Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Nhiễm nấm xâm lấn là mối đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng, có xu hướng gia tăng rõ rệt trong hơn hai thập kỷ qua do sự gia tăng số lượng bệnh nhân suy giảm miễn dịch (ung thư, HIV/AIDS, ghép tạng, mắc bệnh hô hấp mạn tính) cùng sự đề kháng của các chủng vi nấm gây bệnh. Itraconazol (ITZ) là thuốc chống nấm tổng hợp nhóm triazol phổ rộng, được chỉ định phổ biến trong điều trị và dự phòng các bệnh nấm nội tạng và nấm bề mặt nguy hiểm như Aspergillus, Candida, Histoplasma, Cryptococcus và Blastomyces.
Trong thực hành lâm sàng, dược động học của itraconazol mang tính phi tuyến tính và có sự biến thiên sinh khả dụng rất lớn giữa các cá thể cũng như trên cùng một cá thể. Sự hấp thu của thuốc phụ thuộc nhiều vào dạng bào chế, pH dịch vị và thức ăn; đồng thời thuốc liên kết mạnh với protein huyết tương (> 99%) và chuyển hóa phức tạp qua hệ enzym cytochrom P450 isoenzym 3A4 (CYP3A4) tại gan. Do đó, mối quan hệ giữa liều dùng và nồng độ thuốc trong máu ở trạng thái ổn định rất khó dự đoán. Nồng độ đáy huyết tương của itraconazol cần được duy trì trong khoảng điều trị tối ưu (từ 0,5 mg/L đến khoảng 5 mg/L theo hướng dẫn của Bộ Y tế; hoặc tối thiểu 0,25 - 0,5 mg/L trong dự phòng và điều trị theo các phân tích gộp quốc tế) nhằm tránh nguy cơ thất bại điều trị khi nồng độ quá thấp (< 0,2 µg/mL) hoặc ngộ độc gan, rối loạn tiêu hóa và thần kinh khi nồng độ tăng cao (> 1,0 - 5,0 mg/L).
Việc theo dõi nồng độ thuốc trong máu (Therapeutic Drug Monitoring - TDM) đối với itraconazol là yêu cầu cấp thiết. Mặc dù các kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS, LC-MS/MS, UPLC-MS/MS) có độ nhạy rất cao nhưng đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, chi phí vận hành lớn và quy trình chuẩn bị mẫu phức tạp, chưa phổ biến tại các cơ sở y tế tuyến cơ sở ở Việt Nam. Ngược lại, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò tử ngoại (HPLC-UV) có ưu thế về chi phí, độ bền hóa học, độ tin cậy và sự phổ biến của trang thiết bị. Tại thời điểm nghiên cứu, ở Việt Nam chưa có công bố hoàn chỉnh về quy trình định lượng itraconazol trong huyết tương người phục vụ TDM bằng phương pháp này.
Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
Đề tài xác định 2 mục tiêu cụ thể:
- Khảo sát các điều kiện sắc ký HPLC và điều kiện xử lý mẫu để tách và định lượng itraconazol trong nền mẫu huyết tương.
- Thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (US-FDA).
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Hoạt chất Itraconazol trong mẫu huyết tương người mô phỏng (in vitro).
- Phạm vi không gian: Đề tài được thực hiện tại Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Dược Hà Nội.
- Thời gian hoàn thành: Năm 2024.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Khung lý thuyết và mô hình nghiên cứu
- Cơ sở dược động học và TDM của Itraconazol: Cấu tạo hóa học $C_{35}H_{38}Cl_2N_8O_4$ (khối lượng phân tử lớn, base yếu với $pK_a = 3,7$, tính tan kém trong nước, dễ tan trong methylen clorid). Thuốc chuyển hóa qua gan thành chất chuyển hóa có hoạt tính chính là hydroxy-itraconazol (H-ITZ) và các chất không hoạt tính như keto-itraconazol (KTZ-ITZ) và N-desalkyl itraconazol (ND-ITZ).
