ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh parkinson (PD) là một bệnh về não và gây ra các rồi loạn về vận động, sức khỏe tâm thần, giấc ngủ và các vấn đề sức khỏe khác. Bệnh hay gặp ở 1% người lớn trên 60 tuổi, tỉ lệ nam giới mắc nhiều hơn nữ giới. Nguyên nhân của bệnh PD vẫn chưa được biết rõ, nhưng những người có tiền sử gia đình mắc bệnh này sẽ có nguy cơ cao hơn. Biểu hiện bệnh lý của căn bệnh này là sự sụt giảm các tế bào thần kinh dopaminergic ở viền đen não bộ.
Các triệu chứng của PD sẽ trở nên tồi tệ theo thời gian. Căn bệnh này có thể làm giảm đáng kể sức khỏe và chất lượng cuộc sống. PD thường gây ra các triệu chứng vận động như: chuyển động chậm, khó đi lại, mất cân bằng, chuyển động không tự nguyện, cứng cơ và các triệu chứng không vận động như: suy giảm nhận thức, rối loạn sức khỏe tâm thần, mất trí nhớ, rối loạn giấc ngủ và rối loạn cảm giác [36]. Tỷ lệ mắc bệnh PD đã tăng gấp đôi trong 25 năm qua.
Ước tính toàn cầu năm 2019 cho thấy có hơn 8,5 triệu người mắc bệnh PD, tăng 81% kể từ năm 2000 và gây ra 329.000 ca tử vong, tăng hơn 100% kể từ năm 2000. Hiện nay chưa cách chữa khỏi bệnh PD, liệu pháp dùng thuốc là một trong những biện pháp hữu ích cải thiện sức khỏe và chất lượng đời sống cho bệnh nhân [36]. Sự kết hợp giữa levodopa- carbidopa là một dạng thuốc được dùng phổ biến cho bệnh nhân PD, giảm đáng kể liều dùng của thuốc, tăng hiệu quả điều trị. Việc phát triển thuốc mới sử dụng công nghệ mới in 3D có khả năng kiểm soát giải phóng và cá thể hóa điều trị.
Việc phát triển thuốc mới sử dụng công nghệ mới cần có những thử nghiệm tiền lâm sàng và thử nghiệm lâm sàng chặt chẽ. Trước khi được thử nghiệm trên người thì các thuốc được thử nghiệm trên động vật thí nghiệm. Và chó được thử nghiệm nhiều trong các thí nghiệm y sinh như tim, thần kinh và hô hấp. Đã có những thử nghiệm trên thế giới cho thấy mức độ tương đồng về đặc điểm dược động học của LD giữa chó và người.
Do đó chó có thể đóng vai trò là mô hình để nghiên cứu sinh khả dụng, khả năng hấp thu và cơ chế trao đổi chất [31]. Vì vậy việc xây dựng phương pháp định lượng LD-CD trên huyết tương chó phục vụ mô hình nghiên cứu sinh khả dụng là cần thiết cho các pha thử nghiệm lâm sàng sau này trên người. Hiện nay, việc kết hợp sắc ký lỏng và khối phổ đã cải thiện tính chọn lọc, cho độ nhạy và độ chính xác cao, đơn giản hóa quá trình xử lý mẫu của phương pháp phân tích định lượng levodopa - carbidopa trong huyết tương. Vì vậy khóa luận này tiền hành đề tài: “ Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời Levodop và Carbidopa trong huyết tương chó bằng LC-MS/MS” với các mục tiêu sau: 1.
Xây dựng phương pháp định lượng Levodopa và Carbidopa trong huyết tương chó bằng LC-MS/MS. Thẩm định phương pháp định lượng Levodopa và Carbidopa trong huyết tương đã xây dựng. Tổng quan về levodopa 1. Công thức cấu tạo Hình 1.
Công thức cấu tạo của Levodopa acid (2S)-2-amino-3-(3,4-dihydroxyphenyl) propanoic 1. Tính chất lý hóa Khối lượng phân tử: 197,19 g/mol Hình thức: bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà Độ tan: ít tan trong nước, thực tế không tan trong ethanol 96%. Dễ tan trong dung dịch acid hydrocloric 1 M và hơi tan trong dung dịch acid hydrocloric 0,1 M [2], [32]. pH: 5-7 Góc quay cực: từ -1,27° đến -1,34° 1.
