Xây dựng phương pháp định lượng Itraconazol trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – UV)

• Tác giả: Triệu Thị Linh
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Thùy Linh
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Sĩ
• Đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng Itraconazol trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – UV)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. TỔNG QUAN VỀ ITRACONAZOL
• 2.1. Công thức cấu tạo, tính chất lý hóa của Itraconazol
• 2.2. Dược lý và cơ chế tác dụng của Itraconazol
• 2.3. Chỉ định của Itraconazol
• 2.4. Đặc điểm dược động học liên quan đến theo dõi TDM
• 2.5. Phạm vị điều trị và độc tính
• 2.6. Khuyến cáo theo dõi TDM ở bệnh nhân dùng Itraconazol
• 2.7. Liều dùng
• 3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
• 3.1. Nguyên tắc
• 4. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
• 4.2. Nguyên liệu, hoá chất, dung môi
• 4.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 4.3.1. Chuẩn bị mẫu
• 4.3.2. Xác định điều kiện sắc ký
• 4.3.3. Xây dựng qui trình xử lý mẫu chuẩn trong huyết tương
• 5. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
• 5.1. Khảo sát, xây dựng điều kiện sắc ký để định lượng Itraconazol trong huyết tương và lựa chọn chuẩn nội
• 5.1.1. Lựa chọn chuẩn nội
• 5.1.2. Lựa chọn điều kiện detector
• 5.1.3. Lựa chọn pha động và tốc độ dòng pha động
• 5.2. Khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lý mẫu
• 5.3. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng CFZ trong huyết tương bằng HPLC – UV
• 5.4. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích
• 5.4.1. Độ phù hợp hệ thống
• 5.4.2. Đường chuẩn, khoảng tuyến tính
• 5.4.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
• 5.4.4. Độ đúng, độ chính xác
• 5.4.5. Tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết)
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Tóm tắt

I. Tổng quan phương pháp HPLC UV định lượng Itraconazol

Itraconazol là thuốc kháng nấm phổ rộng, được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh nhiễm nấm. Việc theo dõi nồng độ Itraconazol trong huyết tương là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị và tránh độc tính. Phương pháp HPLC-UV là một lựa chọn phân tích hiệu quả, đơn giản và kinh tế. Bài viết này cung cấp tổng quan về phương pháp HPLC-UV định lượng Itraconazol trong huyết tương, bao gồm nguyên tắc, ưu điểm và ứng dụng. Hiện nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu chính thức nào được công bố về việc định lượng Itraconazol trong huyết tương người, do đó việc xây dựng một phương pháp HPLC-UV tin cậy là cần thiết.

1.1. Giới thiệu về thuốc Itraconazol và ứng dụng lâm sàng

Itraconazol là một hợp chất triazole có phổ hoạt động rộng chống lại các tế bào nấm như Coccidioides, Cryptococcus, Candida, Histoplasma, Blastomyces, Basidiobolus và Sporotrichosis spp. bao gồm cả loài Aspergillus. Thuốc đang được sử dụng ngày càng nhiều để dự phòng ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch. Itraconazol được phân bố rộng rãi trong cơ thể và chuyển hóa mạnh ở gan nhờ cytochrom P450 isoenzym 3A4 (CYP3A4), một trong những chất chuyển hóa của itraconazol là hydroxyitraconazol cũng có tác dụng chống nấm.

1.2. Tầm quan trọng của định lượng Itraconazol trong huyết tương

Ở những bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch, sự hấp thu itraconazol bị ảnh hưởng bởi các rối loạn tiêu hóa do bệnh tật và hóa trị liệu gây độc tế bào, ngoài ra dược động học của itraconazol có thể bị thay đổi đáng kể khi dùng chung thuốc với một số thuốc khác. Do đặc tính chuyển hóa mạnh qua gan của itraconazol, nên việc thực hiện giám sát nồng độ thuốc trong máu được khuyến cáo với itraconazol để đảm bảo hiệu quả điều trị cũng như hạn chế nguy cơ gặp độc tính, đích nồng độ đáy của itraconazol cần nằm trong khoảng 0,5 mg/L đến khoảng 5mg/L.