- Nguyên lý sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC): Dựa trên cơ chế phân bố giữa pha tĩnh không phân cực (cột liên kết alkyl $C_8$) và pha động phân cực gồm dung môi hữu cơ (acetonitril) và dung dịch đệm muối phosphat.
- Khung thẩm định phương pháp phân tích sinh học: Quy trình thẩm định tuân thủ đầy đủ Hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học của US-FDA (Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry), bao gồm các tiêu chí: độ chọn lọc, độ phù hợp hệ thống, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới (LLOQ), độ đúng, độ chính xác (trong ngày và khác ngày), hiệu suất thu hồi (chiết tách) và độ ổn định của mẫu.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Phương pháp chuẩn bị và xử lý mẫu: Áp dụng phương pháp tủa protein huyết tương bằng dung môi hữu cơ acetonitril (MeCN) theo tỷ lệ thể tích huyết tương : dung môi là 1 : 2,5 (v/v), kết hợp lắc xoáy và ly tâm tách lấy dịch trong bên trên để tiêm vào hệ thống sắc ký.
- Phương pháp phân tích sắc ký: Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với đầu dò tử ngoại (UV/DAD) ở bước sóng hấp thụ cực đại 262 nm, chế độ rửa giải đẳng dòng (isocratic).
- Phương pháp chuẩn hóa: Sử dụng phương pháp chất chuẩn nội (Internal Standard - IS) với Ketoconazol để bù trừ các sai số trong quá trình xử lý mẫu và tiêm mẫu.
Nguồn nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
- Chất chuẩn phân tích:
- Chất chuẩn Itraconazol (độ tinh khiết 99,2%, số lô QT236 0423) do Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương cung cấp.
- Chất chuẩn nội Ketoconazol (độ tinh khiết 99,36%, SKS: C0219053.02) do Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh cung cấp.
- Nền mẫu sinh học: Huyết tương trắng người (mã số 20PO184747) do Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương cung cấp.
- Hóa chất, dung môi: Acetonitril (chuẩn dùng cho HPLC), natri dihydrophosphat ($NaH_2PO_4$), acid phosphoric ($H_3PO_4$), methanol (MeOH) và nước cất siêu sạch.
- Hệ thống thiết bị chính: Hệ thống sắc ký lỏng HPLC Agilent 1200 / 1100 (Mỹ) trang bị đầu dò DAD; cột sắc ký phân tích InterSustain $C_8$ ($150 \times 4,6\text{ mm}$, kích thước hạt $5\text{ µm}$) kèm tiền cột bảo vệ $C_8$; cân phân tích A&D GR-200 (Nhật); máy ly tâm Kubota 6500 (Nhật); máy lắc xoáy Labinco L46 (Hà Lan); tủ lạnh âm sâu -86°C Panasonic (Nhật).
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 1 tổng hợp có hệ thống ba nhóm dữ liệu chính:
- Tổng quan về dược chất Itraconazol: Tính chất lý hóa, cơ chế ức chế tổng hợp ergosterol ở màng tế bào nấm, chỉ định lâm sàng, các đặc tính dược động học đặc thù (hấp thu thất thường, phân bố mô cao, liên kết protein 99%, chuyển hóa mạnh qua CYP3A4, thời gian bán thải kéo dài từ 39,7 đến 64 giờ) và căn cứ xác lập khoảng trị liệu TDM.
- Nguyên lý sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Bản chất quá trình sắc ký pha đảo, cấu tạo thiết bị, các đại lượng đặc trưng của quá trình tách sắc ký (thời gian lưu $t_R$, hệ số dung lượng $k'$, hệ số chọn lọc $\alpha$, độ phân giải $R_s$).
- Tổng quan các phương pháp định lượng Itraconazol trong dịch sinh học: Đánh giá ưu nhược điểm của các phương pháp vi sinh, phương pháp miễn dịch và sắc ký (HPLC-UV, HPLC-FL, LC-MS/MS). Tác giả tổng hợp 17 nghiên cứu quốc tế và 2 nghiên cứu trong nước, so sánh cụ thể về kỹ thuật xử lý mẫu (chiết lỏng - lỏng, chiết pha rắn SPE, tủa protein), pha động, chất chuẩn nội và giới hạn LLOQ.
