Luận văn thiết lập phương pháp elisa sử dụng kháng nguyên tự chế để chẩn đoán porcine circovirus type 2

Tài liệu nghiên cứu Luận văn thiết lập phương pháp elisa sử dụng kháng nguyên tự chế để chẩn đoán porcine circovirus, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Lý Đức Việt
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Khánh Linh
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Phương Pháp ELISA Tự Chế Để Chẩn Đoán Virus Circovirus Loại 2 Ở Lợn
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
• 3. PHẦN 3: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phương Pháp ELISA Tự Chế Chẩn Đoán PCV2 Ở Lợn

Phương pháp ELISA tự chế mở ra hướng tiếp cận mới trong chẩn đoán PCV2 (Virus Circovirus loại 2) ở lợn, giảm sự phụ thuộc vào kit thương mại đắt đỏ. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý phát hiện kháng thể PCV2 trong huyết thanh lợn bằng kháng nguyên PCV2 tự sản xuất. Việc thiết lập ELISA tại chỗ giúp chủ động hơn trong kiểm soát dịch bệnh và giảm chi phí. Theo nghiên cứu của Lý Đức Việt (2016), việc ứng dụng hệ thống biểu hiện baculovirus để tái tổ hợp protein của PCV2 là hướng đi đầy tiềm năng, đặc biệt trong bối cảnh ngành thú y Việt Nam còn nhiều hạn chế về nguồn cung sinh phẩm chẩn đoán.

1.1. Giới thiệu về Virus Circovirus Loại 2 PCV2 ở lợn

Virus Circovirus loại 2 (PCV2) là tác nhân gây ra nhiều bệnh nguy hiểm ở lợn, trong đó có hội chứng còi cọc sau cai sữa (PMWS). PCV2 có cấu trúc nhỏ, hệ gen ADN đơn và khả năng lây lan nhanh chóng. Việc chẩn đoán sớm PCV2 là yếu tố then chốt để kiểm soát dịch bệnh và giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi. PCV2 có sức đề kháng cao với nhiệt độ và pH, gây khó khăn trong việc tiêu diệt mầm bệnh.

1.2. Tầm quan trọng của chẩn đoán sớm bệnh Circovirus ở lợn

Việc chẩn đoán sớm bệnh Circovirus ở lợn là vô cùng quan trọng để ngăn chặn sự lây lan và giảm thiểu thiệt hại kinh tế. Phát hiện sớm giúp áp dụng các biện pháp phòng ngừa và điều trị kịp thời, hạn chế tối đa số lượng lợn mắc bệnh và chết. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống thường tốn kém và mất thời gian, do đó, việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và hiệu quả như ELISA tự chế là rất cần thiết.

II. Thách Thức Khi Chẩn Đoán PCV2 và Vai Trò Của ELISA Tự Chế

Việc chẩn đoán PCV2 gặp nhiều thách thức do triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu và sự phức tạp trong phân tích mẫu bệnh phẩm. Các kit ELISA thương mại có giá thành cao, gây khó khăn cho các phòng thí nghiệm thú y có nguồn lực hạn chế. ELISA tự chế nổi lên như một giải pháp tiềm năng, giúp giảm chi phí và tăng tính chủ động trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm ở lợn. Tuy nhiên, việc thiết lập quy trình ELISA cần đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương với các phương pháp chuẩn.

2.1. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán PCV2 truyền thống

Các phương pháp chẩn đoán PCV2 truyền thống như PCR và phân lập virus đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao và thời gian thực hiện kéo dài. Điều này gây khó khăn cho việc chẩn đoán nhanh chóng và kịp thời, đặc biệt trong các đợt dịch bệnh bùng phát. Ngoài ra, chi phí thực hiện các xét nghiệm này cũng khá cao, gây áp lực lên ngân sách của các phòng thí nghiệm thú y.

2.2. Ưu điểm của ELISA tự chế so với ELISA thương mại

ELISA tự chế có nhiều ưu điểm so với ELISA thương mại, bao gồm chi phí thấp hơn, khả năng tùy chỉnh quy trình và chủ động trong sản xuất kháng nguyên. Việc tự sản xuất kháng nguyên giúp giảm sự phụ thuộc vào nguồn cung bên ngoài và đảm bảo nguồn cung ổn định. Ngoài ra, ELISA tự chế có thể được điều chỉnh để phù hợp với các chủng PCV2 lưu hành tại địa phương, tăng độ chính xác của xét nghiệm.

2.3. Yêu cầu về độ nhạy và độ đặc hiệu của ELISA tự chế

Để đảm bảo tính tin cậy, ELISA tự chế cần đáp ứng các yêu cầu nghiêm ngặt về độ nhạy và độ đặc hiệu. Độ nhạy cao giúp phát hiện các trường hợp nhiễm bệnh ở giai đoạn sớm, trong khi độ đặc hiệu cao giúp tránh các kết quả dương tính giả. Việc kiểm tra và đánh giá độ tin cậy của ELISA tự chế là bước quan trọng để đảm bảo chất lượng của xét nghiệm.

III. Hướng Dẫn Chi Tiết Cách Thiết Lập Phương Pháp ELISA Tự Chế

Việc thiết lập phương pháp ELISA đòi hỏi quy trình chuẩn hóa và kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt. Các bước bao gồm: sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp PCV2, chuẩn bị mẫu huyết thanh, tối ưu hóa các thông số phản ứng và đọc kết quả ELISA. Cần chú trọng đến việc lựa chọn vật liệu và hóa chất ELISA phù hợp, cũng như đảm bảo độ tin cậy của ELISA tự chế thông qua các thử nghiệm kiểm chứng. Theo Lý Đức Việt (2016), hệ thống biểu hiện baculovirus là công cụ hiệu quả để sản xuất protein tái tổ hợp PCV2.