II. Thách thức phân tích Itraconazol bằng HPLC UV là gì

Việc định lượng Itraconazol trong huyết tương bằng HPLC-UV đặt ra nhiều thách thức. Nồng độ thuốc trong máu thường thấp, đòi hỏi độ nhạy cao. Nền mẫu huyết tương phức tạp có thể gây nhiễu và ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Quá trình chuẩn bị mẫu cần được tối ưu hóa để đảm bảo độ thu hồi cao và loại bỏ các chất gây nhiễu. Ngoài ra, cần valid hóa phương pháp để đảm bảo độ tin cậy và chính xác của kết quả. Theo nghiên cứu của Bộ Y tế, nền mẫu có thành phần phức tạp có thể gây ảnh hưởng đến quá trình phân tích thuốc.

2.1. Vấn đề về độ nhạy khi định lượng Itraconazol trong huyết tương

Nồng độ Itraconazol trong máu thấp, nền mẫu có thành phần phức tạp có thể gây ảnh hưởng đến quá trình phân tích thuốc. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu các phương pháp định lượng itraconazol trong huyết tương: các xét nghiệm sinh học, HPLC-MS/MS, UPLC-MS/MS, LC-MS/MS, HPLC-MS. Tuy nhiên, phương pháp HPLC - UV cho phép định lượng itraconazol một cách đơn giản, không tốn kém, có độ nhạy, độ chính xác, độ đặc hiệu cao.

2.2. Ảnh hưởng của nền mẫu huyết tương đến phân tích HPLC UV

Nền mẫu huyết tương chứa nhiều thành phần phức tạp như protein, lipid, và các chất chuyển hóa, có thể gây nhiễu cho quá trình phân tích HPLC-UV. Các chất này có thể gây ra các pic giả, làm giảm độ phân giải, hoặc ảnh hưởng đến khả năng ion hóa của Itraconazol. Do đó, cần có quy trình chuẩn bị mẫu hiệu quả để loại bỏ các chất gây nhiễu này.

2.3. Tối ưu hóa quy trình chuẩn bị mẫu huyết tương Itraconazol

Chuẩn bị mẫu là bước quan trọng để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp HPLC-UV. Các kỹ thuật chiết tách như chiết tách pha rắn (SPE), chiết lỏng-lỏng (LLE), hoặc kết tủa protein có thể được sử dụng để loại bỏ các chất gây nhiễu và làm giàu Itraconazol. Cần tối ưu hóa các điều kiện chiết tách để đạt được độ thu hồi cao và loại bỏ hiệu quả các chất gây nhiễu.

III. Cách phát triển phương pháp HPLC UV định lượng Itraconazol

Phát triển một phương pháp HPLC-UV hiệu quả đòi hỏi sự tối ưu hóa nhiều yếu tố. Việc lựa chọn cột sắc ký, pha động và điều kiện phát hiện là rất quan trọng. Cột C18 thường được sử dụng do khả năng tách tốt các hợp chất kỵ nước như Itraconazol. Pha động thường là hỗn hợp của nước và dung môi hữu cơ như acetonitrile hoặc methanol. Điều kiện phát hiện UV cần được lựa chọn để đạt độ nhạy tối đa. Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của FDA hoặc ICH là bắt buộc để đảm bảo chất lượng.

3.1. Lựa chọn pha động và điều kiện sắc ký HPLC tối ưu

Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất với thời gian hợp lý. Sắc ký phân bố là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Có thể phân sắc ký lỏng phân bố thành hai dạng tùy thuộc vào pha tĩnh: sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký pha liên kết. Hiện nay, sắc ký pha liên kết chiếm ưu thế, thay thế cho sắc ký lỏng - lỏng.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện phát hiện UV để tăng độ nhạy

Itraconazol là một dẫn chất triazol tổng hợp có tác dụng chống nấm, bao gồm cả nấm mốc và nấm da. Tác dụng chống nấm của thuốc tương tự fluconazol và ketoconazol. Itraconazol có tác dụng ổn định trên lâm sàng, đặc biệt với Aspergillus spp. Thuốc cũng có tác dụng chống lại Coccidioides, Cryptococcus, Candida, Histoplasma, Blastomyces, Basidiobolus và Sporotrichosis spp. Itraconazol ức chế hệ enzym cytochrom P450 (CYP3A4) của nấm, làm ức chế sinh tổng hợp ergosterol một sterol chủ yếu trong màng tế bào nấm, làm thay đổi tính thấm của màng tế bào nấm, ảnh hưởng đến sự sống và phát triển của tế bào nấm.