Chương 2: Nguyên vật liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 mô tả chi tiết quy trình chuẩn bị các dãy dung dịch và quy chuẩn thẩm định:
- Quy trình chuẩn bị dung dịch: Chuẩn gốc ITZ $1000\text{ µg/mL}$, chuẩn nội KTZ $30\text{ µg/mL}$, các dung dịch làm việc trung gian ($G_1 - G_8$ tương ứng $2 - 200\text{ µg/mL}$) và dãy mẫu chuẩn trong huyết tương ($C_1 - C_8$ tương ứng nồng độ $0,1 - 10,0\text{ µg/mL}$).
- Quy định nồng độ các mẫu kiểm soát chất lượng (QC): Mẫu LLOQ ($0,1\text{ µg/mL}$), mẫu LQC ($0,25\text{ µg/mL}$), mẫu MQC ($2,5\text{ µg/mL}$) và mẫu HQC ($7,5\text{ µg/mL}$).
- Quy trình thẩm định: Thiết lập các tiêu chuẩn chấp thuận chi tiết cho 8 chỉ tiêu theo hướng dẫn của US-FDA.
Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận
Chương 3 trình bày toàn bộ kết quả thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện phân tích và dữ liệu thẩm định:
1. Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện sắc ký
- Lựa chọn chất chuẩn nội: Ketoconazol được lựa chọn do có cấu trúc tương đồng nhóm azol, tính chất hóa lý gần với ITZ, pic sắc ký phân tách hoàn toàn, phổ biến tại Việt Nam và không dùng phối hợp với ITZ trong các phác đồ điều trị của Bộ Y tế.
- Lựa chọn bước sóng phát hiện: Phổ quét tử ngoại cho thấy ITZ có cực đại hấp thụ tại bước sóng $262\text{ nm}$, cho đáp ứng diện tích pic tối ưu và hạn chế nhiễu đường nền.
- Lựa chọn thành phần pha động và tốc độ dòng: Khảo sát các tỷ lệ hỗn hợp Acetonitril và dung dịch đệm phosphat $10\text{ mM}$ (pH 6,8) với tốc độ dòng $1,0\text{ mL/phút}$:
- Tỷ lệ 50:50 (v/v): Pic tách tốt nhưng thời gian lưu ITZ kéo dài ($23,683\text{ phút}$).
- Tỷ lệ 55:45 (v/v): Thời gian lưu ITZ giảm xuống $13,207\text{ phút}$.
- Tỷ lệ 60:40 (v/v): Đạt độ phân giải tối ưu ($R_s > 1,5$), thời gian lưu của IS là $3,958\text{ phút}$ và của ITZ là $8,440\text{ phút}$, pic đối xứng, tổng thời gian phân tích dưới $10\text{ phút}$, phù hợp cho phân tích thường quy. Khảo sát chế độ rửa giải gradient không cho thấy sự vượt trội so với chế độ đẳng dòng 60:40.
- Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu: Tủa protein bằng Acetonitril với tỷ lệ huyết tương : MeCN là 1 : 2,5 (v/v) ($200\text{ µL}$ huyết tương + $100\text{ µL}$ dung dịch IS $30\text{ µg/mL}$ + $400\text{ µL}$ MeCN) cho dịch chiết trong suốt, loại bỏ triệt để protein và giữ độ thu hồi cao.
