ tiêm 250oC.
6 HP-5MS He Nhiệt độ ban đầu 70oC giữ trong 2 phút, sau tăng đến 300oC với [30]** tốc độ 12oC/phút rồi giữ trong 2 phút. Nhiệt độ tiêm 280oC. DB-5MS 7 He Nhiệt độ ban đầu 70oC giữ trong 1 phút, sau đó tăng 7oC/phút [32]** (30m x 0,25mm) đến 110oC, sau tăng 20oC/phút đến 300oC rồi giữ 10 phút. Ghi chú:** có dẫn xuất trước khi sắc ký khối phổ 12 Luan van thac si Trên thực tế phương pháp đo quang được ứng dụng đầu tiên trong khi xác định 5-HMF trong các chế phẩm.
Tại Việt Nam, trong chuyên luận glucose cũng như TCVN năm 2012 về an toàn vệ sinh thực phẩm cũng có quy trình định lượng 5-HMF bằng phương pháp đo quang với thuốc thử p- toluidin[3]. Tuy nhiên, phương pháp này có thể bị ảnh hưởng nhiều bởi sự có mặt của các chất khác trong nền mẫu. Do đó phương pháp này có độ chính xác và chọn lọc không cao Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cũng được sử dụng để xác định trực tiếp 5-HMF trong các chế phẩm. Tuy nhiên, trong đề tài này các mẫu được pha loãng rồi tiến hành sắc ký trực tiếp nên sẽ bị ảnh hưởng nhiều bởi nền mẫu phức tạp.
Từ đó dẫn đến yêu cầu cần phải có một phương pháp có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp, phương pháp không bị ảnh hưởng khi có mặt các chất khác trong nền mẫu, đặc biệt là những chất có vòng furan. Phương pháp LC/MS và GC/MS đều đáp ứng được yêu cầu đó. Trong 2 phương pháp này thì phương pháp GC/MS có ưu việt hơn, đặc biệt sử dụng Detector khối phổ hai lần (MS/MS) với độ chọn lọc và đặc hiệu cao. Phương pháp sắc ký khí khối phổ 1.
Đại cương về sắc ký khí Sắc ký khí là kỹ thuật chia tách trong đó các thành phần của mẫu phân tích phân bố giữa hai pha: pha tĩnh và pha động. Trong đó pha động là một chất khí, thường là khí trơ. Mẫu phân tích được đưa vào đầu cột và quá trình rửa giải được thực hiện nhờ dòng khí trơ qua cột sắc ký.