3.1. Sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp PCV2 bằng hệ thống Baculovirus

Hệ thống biểu hiện baculovirus là một phương pháp hiệu quả để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp PCV2. Quy trình bao gồm tạo dòng gen ORF2 của PCV2 vào vector biểu hiện, tạo baculovirus tái tổ hợp và gây nhiễm tế bào côn trùng để sản xuất protein. Protein tái tổ hợp sau đó được tinh sạch và kiểm tra hoạt tính kháng nguyên bằng phương pháp IPMA.

3.2. Quy trình chuẩn bị mẫu huyết thanh lợn cho xét nghiệm ELISA

Mẫu huyết thanh lợn cần được chuẩn bị kỹ lưỡng trước khi thực hiện xét nghiệm ELISA. Quy trình bao gồm thu thập máu, ly tâm để tách huyết thanh và pha loãng huyết thanh đến nồng độ phù hợp. Cần đảm bảo mẫu huyết thanh không bị nhiễm khuẩn hoặc tạp chất để tránh ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.

3.3. Tối ưu hóa các thông số phản ứng ELISA để đạt độ nhạy cao

Để đạt được độ nhạy cao, cần tối ưu hóa các thông số phản ứng ELISA như nồng độ kháng nguyên, nồng độ kháng thể, thời gian ủ và nhiệt độ. Việc chuẩn độ hai chiều kháng nguyên kháng thể giúp xác định nồng độ tối ưu cho phản ứng. Ngoài ra, cần sử dụng các mẫu đối chứng âm và dương để kiểm soát chất lượng của xét nghiệm.

IV. Đánh Giá Độ Nhạy và Độ Đặc Hiệu Của ELISA Tự Chế PCV2

Việc đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của ELISA tự chế là bước quan trọng để đảm bảo tính tin cậy của phương pháp. So sánh kết quả ELISA tự chế với các phương pháp chuẩn như ELISA thương mại và IPMA giúp xác định độ chính xác của xét nghiệm. Các thử nghiệm phản ứng chéo với các virus gây bệnh khác ở lợn cũng cần được thực hiện để đánh giá độ đặc hiệu.

4.1. So sánh kết quả ELISA tự chế với ELISA thương mại và IPMA

So sánh kết quả ELISA tự chế với ELISA thương mại và IPMA là phương pháp hiệu quả để đánh giá độ chính xác của xét nghiệm. Các mẫu huyết thanh được xét nghiệm đồng thời bằng cả ba phương pháp và kết quả được so sánh để xác định tỷ lệ tương đồng. Sự khác biệt giữa các phương pháp cần được phân tích và giải thích.

4.2. Phân tích phản ứng chéo với các virus gây bệnh khác ở lợn

Để đánh giá độ đặc hiệu, cần thực hiện các thử nghiệm phản ứng chéo với các virus gây bệnh khác ở lợn như PCV1, PRRS và CSF. Các mẫu huyết thanh kháng các virus này được xét nghiệm bằng ELISA tự chế và kết quả được đánh giá để xác định khả năng phản ứng chéo. Phản ứng chéo cao có thể làm giảm độ tin cậy của xét nghiệm.

4.3. Xác định ngưỡng cắt cut off cho xét nghiệm ELISA tự chế

Việc xác định ngưỡng cắt (cut-off) là bước quan trọng để phân biệt giữa mẫu dương tính và âm tính. Ngưỡng cắt được xác định dựa trên kết quả xét nghiệm của một số lượng lớn mẫu huyết thanh âm tính. Các mẫu có giá trị OD cao hơn ngưỡng cắt được coi là dương tính, trong khi các mẫu có giá trị OD thấp hơn ngưỡng cắt được coi là âm tính.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của ELISA Tự Chế Trong Chẩn Đoán PCV2

ELISA tự chế có thể được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán PCV2 tại các phòng thí nghiệm thú y, giúp theo dõi dịch tễ học và đánh giá hiệu quả vaccine. Việc chẩn đoán nhanh chóng và chính xác giúp người chăn nuôi đưa ra các biện pháp phòng ngừa và điều trị kịp thời, giảm thiểu thiệt hại kinh tế. Theo kết quả nghiên cứu của Lý Đức Việt (2016), ELISA tự chế có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương với các phương pháp chuẩn, phù hợp cho công tác chẩn đoán huyết thanh học.

5.1. Theo dõi dịch tễ học PCV2 bằng phương pháp ELISA tự chế

ELISA tự chế là công cụ hữu hiệu để theo dõi dịch tễ học PCV2, giúp xác định tỷ lệ nhiễm bệnh trong đàn lợn và theo dõi sự lây lan của virus. Thông tin này giúp các nhà quản lý dịch bệnh đưa ra các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

5.2. Đánh giá hiệu quả vaccine PCV2 bằng xét nghiệm ELISA tự chế

ELISA tự chế có thể được sử dụng để đánh giá hiệu quả vaccine PCV2 bằng cách đo nồng độ kháng thể trong huyết thanh lợn sau khi tiêm vaccine. Nồng độ kháng thể cao cho thấy vaccine có hiệu quả bảo vệ tốt.

5.3. Ứng dụng ELISA tự chế trong phòng thí nghiệm thú y địa phương

ELISA tự chế giúp các phòng thí nghiệm thú y địa phương chủ động hơn trong chẩn đoán PCV2, giảm sự phụ thuộc vào các kit thương mại đắt đỏ. Điều này đặc biệt quan trọng ở các vùng nông thôn, nơi nguồn lực còn hạn chế.

VI. Kết Luận và Triển Vọng Phát Triển Của ELISA Tự Chế PCV2

ELISA tự chế là phương pháp chẩn đoán PCV2 tiềm năng, giúp giảm chi phí và tăng tính chủ động trong kiểm soát dịch bệnh. Cần tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện quy trình để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu, cũng như mở rộng ứng dụng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm ở lợn. Việc sản xuất kit ELISA PCV2 hoàn toàn trong nước là mục tiêu quan trọng, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành chăn nuôi lợn.

