Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời Levodopa và Carbidopa trong huyết tương chó bằng LC-MS/MS

• Tác giả: Trần Thị Hoa
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Ngân Bình
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời Levodopa và Carbidopa trong huyết tương chó bằng LC-MS/MS
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. TỔNG QUAN VỀ LEVODOPA VÀ CARBIDOPA
• 2.1. Tổng quan về levodopa
• 2.1.1. Công thức cấu tạo
• 2.1.2. Dược lực học
• 2.1.3. Dược động học
• 2.2. Tổng quan về carbidopa
• 2.2.1. Công thức cấu tạo
• 2.2.2. Dược lực học
• 2.2.3. Dược động học
• 2.3. Đặc điểm dược lý và tác dụng không mong muốn
• 2.3.1. Đặc điểm dược lý
• 2.3.2. Tác dụng không mong muốn
• 2.4. Sơ lược về các phương pháp định lượng đồng thời Levodopa-Carbidopa trong huyết tương
• 2.4.1. Phương pháp xử lý mẫu
• 2.4.2. Một số phương pháp phân tích
• 2.5. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ 2 lần (LC-MS/MS)
• 2.5.1. Bộ phận sắc ký lỏng
• 2.5.2. Bộ phận khối phổ
• 2.5.3. Bộ nguồn ion
• 2.5.4. Bộ phân tích khối phổ
• 2.5.5. Chế độ ghi phổ
• 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Nguyên vật liệu, thiết bị
• 3.2.1. Chuẩn bị chất chuẩn
• 3.2.2. Dung môi, hóa chất
• 3.2.3. Thiết bị, dụng cụ
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng levodopa, carbidopa
• 3.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
• 4.1. Kết quả xây dựng phương pháp nghiên cứu
• 4.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện khối phổ
• 4.3. Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng
• 4.4. Khảo sát quy trình xử lý mẫu
• 4.5. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích
• 4.5.1. Độ phù hợp hệ thống
• 4.5.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
• 4.5.3. Giới hạn định lượng dưới
• 4.5.4. Độ đúng, độ chính xác
• 4.5.5. Độ pha loãng
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu Định lượng Levodopa Carbidopa bằng LC MS MS

Bệnh Parkinson (PD) ảnh hưởng đến hàng triệu người trên toàn cầu, gây ra các rối loạn vận động và suy giảm chất lượng cuộc sống. Liệu pháp phối hợp Levodopa và Carbidopa là phương pháp điều trị phổ biến, giúp cải thiện triệu chứng bệnh. Tuy nhiên, để đánh giá hiệu quả và tối ưu hóa liều dùng, việc định lượng chính xác nồng độ thuốc trong cơ thể là vô cùng quan trọng. Các nghiên cứu tiền lâm sàng trên animal model như chó đóng vai trò then chốt trong quá trình phát triển thuốc mới. Do đó, việc phát triển phương pháp phân tích hiệu quả để định lượng đồng thời Levodopa và Carbidopa trong huyết tương chó là cần thiết. LC-MS/MS nổi lên như một công cụ mạnh mẽ với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, hứa hẹn mang lại kết quả chính xác và tin cậy. Khóa luận này tập trung vào việc xây dựng và validation phương pháp sử dụng LC-MS/MS. Mục tiêu là tạo ra một quy trình chuẩn xác, có thể ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu dược động học và sinh khả dụng.

1.1. Tổng quan về bệnh Parkinson và điều trị Levodopa Carbidopa

Bệnh Parkinson là một rối loạn thoái hóa thần kinh ảnh hưởng đến khả năng vận động. Sự kết hợp Levodopa và Carbidopa là một phương pháp điều trị phổ biến. Levodopa là tiền chất của dopamine, chất dẫn truyền thần kinh bị thiếu hụt trong bệnh Parkinson. Carbidopa ngăn chặn sự phân hủy Levodopa ở ngoại vi, cho phép nhiều Levodopa hơn đến não. Nghiên cứu cho thấy tỉ lệ mắc bệnh PD đã tăng gấp đôi trong 25 năm qua, do đó việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả là vô cùng quan trọng. Việc theo dõi nồng độ thuốc trong huyết tương giúp tối ưu hóa liều lượng và giảm thiểu tác dụng phụ. Theo một nghiên cứu, việc cá thể hóa liều lượng Levodopa dựa trên nồng độ thuốc trong máu có thể cải thiện đáng kể hiệu quả điều trị.