| Thông số sắc ký |
Điều kiện tối ưu được lựa chọn |
| Cột sắc ký |
InterSustain $C_8$ ($150 \times 4,6\text{ mm}$; $5\text{ µm}$) kèm tiền cột $C_8$ |
| Pha động |
Acetonitril : Đệm phosphat $10\text{ mM}$ (pH 6,8) tỷ lệ 60 : 40 (v/v) |
| Tốc độ dòng |
$1,0\text{ mL/phút}$ |
| Bước sóng detector UV |
$262\text{ nm}$ |
| Thể tích tiêm mẫu |
$50\text{ µL}$ |
| Chất chuẩn nội (IS) |
Ketoconazol ($30\text{ µg/mL}$) |
| Thời gian phân tích |
Khoảng $10\text{ phút}$ ($t_R\text{ IS} \approx 3,96\text{ phút}$; $t_R\text{ ITZ} \approx 8,44\text{ phút}$) |
2. Kết quả thẩm định phương pháp theo US-FDA
- Độ chọn lọc: Sắc ký đồ 6 mẫu huyết tương trắng từ các nguồn khác nhau không xuất hiện pic tạp tại thời gian lưu của ITZ và KTZ. Đáp ứng tín hiệu tại vị trí lưu của ITZ trên mẫu trắng bằng 0 (thỏa mãn quy định $< 20%$ tín hiệu mẫu LLOQ; thực tế đáp ứng mẫu LLOQ gấp $> 5$ lần mẫu trắng).
- Độ phù hợp hệ thống ($n=6$ tại nồng độ $2,5\text{ µg/mL}$): Hệ số biến thiên ($CV%$) của thời gian lưu ITZ là $0,150%$, của IS là $0,041%$; $CV%$ của diện tích pic ITZ là $0,459%$, của IS là $0,351%$; $CV%$ của tỷ lệ diện tích pic ITZ/IS là $0,772%$ (đều đạt yêu cầu $< 2,0%$).
- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn: Tuyến tính trong khoảng nồng độ $0,1 - 10,0\text{ µg/mL}$ với phương trình hồi quy $y = 0,2439x + 0,001$, hệ số xác định $R^2 = 0,9990$ ($R = 0,9995$). Độ chệch của các điểm chuẩn nằm trong khoảng $-3,3%$ đến $5,0%$, riêng điểm LLOQ có độ chệch $13,4%$ (thỏa mãn tiêu chuẩn US-FDA $< 15%$, LLOQ $< 20%$).
- Giới hạn định lượng dưới (LLOQ): Đạt $0,1\text{ µg/mL}$ với độ đúng trung bình $94,1%$ (khoảng $84,0 - 112,9%$), độ lặp lại $CV = 11,8%$ ($< 20%$).
- Độ đúng và độ chính xác:
- Trong ngày ($n=5$): Mẫu LLOQ có độ đúng $109,7%$, $CV = 6,3%$; LQC đạt $101,7%$, $CV = 2,0%$; MQC đạt $99,5%$, $CV = 2,6%$.
- Khác ngày (3 ngày phân tích độc lập): Độ đúng của LQC, MQC, HQC nằm trong khoảng $96,0 - 104,3%$ với $CV \le 5,4%$; mẫu LLOQ có độ đúng trong khoảng $90,5 - 119,2%$ với $CV$ từ $4,4%$ đến $9,8%$.
- Hiệu suất thu hồi:
- Hoạt chất ITZ: Độ thu hồi tại 3 mức nồng độ LQC, MQC, HQC đạt từ $103,42%$ đến $106,63%$, giá trị $CV$ từ $2,19%$ đến $3,64%$.
- Chuẩn nội KTZ: Độ thu hồi đạt từ $103,44%$ đến $108,26%$, giá trị $CV$ từ $0,86%$ đến $2,88%$.
- Độ ổn định:
- Dung dịch chuẩn gốc và chuẩn làm việc ổn định sau 6 giờ ở nhiệt độ phòng (chênh lệch nồng độ $0,2 - 5,0%$).
- Mẫu chuẩn trong huyết tương ổn định sau 6 giờ ở nhiệt độ phòng (sai khác $0,2 - 4,9%$, $CV \le 4,8%$).
- Mẫu huyết tương sau xử lý ổn định trong 24 giờ khi bảo quản ở $2 - 8^\circ\text{C}$ (sai khác $0,8 - 6,6%$, $CV \le 4,02%$).