6.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu và đánh giá tiềm năng của ELISA tự chế

Nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của ELISA tự chế trong chẩn đoán PCV2. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương với các phương pháp chuẩn, đồng thời có chi phí thấp hơn. ELISA tự chế có thể được ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm thú y và trang trại chăn nuôi.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo để hoàn thiện phương pháp ELISA tự chế

Các hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm tối ưu hóa quy trình sản xuất kháng nguyên, cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm, và phát triển các kit ELISA đơn giản và dễ sử dụng. Ngoài ra, cần nghiên cứu ứng dụng ELISA tự chế trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm khác ở lợn.

6.3. Đề xuất chính sách hỗ trợ phát triển ELISA tự chế tại Việt Nam

Để thúc đẩy sự phát triển của ELISA tự chế tại Việt Nam, cần có chính sách hỗ trợ từ nhà nước, bao gồm đầu tư vào nghiên cứu và phát triển, đào tạo nguồn nhân lực và tạo điều kiện cho các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm chẩn đoán. Việc tự chủ trong sản xuất sinh phẩm chẩn đoán là yếu tố quan trọng để đảm bảo an ninh dịch bệnh và phát triển bền vững ngành chăn nuôi.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch bệnh do Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) gây ra hội chứng còi cọc sau cai sữa (PMWS) là một trong những mối đe dọa nghiêm trọng nhất đối với ngành chăn nuôi lợn toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Các khảo sát dịch tễ trong nước ghi nhận tỷ lệ nhiễm PCV2 trên đàn lợn tại các tỉnh phía Nam đã tăng vọt từ 38,9% vào năm 2000 lên mức 96,47% vào năm 2006, khiến tỷ lệ tử vong và loại thải đàn dao động từ 6% đến hơn 14,3% tại các trang trại bùng phát dịch. Vấn đề cấp bách đặt ra là hầu hết các bộ kít ELISA chẩn đoán và nguồn vắc-xin phòng bệnh PCV2 lưu hành trên thị trường nội địa đều phụ thuộc hoàn toàn vào nguồn nhập khẩu với chi phí đắt đỏ, gây rào cản lớn cho công tác tầm soát dịch tễ định kỳ.

Trước thực tế đó, nghiên cứu được triển khai nhằm hai mục tiêu cụ thể: sản xuất protein capsid ORF2 tái tổ hợp của vi rút PCV2 bằng hệ thống biểu hiện Baculovirus và thiết lập hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật ELISA gián tiếp sử dụng kháng nguyên tự chế để chẩn đoán chính xác vi rút PCV2 trên đàn lợn. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Hóa sinh - Miễn dịch thuộc Viện Thú y kết hợp với Khoa Thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tiến hành đánh giá trên 286 mẫu huyết thanh lợn thực địa do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương cung cấp. Kết quả nghiên cứu mang lại ý nghĩa khoa học và thực tiễn to lớn khi phát triển thành công sinh phẩm chẩn đoán đạt độ nhạy tuyệt đối 100% và độ đặc hiệu 97,16%, giúp giảm khoảng 50% giá thành xét nghiệm so với sinh phẩm ngoại nhập, tạo tiền đề vững chắc cho việc tự chủ công nghệ sản xuất kít chẩn đoán và vắc-xin tiểu phần tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng sinh học phân tử và cấu trúc vi rút học của vi rút PCV2 thuộc họ Circoviridae. Hệ gen của PCV2 là một phân tử ADN đơn dạng vòng có kích thước nhỏ từ 1,7 đến 2,0 kilobase với 11 khung đọc mở, trong đó khung đọc mở số 2 (ORF2) mã hóa cho protein capsid cấu trúc có trọng lượng phân tử khoảng 27,8 kDa gồm 233 axit amin. Protein ORF2 là kháng nguyên bề mặt chủ yếu quyết định tính sinh miễn dịch và kích thích cơ thể vật chủ sản sinh kháng thể trung hòa đặc hiệu. Trình tự axit amin của ORF2 giữa PCV1 và PCV2 có độ sai khác lớn tại các đoạn 65-87, 113-139 và 193-207, cho phép sử dụng protein này làm kháng nguyên mục tiêu để chẩn đoán phân biệt chính xác.

Bên cạnh đó, đề tài ứng dụng lý thuyết biểu hiện gen ngoại lai bằng hệ thống vector Baculovirus tái tổ hợp (Baculovirus Expression Vector System - BEVS). Hệ thống này sử dụng virus nhân đa diện Autographa californica (AcNPV) để biểu hiện gen đích dưới sự điều khiển của promoter polyhedrin cực mạnh trong tế bào côn trùng. Cơ chế này đảm bảo protein tái tổ hợp được cuộn gập chuẩn xác và trải qua các quá trình biến đổi sau dịch mã tương tự kháng nguyên tự nhiên. Đồng thời, nguyên lý miễn dịch học của phương pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) được áp dụng để phát hiện kháng thể IgG kháng PCV2 thông qua việc cố định kháng nguyên ORF2 trên giá thể rắn 96 giếng và phát hiện bằng kháng thể thứ cấp thỏ kháng IgG lợn gắn enzyme Horse Radish Peroxidase (HRP).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành khảo sát trên cỡ mẫu gồm 286 mẫu huyết thanh lợn do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương thu thập từ các ổ dịch và trang trại chăn nuôi thực địa tại Việt Nam. Phương pháp chọn mẫu là chọn mẫu phân tầng ngẫu nhiên từ các đàn lợn có biểu hiện còi cọc sau cai sữa và đàn lợn khỏe mạnh nhằm bảo đảm tính đại diện cao cho quần thể vật nuôi theo quy chuẩn thú y. Lý do lựa chọn phương pháp phân tích ELISA gián tiếp là nhờ độ nhạy cao, khả năng phân tích đồng thời hàng trăm mẫu với công suất lớn, thao tác chuẩn hóa dễ dàng và chi phí vận hành thấp hơn nhiều so với kỹ thuật PCR hay phân lập vi rút.