Cơ chế tác dụng Ở bệnh nhân Parkinson, sự giảm sụt tế bào sản xuất dopamin dẫn đến lượng dopamin được sản xuất giảm, gây rối loạn vận động ở người bệnh. Do đó việc bổ sung dopamin ở giai đoạn tiến triển của bệnh là cần thiết để cải thiện triệu chứng và giảm biến chứng của bệnh. Tuy nhiên dopamin không qua được hàng rào máu- não nên việc bổ sung dopamin trực tiếp không có tác dụng trong điều trị ở bệnh nhân mắc Parkinson. Cơ chế tác dụng của levodopa Levodopa (L-dopa, hay L-3,4-dihydroxyphenylalanin) được biết đến là tiền chất chuyển hóa của dopamin- là thuốc thay thế dopaminergic lâu đời nhất, dùng cho bệnh nhân mắc bệnh Parkinson.
LD qua được hàng rào máu - não và chuyển thành dopamin trong não nhờ enzym dopa decarboxylase, làm tăng nồng độ dopamin trong não, giảm 2 các triệu chứng của bệnh Parkinson [1]. Tuy nhiên các enzym dopa decarboxylase có nhiều ở niêm mạc ruột và ở các vị trí ngoại biên khác nên phần lớn thuốc bị khử carboxyl trước khi đến hàng rào máu, do đó thuốc chưa bị biến đổi tới được tuần hoàn não tương đối ít và có lẽ chỉ có dưới 1% thuốc vào được hệ TKTW [1], [7], [25]. Dược lực học Khi dùng đường uống, LD nhanh chóng bị khử carboxyl thành dopamin trong các mô ngoài não chỉ để một phần nhỏ của liều dùng vận chuyển không thay đổi đến hệ thần kinh trung ương. Do đó, cần một liều lượng lớn LD để đạt hiệu quả điều trị đầy đủ, và có thể đi kèm với buồn nôn và các phản ứng bất lợi khác, một số trong số đó là do dopamin được hình thành trong các mô ngoài não [17], [23].
Vì LD cạnh tranh với một số acid amin để vận chuyển qua thành ruột, nên sự hấp thu LD có thể bị suy giảm ở một số bệnh nhân có chế độ ăn giàu protein. Dược động học a. Hấp thu và phân bố Levodopa được hấp thu nhanh tại ruột non nhờ hệ thống vận chuyển tích cực. Vì vậy các yếu tố tác động lên ruột non sẽ ảnh hưởng đến thời điểm và mức độ hấp thu vào hệ tuần hoàn chung của LD như thức ăn, pH, thời gian vận chuyển trong ruột, và các enzym trong ruột.
Một vài nghiên cứu trên huyết tương chó đã nhịn ăn trước khi dùng thuốc cho thấy nồng độ thuốc LD đạt đỉnh nhanh sau khoảng 25- 40 phút. LD hấp thu chủ yếu tại ruột non, hấp thu tốt khoảng 80% liều dùng, tuy nhiên nồng độ cũng giảm đi nhanh chóng, chỉ khoảng 20-30% đi vào tuần hoàn chung [11], [30]. Ngoài ra bữa ăn có hàm lượng chất béo và protein cao hoặc do thuốc làm chậm nhu động dạ dày có thể dẫn đến việc LD chậm đi đến ruột non và làm chậm hấp thu vào máu [25]. Sự hấp thu LD bị ảnh hưởng bởi hai yếu tố chính: cạnh tranh hấp thu và bị chuyển hóa bởi enzym AAAD.
Đầu tiên, sự cạnh tranh vận chuyển giữa LD và các LNAAs khác có thể xảy ra trong quá trình hấp thụ ở ruột. Thứ hai, ruột có nồng độ AAAD cao và quá trình khử carboxyl của LD tạo ra dopamin ở ngoại vi và nó không thể tăng nồng độ dopamin trong não [7], [14], [25]. Chuyển hóa Quá trình chuyển hóa của levodopa và dopamin có thể trải qua bốn quá trình: khử carboxyl, O-methyl hóa, chuyển hóa và khử hóa [25]. Quá trình khử carboxyl: LD bị khử carboxyl thành dopamin nhờ enzym AAAD.