- Mẫu huyết tương ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã đông (từ -86°C sang nhiệt độ phòng).
Kết quả và đóng góp
Bảng tổng hợp kết quả thẩm định phương pháp
| Chỉ tiêu thẩm định |
Tiêu chuẩn chấp thuận (US-FDA) |
Kết quả thực nghiệm đạt được |
Đánh giá |
| Độ chọn lọc |
Nhiễu nền tại $t_R \le 20%$ LLOQ |
Không có pic tạp; đáp ứng LLOQ $> 5$ lần mẫu trắng |
Đạt |
| Độ phù hợp hệ thống |
$CV% \le 2,0%$ |
$CV(t_R) \le 0,15%$; $CV(\text{Diện tích}) \le 0,46%$ |
Đạt |
| Khoảng tuyến tính |
$R^2 > 0,99$; Độ chệch $\le 15%$ (LLOQ $\le 20%$) |
$0,1 - 10,0\text{ µg/mL}$; $y = 0,2439x + 0,001$; $R^2 = 0,9990$ |
Đạt |
| Giới hạn LLOQ |
$0,1\text{ µg/mL}$; Độ đúng $80 - 120%$; $CV \le 20%$ |
Độ đúng $84,0 - 112,9%$ (TB $94,1%$); $CV = 11,8%$ |
Đạt |
| Độ đúng trong ngày |
$85 - 115%$ (LLOQ $80 - 120%$) |
$99,5 - 109,7%$ |
Đạt |
| Độ chính xác trong ngày |
$CV \le 15%$ (LLOQ $\le 20%$) |
$2,0 - 6,3%$ |
Đạt |
| Độ đúng khác ngày |
$85 - 115%$ (LLOQ $80 - 120%$) |
$90,5 - 119,2%$ |
Đạt |
| Độ chính xác khác ngày |
$CV \le 15%$ (LLOQ $\le 20%$) |
$4,4 - 9,8%$ |
Đạt |
| Hiệu suất thu hồi |
Đồng nhất giữa các mức, $CV \le 15%$ |
ITZ: $103,42 - 106,63%$ ($CV \le 3,64%$); KTZ: $103,44 - 108,26%$ |
Đạt |
| Độ ổn định mẫu |
Sai khác $\le 15%$; $CV \le 15%$ |
Ổn định sau 6h ở nhiệt độ phòng, 24h ở $2-8^\circ\text{C}$ sau xử lý, 3 chu kỳ đông - rã |
Đạt |
Giải pháp và khuyến nghị áp dụng
- Quy trình phân tích định lượng bằng HPLC-UV đã xây dựng có thể áp dụng trực tiếp tại các phòng kiểm nghiệm thuốc, trung tâm phân tích sinh học và khoa dược của các bệnh viện phục vụ giám sát nồng độ trị liệu (TDM) của itraconazol trên bệnh nhân điều trị nấm nặng.
- Kỹ thuật tủa protein một bước bằng MeCN giúp rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu, tiết kiệm dung môi và giảm thiểu chi phí xét nghiệm so với các phương pháp chiết pha rắn hay sắc ký khối phổ.
Đóng góp khoa học và thực tiễn
- Khóa luận đã xây dựng thành công quy trình định lượng Itraconazol trong huyết tương bằng HPLC-UV với giới hạn định lượng dưới đạt $0,1\text{ µg/mL}$, bao phủ toàn bộ khoảng nồng độ trị liệu cần theo dõi lâm sàng ($0,25 - 5,0\text{ µg/mL}$).
- Chứng minh tính khả thi của việc sử dụng Ketoconazol làm chất chuẩn nội cho phân tích sắc ký Itraconazol trong huyết tương, tối ưu hóa thời gian rửa giải đẳng dòng xuống dưới $10\text{ phút}$.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của đề tài
- Quá trình thẩm định phương pháp được thực hiện hoàn toàn trên nền mẫu huyết tương người mô phỏng (spiked plasma in vitro), chưa tiến hành phân tích trên mẫu huyết tương bệnh nhân thực tế đang điều trị bằng Itraconazol.