Quy trình nghiên cứu phân tử bao gồm việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu bằng phần mềm FastPCR để khuếch đại đoạn gen ORF2 dài 702 nucleotide từ khuôn mRNA mẫu bằng phản ứng RT-PCR. Đoạn gen sau đó được gắn vào vector tách dòng pFastBac/NT-TOPO và chuyển nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10Bac bằng phương pháp sốc nhiệt để tạo Bacmid tái tổ hợp mang gen chuyển tại vị trí Tn7. Bacmid tái tổ hợp tinh sạch được chuyển nhiễm vào tế bào côn trùng SF21AE để nhân dòng vi rút, sau đó chuyển sang gây nhiễm trên dòng tế bào High FIVE nuôi cấy không huyết thanh ở 27 độ C trong 72 giờ để thu nhận lượng lớn protein ORF2 có gắn đuôi His-tag. Dòng tế bào High FIVE được lựa chọn nhờ ưu điểm cho năng suất biểu hiện protein ngoại lai cao gấp 10 lần so với các dòng SF9 hoặc SF21AE thông thường. Protein ORF2 được tinh sạch qua cột sắc ký ái lực và kiểm tra hoạt tính kháng nguyên bằng phương pháp Western Blot và IPMA. Các thông số phản ứng ELISA được tối ưu hóa qua phương pháp chuẩn độ bàn cờ hai chiều (Checkerboard Titration) và đánh giá đối chiếu song song với kít ELISA thương mại của hãng Shenzhen Lvshiyuan cùng phương pháp IPMA chuẩn.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nghiên cứu đã nhân dòng thành công đoạn gen ORF2 kích thước 702 nucleotide mã hóa trọn vẹn 233 axit amin và một mã kết thúc. Khi phân tích bằng công cụ BLAST trên ngân hàng dữ liệu NCBI, trình tự gen ORF2 tách dòng đạt độ tương đồng 99% so với trình tự gen PCV2 của chủng phân lập NAVETCO công bố tại Việt Nam, chỉ xuất hiện sự sai khác duy nhất tại 1 vị trí nucleotide.

Thứ hai, hệ thống biểu hiện Baculovirus trên tế bào High FIVE đã tạo ra protein ORF2 tái tổ hợp có đặc tính sinh học tương đồng kháng nguyên tự nhiên. Thử nghiệm IPMA trên thảm tế bào High FIVE cho thấy các tế bào bị nhiễm bắt màu đỏ đậm trong nguyên sinh chất khi phản ứng với kháng thể đa dòng thương mại và huyết thanh lợn tối miễn dịch, chứng minh protein tái tổ hợp giữ nguyên hoạt tính gắn kết miễn dịch đặc hiệu.

Thứ ba, kỹ thuật chuẩn độ hai chiều đã xác lập được các thông số tối ưu cho phản ứng ELISA gồm: nồng độ kháng nguyên ORF2 phủ đĩa đạt 200 nanogram trên mỗi giếng, độ pha loãng huyết thanh kiểm tra ở mức 1/50, và độ pha loãng kháng thể cộng hợp kháng IgG lợn gắn HRP là 1/6000 (với mức ý nghĩa p < 0,05). Giá trị mật độ quang ngưỡng âm (OD cutoff) tại bước sóng 630 nm được xác định chính xác là 0,217 dựa trên công thức lấy giá trị trung bình mẫu âm tính cộng 3 lần độ lệch chuẩn.

Thứ tư, khi thử nghiệm trên 286 mẫu huyết thanh lợn thực địa, phương pháp ELISA tự chế phát hiện được 153 mẫu dương tính và 133 mẫu âm tính. So sánh với kết quả của phương pháp tham chiếu (IPMA và kít ELISA thương mại ghi nhận 149 mẫu dương tính và 137 mẫu âm tính), phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế đạt độ nhạy chẩn đoán tuyệt đối 100% và độ đặc hiệu đạt 97,16%.

Thứ năm, phân tích phản ứng chéo chứng minh tính đặc hiệu tuyệt đối của sinh phẩm khi không xuất hiện phản ứng với các mẫu huyết thanh tối miễn dịch kháng vi rút PCV1 (giá trị OD cực thấp chỉ 0,012), vi rút PRRS và vi rút Dịch tả lợn cổ điển (CSF).

Thảo luận kết quả

Độ nhạy tuyệt đối 100% đạt được khẳng định quy trình ELISA tự chế có khả năng nhận diện toàn bộ các cá thể lợn đã sinh kháng thể kháng PCV2, hoàn toàn không ghi nhận trường hợp âm tính giả. Về độ đặc hiệu 97,16%, việc xuất hiện 4 mẫu dương tính giả (tương đương tỷ lệ sai biệt 2,84%) so với kít thương mại có thể bắt nguồn từ việc protein ORF2 tái tổ hợp tinh khiết bộc lộ các epitope không gian rõ ràng hơn, giúp bắt giữ nhạy bén các mẫu huyết thanh có hiệu giá kháng thể thấp ở giai đoạn đầu nhiễm bệnh mà kít thương mại sử dụng kháng nguyên toàn phần chưa phát hiện được.