1.2. Tại sao cần định lượng Levodopa Carbidopa trong huyết tương chó

Chó được sử dụng rộng rãi làm animal model trong nghiên cứu dược lý và dược động học. Nghiên cứu trên chó có thể cung cấp thông tin quan trọng về cách thuốc được hấp thụ, phân phối, chuyển hóa và thải trừ (ADME). Việc định lượng nồng độ Levodopa và Carbidopa trong huyết tương chó giúp các nhà nghiên cứu hiểu rõ hơn về dược động học của thuốc ở loài động vật này. Điều này có thể giúp dự đoán hiệu quả và an toàn của thuốc ở người, đẩy nhanh quá trình phát triển thuốc mới và hiệu quả hơn. Theo tài liệu nghiên cứu, mức độ tương đồng về dược động học của LD giữa chó và người là cơ sở để lựa chọn chó làm animal model trong nghiên cứu.

II. Thách thức Định lượng Levodopa Carbidopa trong huyết tương

Việc định lượng Levodopa và Carbidopa trong huyết tương đặt ra nhiều thách thức. Cả hai hợp chất này đều có nồng độ thấp trong máu và có thể bị chuyển hóa nhanh chóng. Ma trận sinh học phức tạp như huyết tương có thể gây nhiễu và ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp phân tích. Các kỹ thuật phân tích truyền thống có thể không đủ nhạy hoặc không đủ đặc hiệu để phân biệt Levodopa và Carbidopa với các chất chuyển hóa hoặc các hợp chất nội sinh khác. Do đó, cần có một phương pháp phân tích mạnh mẽ và đáng tin cậy để vượt qua những thách thức này. Phương pháp LC-MS/MS được coi là giải pháp tối ưu nhờ khả năng chọn lọc và độ nhạy vượt trội, giúp giải quyết các vấn đề liên quan đến độ nhạy phương pháp và độ đặc hiệu phương pháp.

2.1. Khó khăn trong quá trình chiết mẫu Levodopa Carbidopa

Quá trình chiết mẫu là một bước quan trọng trong quá trình định lượng. Việc chiết mẫu hiệu quả giúp loại bỏ các chất gây nhiễu và làm giàu chất phân tích. Tuy nhiên, Levodopa và Carbidopa có thể bị mất mát hoặc biến đổi trong quá trình chiết mẫu. Các phương pháp chiết mẫu khác nhau, như chiết lỏng-lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE), có thể cho hiệu quả khác nhau. Việc lựa chọn phương pháp chiết mẫu phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp phân tích. Theo nghiên cứu, chiết pha rắn (SPE) thường được ưa chuộng hơn chiết lỏng-lỏng (LLE) do khả năng loại bỏ tạp chất tốt hơn.

2.2. Ảnh hưởng của pha động và cột sắc ký đến độ phân giải

Pha động và cột sắc ký đóng vai trò quan trọng trong việc tách Levodopa và Carbidopa khỏi các chất khác. Việc lựa chọn pha động và cột sắc ký phù hợp có thể cải thiện đáng kể độ phân giải và độ nhạy của phương pháp phân tích. Các yếu tố như pH, thành phần dung môi và kích thước hạt cột có thể ảnh hưởng đến khả năng tách các chất phân tích. Cần tối ưu hóa các điều kiện sắc ký để đạt được sự tách biệt tốt nhất giữa Levodopa, Carbidopa và các chất gây nhiễu tiềm ẩn. Việc lựa chọn đúng cột sắc ký và pha động có thể tăng cường độ nhạy phương pháp và độ đặc hiệu phương pháp.

III. Phương pháp LC MS MS Giải pháp định lượng hiệu quả Levodopa

LC-MS/MS là một kỹ thuật phân tích mạnh mẽ, kết hợp khả năng tách của sắc ký lỏng (LC) với khả năng phát hiện và định lượng của khối phổ (MS/MS). LC-MS/MS cung cấp độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép định lượng chính xác Levodopa và Carbidopa trong huyết tương. Kỹ thuật này sử dụng hai giai đoạn khối phổ để loại bỏ các chất gây nhiễu và tăng cường độ chính xác của phép đo. Với khả năng phân tích đa chất (multi-analyte), LC-MS/MS cho phép định lượng đồng thời Levodopa và Carbidopa trong cùng một lần chạy mẫu, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí. Sử dụng chuẩn nội (IS) là một chiến lược quan trọng để cải thiện độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp LC-MS/MS.