3.3. Valid hóa phương pháp HPLC theo hướng dẫn của US FDA

Thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học của US – FDA. Các thông số cần được đánh giá trong quá trình valid hóa bao gồm độ đúng, độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), và độ ổn định. Kết quả phải đáp ứng các tiêu chuẩn quy định để đảm bảo độ tin cậy của phương pháp.

IV. Ứng dụng phương pháp HPLC UV định lượng Itraconazol

Phương pháp HPLC-UV định lượng Itraconazol trong huyết tương có nhiều ứng dụng trong lâm sàng và nghiên cứu. Nó được sử dụng để theo dõi nồng độ thuốc ở bệnh nhân điều trị Itraconazol, giúp tối ưu hóa liều dùng và tránh độc tính. Phương pháp này cũng có thể được sử dụng trong các nghiên cứu dược động học để đánh giá sự hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ của Itraconazol. Việc theo dõi nồng độ thuốc trong máu giúp đảm bảo hiệu quả điều trị và hạn chế các tác dụng không mong muốn.

4.1. Theo dõi nồng độ thuốc Itraconazol trong điều trị lâm sàng

Việc theo dõi nồng độ Itraconazol trong huyết tương là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị và tránh độc tính. Theo dõi nồng độ thuốc trong máu thường xuyên để đảm bảo lượng thuốc tiếp xúc đủ để có tác dụng kháng nấm. Ngoài ra, hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu về định lượng itraconazol trong huyết tương người được công bố.

4.2. Ứng dụng trong nghiên cứu dược động học của Itraconazol

Phương pháp HPLC-UV cũng có thể được sử dụng trong các nghiên cứu dược động học để đánh giá sự hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ của Itraconazol. Kết quả từ các nghiên cứu này giúp hiểu rõ hơn về dược động học của Itraconazol và đưa ra các khuyến cáo sử dụng thuốc hợp lý.

V. Kết luận và triển vọng phát triển HPLC UV Itraconazol

Phương pháp HPLC-UV định lượng Itraconazol trong huyết tương là một công cụ hữu ích trong lâm sàng và nghiên cứu. Với độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác cao, phương pháp này cho phép theo dõi nồng độ thuốc một cách hiệu quả. Trong tương lai, có thể cải tiến phương pháp bằng cách sử dụng các detector tiên tiến hơn hoặc kết hợp với các kỹ thuật chiết tách mẫu mới để tăng độ nhạy và độ chính xác. Việc phát triển các phương pháp định lượng Itraconazol đơn giản, nhanh chóng và kinh tế là rất quan trọng để cải thiện chất lượng chăm sóc sức khỏe.

5.1. Tóm tắt ưu điểm của phương pháp HPLC UV hiện tại

Phương pháp HPLC - UV cho phép định lượng itraconazol một cách đơn giản, không tốn kém, có độ nhạy, độ chính xác, độ đặc hiệu cao. Mặt khác, đây là thiết bị phổ biến ở phòng thí nghiệm và các trung tâm kiểm nghiệm, nên nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng itraconazol trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - UV)” để có thể áp dụng trong lâm sàng phục vụ điều trị cho bệnh nhân sử dụng itraconazol.

5.2. Hướng phát triển và cải tiến phương pháp HPLC UV Itraconazol

Việc sử dụng cột sắc ký với kích thước hạt nhỏ hơn, pha động có độ tinh khiết cao hơn, hoặc detector khối phổ (LC-MS) có thể giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp. Đồng thời, việc phát triển các kỹ thuật chiết tách mẫu tự động hóa có thể giúp giảm thiểu sai sót và tăng năng suất phân tích.