So với các công trình nghiên cứu quốc tế sử dụng kháng nguyên PCV2 biểu hiện trên nấm men hoặc E. coli, hệ thống Baculovirus trên tế bào High FIVE cho thấy ưu thế vượt trội về khả năng cuộn gập protein chính xác và không bị nhiễu bởi nội độc tố vi khuẩn. Trong thực tế, toàn bộ dữ liệu đối sánh này có thể được biểu diễn trực quan thông qua bảng ma trận 2x2 thể hiện độ tương đồng giữa các phương pháp chẩn đoán, kết hợp biểu đồ cột phân bố giá trị mật độ quang OD630 giữa các nhóm mẫu huyết thanh dương tính chuẩn, âm tính chuẩn và nhóm phản ứng chéo. Bên cạnh đó, đường cong đặc trưng hoạt động máy thu ROC (Receiver Operating Characteristic) với diện tích dưới đường cong đạt xấp xỉ 0,99 sẽ minh chứng rõ nét cho độ tin cậy và tính ổn định sinh học của quy trình ELISA được thiết lập.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, chuẩn hóa và đóng gói bộ sinh phẩm kít ELISA thương mại: Viện Thú y cần chủ trì phối hợp với các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm thú y tiến hành chuẩn hóa quy trình đông khô kháng nguyên ORF2 và dịch cộng hợp nhằm nâng cao độ bền sinh học, duy trì hạn sử dụng trên 12 tháng ở điều kiện bảo quản 2 đến 8 độ C. Mục tiêu là sản xuất thử nghiệm tối thiểu 5.000 test chẩn đoán đạt tiêu chuẩn cơ sở trong giai đoạn 2026-2027.

Thứ hai, mở rộng chương trình điều tra dịch tễ học quy mô quốc gia: Cục Thú y và các Chi cục Thú y vùng cần ứng dụng quy trình ELISA tự chế để triển khai lấy mẫu tầm soát từ 5.000 đến 10.000 mẫu huyết thanh lợn tại các vùng chăn nuôi trọng điểm trên cả nước trong vòng 18 tháng tới. Mục tiêu cụ thể là xây dựng bản đồ dịch tễ PCV2 chính xác, giúp phát hiện sớm các ổ dịch tiềm ẩn và hỗ trợ giám sát tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phòng vắc-xin đạt trên 80%.

Thứ ba, phát triển kháng nguyên ORF2 làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin tiểu phần: Nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học nông nghiệp cần tiếp tục tối ưu hóa quy trình nuôi cấy tế bào High FIVE trong hệ thống bioreactor thể tích 50 đến 100 lít trong thời gian 24 tháng tới. Mục tiêu kỹ thuật là thu nhận protein ORF2 tinh sạch đạt hiệu suất trên 50 miligram trên một lít dịch nuôi cấy để làm nguyên liệu phối chế vắc-xin tiểu phần vô hoạt, hướng tới khả năng bảo hộ trên 85% đàn lợn thí nghiệm trước sự xâm nhiễm của PCV2.

Thứ tư, chuyển giao công nghệ và hạ giá thành dịch vụ xét nghiệm: Các trung tâm chẩn đoán thú y cấp tỉnh cần tiếp nhận chuyển giao quy trình kỹ thuật ELISA tự chế trong lộ trình 12 tháng. Giải pháp này giúp cắt giảm ít nhất 50% chi phí xét nghiệm cho người chăn nuôi, hạ giá thành từ mức 80.000 đồng của kít nhập ngoại xuống dưới 35.000 đồng cho một mẫu phân tích, thúc đẩy việc kiểm tra sức khỏe đàn lợn định kỳ.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Thứ nhất, các nhà nghiên cứu và học viên cao học chuyên ngành Thú y, Công nghệ sinh học và Vi sinh vật học: Luận văn cung cấp toàn bộ quy trình thực nghiệm chi tiết từ khâu thiết kế mồi, tạo dòng gen trên vector pFastBac, biểu hiện protein trên hệ thống Baculovirus tế bào côn trùng High FIVE đến kỹ thuật chuẩn độ Checkerboard, phục vụ trực tiếp cho việc phát triển các sinh phẩm chẩn đoán phân tử mới.

Thứ hai, cán bộ kỹ thuật tại các Trung tâm Chẩn đoán và Xét nghiệm Thú y: Tài liệu là cẩm nang thực hành hữu ích giúp các kỹ thuật viên xây dựng, thẩm định và chuẩn hóa quy trình xét nghiệm ELISA nội bộ với độ nhạy 100%, phục vụ hiệu quả cho công tác giám sát dịch bệnh thường quy tại phòng thí nghiệm đạt chuẩn ISO 17025.

Thứ ba, các doanh nghiệp sản xuất vắc-xin và kít thử sinh học thú y: Công trình mang lại dữ liệu khoa học thực chứng về khả năng sản xuất protein tái tổ hợp quy mô phòng thí nghiệm, cung cấp giải pháp công nghệ để các công ty sinh phẩm nội địa tự chủ nguồn nguyên liệu kháng nguyên chất lượng cao thay thế hàng nhập khẩu đắt đỏ.

Thứ tư, bác sĩ thú y thực địa và nhà quản lý các trang trại chăn nuôi lợn quy mô công nghiệp: Đề tài giúp người làm kỹ thuật hiểu rõ bản chất miễn dịch học và động học kháng thể của vi rút PCV2, từ đó xây dựng lịch tiêm phòng vắc-xin tối ưu vào giai đoạn lợn con từ 3 đến 4 tuần tuổi và đánh giá chuẩn xác hiệu quả miễn dịch của đàn nái sinh sản.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao protein ORF2 lại được lựa chọn làm kháng nguyên chẩn đoán cho phản ứng ELISA? Protein ORF2 mã hóa cho vỏ capsid của vi rút PCV2 với kích thước khoảng 27,8 kDa, là kháng nguyên cấu trúc chính kích thích cơ thể sinh ra kháng thể đặc hiệu bền vững. Trình tự axit amin của ORF2 ở PCV2 có nhiều đoạn sai khác rõ rệt so với vi rút PCV1 không gây bệnh, giúp phản ứng ELISA đạt độ đặc hiệu tối đa và không xảy ra hiện tượng dương tính giả chéo loài.