3.1. Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ cho Levodopa và Carbidopa

Việc tối ưu hóa các điều kiện khối phổ là rất quan trọng để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất. Các thông số như điện áp, nhiệt độ và khí va chạm cần được điều chỉnh để tối ưu hóa quá trình ion hóa và phân mảnh của Levodopa và Carbidopa. Việc lựa chọn các ion đặc trưng (MRM transitions) cho mỗi chất phân tích giúp tăng cường độ đặc hiệu và giảm thiểu nhiễu. Các điều kiện khối phổ phải được tối ưu hóa cho cả Levodopa và Carbidopa để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của phép đo. Kết quả tối ưu điều kiện mảnh được ghi nhận trong nghiên cứu để tham khảo và so sánh.

3.2. Vai trò của chuẩn nội Internal Standard trong LC MS MS

Chuẩn nội (IS) là một chất tương tự của chất phân tích được thêm vào mẫu ở nồng độ đã biết. Chuẩn nội giúp hiệu chỉnh các biến đổi trong quá trình chiết mẫu, sắc ký và khối phổ. Sự thay đổi tín hiệu của chuẩn nội được sử dụng để điều chỉnh tín hiệu của chất phân tích, giúp cải thiện độ chính xác và độ tin cậy của phép đo. Levodopa-d3 thường được sử dụng làm chuẩn nội cho định lượng Levodopa. Việc lựa chọn chuẩn nội phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả hiệu chỉnh tối ưu.

IV. Validation Đảm bảo độ tin cậy phương pháp định lượng LC MS MS

Validation phương pháp là quá trình chứng minh rằng phương pháp phân tích phù hợp với mục đích sử dụng và cung cấp kết quả chính xác và đáng tin cậy. Các thông số validation quan trọng bao gồm độ chọn lọc, độ đúng, độ chụm, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) và khoảng tuyến tính. Việc validation toàn diện đảm bảo rằng phương pháp LC-MS/MS có thể được sử dụng để định lượng Levodopa và Carbidopa trong huyết tương chó với độ tin cậy cao. Quy trình validation tuân thủ các hướng dẫn của các cơ quan quản lý như FDA và EMA.

4.1. Xác định độ chọn lọc và khoảng tuyến tính của phương pháp

Độ chọn lọc là khả năng của phương pháp phân tích để phân biệt Levodopa và Carbidopa với các chất khác trong mẫu. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ mà phương pháp phân tích cho đáp ứng tuyến tính. Độ chọn lọc và khoảng tuyến tính cần được xác định để đảm bảo rằng phương pháp phân tích có thể được sử dụng để định lượng chính xác Levodopa và Carbidopa trong các mẫu thực tế. Kết quả khảo sát đường chuẩn LD theo mô hình trọng số 1/x2 và CD theo mô hình trọng số 1/x2 được trình bày trong nghiên cứu.

4.2. Đánh giá độ đúng và độ chụm tại các mức nồng độ khác nhau

Độ đúng là mức độ gần đúng giữa kết quả phân tích và giá trị thực của chất phân tích. Độ chụm là mức độ nhất quán giữa các kết quả phân tích lặp lại. Độ đúng và độ chụm cần được đánh giá tại các mức nồng độ khác nhau để đảm bảo rằng phương pháp phân tích cho kết quả chính xác và đáng tin cậy trong phạm vi nồng độ dự kiến. Kết quả độ đúng và độ chính xác trong ngày ở các mức nồng độ khác nhau cần phải được ghi nhận và đánh giá cẩn thận.

4.3. Tính toán giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể được phát hiện một cách đáng tin cậy. Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể được định lượng một cách chính xác và đáng tin cậy. LOD và LOQ cần được xác định để đánh giá độ nhạy của phương pháp phân tích. Việc xác định LOD và LOQ là rất quan trọng để đảm bảo rằng phương pháp phân tích có thể được sử dụng để định lượng Levodopa và Carbidopa ở nồng độ thấp. Độ đúng- độ chính xác mẫu LLOQ được đánh giá để đảm bảo tính khả thi của phương pháp.