Enzym này được phân bố trong ruột, gan và thận, ít nhất một nửa lượng LD khi uống bị khử carboxyl trong quá trình hấp thu và chuyển hóa bước một qua gan ở các mô ngoại vi thành dopamin, do dó sẽ không qua hàng rào máu não và bị mất mục đích điều trị [25]. Khoảng 70% chất chuyển hóa của LD tồn tại dưới dạng dopamin và chất chuyển hóa của nó cho thấy con đường khử carboxyl là con đường chuyển hóa chính. Quá trình chuyển hóa của levodopa Quá trình O-methyl hóa: Chuyển đổi LD thành 3- O -methyldopa và dopamin thành 3- O -methyldopamin bởi catechol- O -methyltransferase (COMT) là một con đường chuyển hóa quan trọng, đặc biệt khi quá trình khử carboxyl bị ức chế. O -Methyl hóa LD tạo ra một chất chuyển hóa không thể chuyển hóa thành dopamin trong não.
O - Methyl hóa dopamin là một cách để vô hiệu hóa chất dẫn truyền thần kinh. COMT có mặt trong nhiều mô ngoại vi cũng như trong não và chuyển hóa khoảng 10% LD khi LD được sử dụng mà không có chất ức chế AAD, và có thể có ý nghĩa hơn khi sử dụng đồng thời với chất ức chế AAD làm tăng nồng độ LD [25]. Monoamine oxidase (MAO) chuyển hóa dopamin và 3-methyldopamin. Nó tồn tại ở hai dạng đồng phân: MAO-A và MAO-B.
MAO-B là dạng chủ yếu được tìm thấy trong não người. MAO-A chủ yếu được tìm thấy trong ruột và chịu trách nhiệm vô hiệu hóa catecholamin và các chất vận mạch ở ngoại vi. Ức chế không chọn lọc MAO dẫn đến “hiệu ứng phô mai” với nhịp tim nhanh và tăng huyết áp. Do đó ức chế chọn lọc MAO- B có vai trò trong điều trị PD vì nó có thể làm chậm quá trình chuyển hóa dopamin trong não và kéo dài tác dụng của dopamin [7].
Enzym decarboxylase được phân bố rộng rãi ở đường ruột chó, hoạt động mạnh nhất ở hỗng tràng, và ít hoạt động ở tá tràng, hoạt động COMT ở ruột cũng đóng vai trò quan trọng nhưng ít quan trọng hơn nhiều so với enzym decarboxylase. Kết quả nghiên cứu trên chó cho thấy sự giảm LD đường uống do sự có mặt của enzym decarboxylase trong ruột, khoảng 60% chuyển hóa của LD diễn ra ở ruột và một phần nhỏ qua gan [11], [29]. Thải trừ 4 Ở chó thời gian bán thải trong khoảng 8-9 giờ, dưới dạng acid dihydroxyphenylacetic, acid homovanilic, acid phenylpyruvic và các dẫn xuất O- methyl hóa…. Khả dụng thấp của LD sau khi uống và tốc độ thải trừ nhanh dẫn đến nhu cầu dùng liều lớn để đạt được hiệu quả lâm sàng [11].
Tổng quan về carbidopa 1. Công thức cấu tạo Hình 1. Công thức cấu tạo của Carbidopa acid (2S)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydrazino-2-methylpropanoic monohydrat 1. Tính chất hóa lý Khối lượng phân tử: 226,23 g/mol Hình thức: Bột trắng hoặc trắng ngà.
Độ tan: Hơi tan trong methanol, ít tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96 %, thực tế không tan trong dicloromethan và diethyl ether, tan trong các dung dịch acid vô cơ loãng [2], [32]. Góc quay cực riêng: Từ -22,5° đến -26,5°, tính theo chế phẩm đã làm khô. Cơ chế tác dụng Carbidopa không có tác dụng điều trị trực tiếp, nó chỉ dược dùng phối hợp để bảo vệ LD không chuyển thành dopamin ở ngoại vi. CD là chất ức chế enzym decarboxylase (enzym khử carboxyl) ngăn cản khử carboxyl của LD ở ngoại vi, làm tăng lượng LD trong máu, tăng lượng LD vào não.
CD không ảnh hưởng tới chuyển hóa của LD trong não vì không qua được hàng rào máu – não [1]. CD hoạt động bằng cách liên kết không thuận nghịch với pyridoxal 5′-phosphate (PLP), ức chế L-axit amin thơm decarboxylase (AADC), một loại enzym có tác dụng chuyển hóa 5-HTP thành serotonin và L-dopa thành dopamin.