Hệ thống biểu hiện Baculovirus trên tế bào High FIVE mang lại ưu điểm gì vượt trội? Tế bào High FIVE có khả năng tổng hợp protein tái tổ hợp cao gấp 10 lần so với các dòng tế bào côn trùng SF9 hay SF21AE. Ngoài ra, dòng tế bào này phát triển thuận lợi trong môi trường không cần bổ sung huyết thanh, giúp protein ORF2 thu được có độ tinh sạch rất cao sau sắc ký ái lực và giữ nguyên cấu trúc không gian tự nhiên.

Giá trị mật độ quang ngưỡng âm của phản ứng ELISA tự chế được xác định như thế nào? Giá trị ngưỡng âm được tính toán theo công thức lấy giá trị OD trung bình của các mẫu đối chứng âm chuẩn cộng thêm 3 lần độ lệch chuẩn. Trong nghiên cứu này, giá trị OD ngưỡng tại bước sóng 630 nm được xác lập là 0,217, đảm bảo 100% mẫu đối chứng âm chuẩn nằm dưới ngưỡng và toàn bộ mẫu đối chứng dương đều vượt ngưỡng quy định.

Kháng nguyên ORF2 tự chế có bị phản ứng chéo với các loại vi rút phổ biến khác trên lợn không? Kháng nguyên ORF2 hoàn toàn không phản ứng chéo với các vi rút khác. Khi thử nghiệm với huyết thanh tối miễn dịch kháng vi rút PCV1, giá trị mật độ quang chỉ đạt mức 0,012 (thấp hơn nhiều so với ngưỡng 0,217). Phương pháp cũng cho kết quả âm tính tuyệt đối khi kiểm tra với huyết thanh kháng vi rút PRRS và vi rút Dịch tả lợn cổ điển.

Độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 97,16% có ý nghĩa gì trong công tác phòng chống dịch thực tế? Chỉ số độ nhạy 100% đảm bảo phát hiện chính xác tất cả lợn mang mầm bệnh, không bỏ sót cá thể nhiễm vi rút trong đàn. Độ đặc hiệu 97,16% giúp loại bỏ nguy cơ chẩn đoán nhầm, giúp người chăn nuôi tiết kiệm chi phí điều trị sai phác đồ và đưa ra quyết định tiêm phòng hoặc cách ly kịp thời để bảo vệ an toàn đàn vật nuôi.

Kết luận

• Nghiên cứu đã tạo dòng và biểu hiện thành công protein capsid ORF2 tái tổ hợp của vi rút PCV2 kích thước 702 nucleotide bằng hệ thống Baculovirus trên tế bào côn trùng High FIVE đạt năng suất và hoạt tính sinh học cao.
• Thiết lập hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật ELISA gián tiếp với các thông số chuẩn hóa gồm 200 nanogram kháng nguyên mỗi giếng, độ pha loãng huyết thanh 1/50, độ pha loãng kháng thể cộng hợp 1/6000 và giá trị OD ngưỡng âm là 0,217.
• Đạt độ nhạy chẩn đoán tuyệt đối 100% và độ đặc hiệu cao 97,16% khi thử nghiệm trên 286 mẫu huyết thanh lợn thực địa, hoàn toàn không xảy ra phản ứng chéo với các vi rút PCV1, PRRS và CSF.
• Đóng góp giải pháp khoa học mang tính đột phá trong việc làm chủ công nghệ sinh phẩm chẩn đoán thú y nội địa, giúp cắt giảm 50% chi phí xét nghiệm so với việc sử dụng kít thương mại nhập khẩu.
• Tạo nguồn nguyên liệu protein tái tổ hợp ổn định và quy chuẩn để phục vụ nghiên cứu sản xuất vắc-xin tiểu phần phòng bệnh PMWS tại Việt Nam trong lộ trình 12 đến 24 tháng tới.

Công trình khẳng định năng lực tự chủ công nghệ của ngành thú y Việt Nam trong việc nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử hiện đại vào phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm. Các cơ quan quản lý thú y, viện nghiên cứu và doanh nghiệp chăn nuôi hãy nhanh chóng phối hợp tiếp nhận chuyển giao quy trình kỹ thuật ELISA tự chế để ứng dụng rộng rãi vào công tác kiểm soát dịch bệnh PCV2 trên toàn quốc ngay hôm nay.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ứng dụng hệ thống biểu hiện baculovirus nhằm mục đích chế tạo kháng nguyên tái tổ hợp PCV2 dùng cho công tác chẩn đoán cũng như chế tạo văc xin tái tổ hợp phòng PCV2 đã được nghiên cứu và phát triển thành những sản phẩm thương mại ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên đây là hướng đi còn tương đối mới mẻ ở Việt Nam, đặc biệt trong lĩnh vực Thú y. Hiện nay, hầu hết các kít ELISA chẩn đoán PCV2 cũng như vắc xin tiểu phần phòng PCV2 đều phải nhập ngoại với giá thành quá cao, không đáp ứng được nhu cầu giá cả của người chăn nuôi cũng như phục vụ công tác phòng chống dịch PMWS do PCV2 gây ra. Do vây, chúng tôi mạnh dạn đề xuất ứng dụng hệ thống baculovirus nhằm tái tổ hợp các protein của PCV2 nhằm mục đích tạo kháng nguyên tái tổ hợp dùng trong ELISA chẩn đoán và bước đầu sản xuất protein tái tổ hợp có kháng nguyên tính làm nguyên liệu tiến tới sản xuất vắc xin phòng PCV2.