V. Kết quả Ứng dụng phương pháp LC MS MS vào phân tích mẫu thực

Phương pháp LC-MS/MS đã được áp dụng thành công để định lượng Levodopa và Carbidopa trong các mẫu huyết tương chó thực tế. Kết quả cho thấy phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp cho việc nghiên cứu dược động học và sinh khả dụng. Dữ liệu thu được từ phương pháp LC-MS/MS có thể được sử dụng để xây dựng mô hình dược động học và dự đoán nồng độ thuốc trong cơ thể theo thời gian. Thông tin này rất hữu ích cho việc tối ưu hóa liều lượng và cải thiện hiệu quả điều trị. Việc áp dụng phương pháp LC-MS/MS trong nghiên cứu tiền lâm sàng có thể giúp đẩy nhanh quá trình phát triển thuốc mới.

5.1. Phân tích dược động học của Levodopa Carbidopa trên chó

Phương pháp LC-MS/MS đã được sử dụng để nghiên cứu dược động học của Levodopa và Carbidopa trên chó sau khi dùng đường uống. Dữ liệu dược động học bao gồm các thông số như Cmax (nồng độ tối đa), Tmax (thời gian đạt nồng độ tối đa), AUC (diện tích dưới đường cong) và thời gian bán thải. Các thông số này cung cấp thông tin quan trọng về cách thuốc được hấp thụ, phân phối, chuyển hóa và thải trừ trong cơ thể. So sánh dược động học của Levodopa và Carbidopa trên chó và người có thể giúp dự đoán hiệu quả và an toàn của thuốc ở người.

5.2. So sánh kết quả với các phương pháp định lượng khác

Kết quả từ phương pháp LC-MS/MS đã được so sánh với kết quả từ các phương pháp định lượng khác, như HPLC-DAD hoặc ELISA. So sánh kết quả giúp đánh giá độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp LC-MS/MS. LC-MS/MS thường cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với các phương pháp khác. Tuy nhiên, chi phí và độ phức tạp của LC-MS/MS có thể là một yếu tố cần cân nhắc. Việc so sánh kết quả giúp lựa chọn phương pháp định lượng phù hợp nhất cho từng ứng dụng cụ thể.

VI. Kết luận LC MS MS Tiềm năng phát triển định lượng Levodopa

Phương pháp LC-MS/MS đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả để định lượng Levodopa và Carbidopa trong huyết tương chó. Phương pháp này cung cấp độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác cao, phù hợp cho việc nghiên cứu dược động học và sinh khả dụng. Việc áp dụng phương pháp LC-MS/MS trong nghiên cứu tiền lâm sàng có thể giúp đẩy nhanh quá trình phát triển thuốc mới. Các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc tối ưu hóa thêm phương pháp LC-MS/MS và mở rộng ứng dụng của nó trong các lĩnh vực khác, chẳng hạn như nghiên cứu lâm sàng trên người. HPLC-MS/MS hứa hẹn là một công cụ mạnh mẽ để cải thiện hiệu quả điều trị bệnh Parkinson.

6.1. Hướng phát triển và cải tiến phương pháp LC MS MS trong tương lai

Các hướng phát triển trong tương lai có thể bao gồm việc sử dụng các chuẩn nội mới, tối ưu hóa các điều kiện sắc ký và khối phổ, và phát triển các phương pháp xử lý mẫu đơn giản và hiệu quả hơn. Việc sử dụng các kỹ thuật phân tích dữ liệu tiên tiến, như học máy, có thể giúp cải thiện độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp. Nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc phát triển phương pháp LC-MS/MS để định lượng các chất chuyển hóa của Levodopa và Carbidopa. Phát triển phương pháp LC-MS/MS để định lượng các chất chuyển hóa có thể cung cấp thông tin chi tiết hơn về quá trình chuyển hóa của thuốc trong cơ thể.

6.2. Ứng dụng rộng rãi phương pháp LC MS MS trong nghiên cứu lâm sàng

Phương pháp LC-MS/MS có thể được sử dụng để theo dõi nồng độ thuốc trong máu của bệnh nhân Parkinson, giúp tối ưu hóa liều lượng và giảm thiểu tác dụng phụ. LC-MS/MS có thể được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố như tuổi tác, giới tính và di truyền đến dược động học của Levodopa và Carbidopa. Thông tin này có thể giúp cá nhân hóa điều trị và cải thiện hiệu quả điều trị bệnh Parkinson. Ứng dụng LC-MS/MS trong các nghiên cứu lâm sàng có thể mang lại những đột phá quan trọng trong điều trị bệnh Parkinson.