Mục tiêu của luận văn là tạo ra những chế phẩm sinh học có chất lượng tương đương nhưng giá thành thấp hơn so với các sản phẩm cùng loại nhập ngoại. Hơn nữa, việc xây dựng qui trình công nghệ sử dụng hệ thống biểu hiện baculovirus nhằm mục đích tái tổ hợp những protein quan trong dùng trong y tế và thú y là việc làm rất cần thiết, đáp ứng nhu cầu “Tự cung - Tự cấp” các chế phẩm sinh học cũng như tiếp cận và ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật của thế giới vào công tác chẩn đoán và phong trị bệnh cho vật nuôi tại Việt Nam. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trong công tác phòng chẩn đoán và chống các bệnh có liên quan đến vi rút PCV2, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “THIẾT LẬP PHƢƠNG PHÁP ELISA SỬ DỤNG KHÁNG NGUYÊN TỰ CHẾ ĐỂ CHẨN ĐOÁN PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2”. Luận văn gồm hai nội dung chính: A.

Sản xuất protein ORF2 tái tổ hợp của vi rút PCV2 dùng làm nguyên liệu thiết lập ELISA Việc sản xuất kháng nguyên tự chế bằng hệ thống biểu hiện baculovirus là rất quan trọng, quyết định sự thành công của luận văn. Sản phẩm của nội dung này sẽ được sử dụng làm nguyên liệu để thiết lập ELISA dùng trong chẩn đoán ở nội dung 2. Thiết lập phƣơng pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng PCV2 trong huyết thanh lợn bằng kháng nguyên tự chế 1 Đây được xem là nội dung then chốt của luận văn. Việc thiết lập thành công ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế nhằm từng bước hoàn thiện và tiến tới chế tạo Kit ELISA chẩn đoán bệnh do vi rút PCV2 gây ra, có ý nghĩa quan trong trong công tác phòng và kiểm soát dịch bệnh của vật nuôi tại Việt Nam trong tương lai 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.

CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 2.1 Hiểu biết về vi rút Circo và bệnh do vi rút Circo gây ra 2. Lịch sử căn bệnh Virus PCV1 phát hiện năm 1974 trên môi trường tế bào dòng thận lợn PK15, Tuy nhiên, 8 năm sau đặc điểm của vi rút đã được chứng minh là có hình cầu, rất nhỏ, chứa một sợi ADN đơn và được đặt tên là Porcine circovirus(PCV). Năm 1995 các nhà phân loại học đã chỉ ra họ của vi rút PCV là Circoviridae dựa trên các cấu trúc đặc trưng của vi rút. Các thành viên khác của họ vi rút có thể gây bệnh: bệnh trên chim, bệnh tích ở mỏ và lông vũ trên vẹt, bệnh thiếu máu ở gà và bệnh trên chim bồ câu(John A.Ellis et al.

Virus PCV 2 được phân lập tại Pháp năm 1997, những nghiên cứu tiếp theo chỉ ra sự rõ ràng sự hiện diện của kháng thể capsid riêng của PCV 2 và chính bản thân virus trong mô, huyết thanh. PCV 2 trên toàn cầu có sự tương đồng là 96 % và tương đồng ít nhất 60% so với PCV 1, sự khác nhau cơ bản nằm ở trên protein capsid. Nghiên cứu hồi cứu mẫu huyết thanh đã tìm ra kháng thể với PCV2 rất sớm từ năm 1969 ở Belgium,1970 tại Anh, 1973 tại Ireland và 1985 Tây Ban Nha. Kháng thể với PCV2 tìm thấy trong 13,6% từ mô liên kết từ lợn tại Canada năm 1985, dương tính với vi rút PCV2 tăng đến 72,4% năm 1989, và 66,7% năm 1997 (J.

Gillespie et al. Cấu trúc của vi rút PCV2 Hình 1.1: Cấu trúc của vi rút PCV2 3 Theo như hình 2.1 (Merial Limited và Merial SAS, 2011) Circo vi rút có kích thước nhỏ, đường kính 20-25 nm, không có vỏ bọc, hình cầu đối xứng. Hạt vi rút cấu tạo bởi 60 tiểu đơn vị capsid, bọc lấy ADN đơn của vi rút, hệ gen bao gồm ADN đơn, kích thước 1,7-2 kb. Hiện nay, các chủng đã phân lập của PCV2 được chia thành 2 nhóm chính là PCV2a và PCV2b, ngoài ra còn có PCV2c và PCV2d ( chủ yếu ở Trung Quốc).

Sự khác nhau về đặc tính di truyền giữa các chủng phân lập là nguyên nhân các chủng có động lực khác nhau.M & McNeilly, (1998) Hệ gen của PCV2 gồm 11 khung dọc mở ORF (open reading frame)mã hóa cho các phân tử protein trong bộ gen, trong đó hai khung dọc mở chính (ORF1 và ORF2) theo hướng ngược nhau. Theo Meehan BM và cs (1999), ORF1 được xác định vị trí trên chuỗi dương tính và định hướng theo chiều kim đồng hồ. ORF1 mã hóa protein có trọng lượng phân tử 37,7 kDa. ORF1 của 2 chủng PCV1 và PCV2 có sự tương đồng về nucleotide và acid amin lần là 86% theo J.

Gillespie et al. Theo Dominique Mahe et al.Rathkjen et al. (2003) ORF2 nằm trên chuỗi bổ sung và định hướng ngược chiều kim đồng hồ, nó mã hóa cho protein cấu trúc của vi rút, chủ yếu liên quan đến sự hình thành vỏ capsid, có trọng lượng phân tử là 27,8 kDa của PCV. PCV1 and PCV2 có mức tương đồng trong ORF2 về trình tự nucleotide và amino acid lần lượt là 67%, 65%.

Trình tự acid amin trong ORF2 giữa 2 chủng PCV1 và PCV2 khác nhau tại vị trí 65-87, 113-139, 193-207 và PCV2 chủng Châu Âu và chủng Bắc Mỹ trong cấu trúc ORF2 tại đoạn acid amin 117-131 khác nhau 1 acid amin, vì vậy người ta sử dụng kháng thể nguồn gốc ORF2 như một công cụ để chẩn đoán phân biệt PCV. (1997) cho biết ORF3 được định vị trên chuỗi bổ sung, định hướng ngược chiều kim đồng hồ và chồng chéo lên ORF1. Nó mã hóa cho protein không phải cấu trúc với chiều dài 105 aa, có trọng lýợng phân tử là 11,8 kDa, không có vai trò trong quá trình nhân lên của vi rút nhưng có tác dụng gây apoptosis ở tế bào nhiễm và ảnh hưởng đến mầm bệnh trong cơ quan của cơ thể sống hay trong ống nghiệm, theo Kwang Soo Lyoo (2009) và Qiang Liu et al. ORF4 mã hóa cho protein có trọng lượng phân tử 6,5 kDa (vị trí nucleotide khoảng từ 912-733) có sự tương đồng về phân tử protein do ORF4 mã hóa với PCV1 là 83%, protein này giàu cysteine nhưng chưa rõ chức năng, theo Meehan B.

Sức đề kháng PCV2 có sức đề kháng với nhiệt độ cao, formalin, pH thấp (Sebastian Knell et al.Có thể duy trì tính gây nhiễm trong điều kiện pH<2, nhưng giảm đi đáng kể ở pH= 11, gần như biến mất tại pH=12. PCV2 bất hoạt ở nhiệt độ 56°c trong 1h, trong 15’ ở 75°c và bị diệt ở 80°c trong 15’ (Welch J, Bienek và cs , 2006). Trong điều kiện khô, virus chịu được ở 120°c trong 30’.Có thể phân lập vi rút trong mẫu bệnh phẩm bảo quản ở -700 C (Ellis et al. Virus khó bị tiêu diệt bằng thuốc tẩy rửachứa lipit hoà tan, iodine và phenol nhưng không hoạt động bởi các chất tẩy kiềm ( sodium hydroxide), tác nhân oxyt (sodium hypochlorite), hỗn hợp 1/4 ammonium, 2% các chất diệt trùng hỗn hợp 1(20% glutaraldehyde, 12% 2-propenal, polymervớiformaldehyde), hỗn hợp 2 (55 acidformic%, 7% glyoxylicacid) sau 120 phút ở 200C, nhưng tác dụng rất kém ở 100C (Meehan B.

Loài mắc bệnh Theo John A.Ellis (2003) và Jimmerman (2012) thì PCV2 phổ biến trên toàn thế giới, lợn nhà và lợn rừng đều có thể mắc phải. Những loài khác, bao gồm cả con người không dễ mắc PVC2, không thấy các bệnh tích đại thể và tổn thương vi thể sau khi gây nhiễm PCV2 trên cừu và bê, kháng nguyên không tìm thấy trong các mô. Bằng phản ứng ELISA, John A.Ellis et al. (2001) đã chứng minh ngựa, trâu, bò không cảm nhiễm với bệnh.

Chuột lại là trung gian truyền bệnh PCV2, chuật nhắt và chuột nhà quanh những trại lợn dương tính với PCV2 và kháng thể được tìm thấy trong huyết thanh chuột gây nhiễm ( Jun Li et al. Lứa tuổi mắc bệnh Theo John C.Harding et al. (1998) thì hội chứng PMWS do PCV2 thường gây bệnh cho lợn từ 2-17 tuần tuổi, chủ yếu là lợn từ 2-5 tuần, tại thời điểm lợn không còn bú mẹ và không nhận được kháng thể từ mẹ. Trong lứa tuổi mắc bệnh không có sự ảnh hưởng của tuổi đến số lượng vi rút trong huyết thanh và mức tổn thương mô bào.

Chất chứa virus Virus có trong dịch mũi miệng,phân và nước tiểu, hạch amidan, phế quản, chất bài tiết của mắt nước bỏ, sữa, sữa non và tinh trùng của lợn bệnh. Theo 5 Timmusk et al. (2006), ở lợn đực gây nhiễm virus được tìm thấy sau 5-35 ngày trong tinh dịch, kháng thể xuất hiện sau 11-90 ngày. Virus xuất hiện ở máu lợn nái mang thai sau 7-14 ngày sau thụ tinh nhân tạo, trong lợn con chết lưu, thai bị sảy và lơn yếu khi sinh.

Kháng nguyên và acid nucleic PCV2 thường được tìm thấy trong các hạch lympho sưng lớn (100%), 88% ở lách, 64% tại phổi, 35% tại thận và 15% tại gan cũng tìm thấy trong các đại thực bào tại trung tâm của các ổ viêm, biểu mô đường hô hấp, tế bào biểu mô, niêm mạc và hạ niêm mạc ruột non (Allan GM, 2000). Triệu chứng bệnh do virus PCV2 gây ra Hội chứng lợn còi cọc sau cai sữa phổ biến trên lợn từ 2-4 tháng tuổi, vào thời gian đó những con lợn bị nhiễm có biểu hiện lâm sàng có lượng virus tập trung trong huyết thanh cao nhất, thải virus ở mức độ cao và chứng minh một phản ứng kháng thể yếu hơn so với những con vật mắc bệnh cận lâm sàng. Lợn sau cai sữa và lợn thịt: bệnh tiến triển chậm. Lợn kém vận động, gầy, giảm cân,lông thô, da xanh đôi khi trở nên vàng.

Đôi khi nhợt nhạt thiếu máu không phục hồi do kết hợp với vi rút tác độngđến tủy xương hoặc do suy dinh dưỡng, (John A.SHarding et al. (1998) Nếu đồng nhiễm với hội chứng viêm da và viêm thận trên lợn gây chết đột ngột, tỷ lệ chết 6-10%. Bệnh biểu hiện qua viêm da vành tai, viêm da phía sau đùi, nặng hơn viêm da toàn thân.