- Phương pháp sắc ký chỉ định lượng đơn lẻ hoạt chất mẹ Itraconazol, chưa tích hợp định lượng đồng thời chất chuyển hóa có hoạt tính hydroxy-itraconazol (H-ITZ).
- Chưa khảo sát ảnh hưởng tương tác của các thuốc chống nấm hoặc kháng sinh dùng kèm thường gặp trong phác đồ điều trị phối hợp trên lâm sàng.
Hướng nghiên cứu tiếp
- Mở rộng và phát triển phương pháp để định lượng đồng thời cả Itraconazol và chất chuyển hóa Hydroxy-itraconazol trong cùng một lần chạy sắc ký.
- Ứng dụng quy trình phân tích trên cỡ mẫu bệnh nhân lâm sàng tại bệnh viện để đánh giá nồng độ đáy thực tế, khảo sát tương quan dược động học và hỗ trợ hiệu chỉnh liều cá thể hóa.
Giá trị tham khảo
Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên môn hữu ích cho các đối tượng và mục đích nghiên cứu sau:
- Sinh viên, học viên cao học chuyên ngành Dược: Cung cấp tài liệu thực hành hoàn chỉnh về các bước xây dựng, tối ưu hóa điều kiện sắc ký pha đảo và quy trình thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học theo đúng hướng dẫn chuẩn của US-FDA.
- Nghiên cứu viên và kiểm nghiệm viên: Cung cấp thông số vận hành thực nghiệm chính xác (loại cột $C_8$, thành phần pha động, tỷ lệ tủa protein, điều kiện detector $262\text{ nm}$) để triển khai định lượng thuốc nhóm triazol trong huyết tương mà không cần đầu tư hệ thống LC-MS/MS đắt tiền.
- Dược sĩ lâm sàng: Cung cấp cơ sở dữ liệu về dược động học, nồng độ mục tiêu và phương pháp giám sát TDM của Itraconazol trong tối ưu hóa hiệu quả điều trị nấm xâm lấn.
Câu hỏi thường gặp
1. Tại sao đề tài lựa chọn Ketoconazol làm chất chuẩn nội (IS)?
Ketoconazol có cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa tương đồng với Itraconazol (cùng nhóm azol), cho pic sắc ký phân tách rõ ràng ($t_R \approx 3,96\text{ phút}$) trước pic của Itraconazol ($t_R \approx 8,44\text{ phút}$) với độ phân giải $R_s > 1,5$. Đồng thời, Ketoconazol dễ tìm mua tại Việt Nam với độ tinh khiết cao ($99,36%$) và không được dùng đồng thời với Itraconazol trên lâm sàng theo phác đồ của Bộ Y tế, tránh được hiện tượng trùng pic ngoại sinh.
2. Tỷ lệ xử lý mẫu huyết tương bằng phương pháp tủa protein được lựa chọn là bao nhiêu?
Tỷ lệ thể tích được lựa chọn là 1 phần huyết tương : 2,5 phần Acetonitril ($1 : 2,5\text{ v/v}$). Thể tích cụ thể gồm $200\text{ µL}$ huyết tương + $100\text{ µL}$ dung dịch chuẩn nội Ketoconazol + $400\text{ µL}$ Acetonitril. Tỷ lệ này đảm bảo kết tủa hoàn toàn protein tạp, dịch nổi trong suốt, ít pic nhiễu trên đường nền sắc ký và cho hiệu suất thu hồi hoạt chất đạt trên $103%$.
3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) của phương pháp là bao nhiêu và có đáp ứng yêu cầu TDM lâm sàng không?
Giới hạn LLOQ đạt được là $0,1\text{ µg/mL}$ ($100\text{ ng/mL}$). Giới hạn này hoàn toàn đáp ứng yêu cầu theo dõi TDM trên lâm sàng, vì nồng độ đáy mục tiêu của Itraconazol trong điều trị dự phòng là $\ge 0,25\text{ mg/L}$ ($0,25\text{ µg/mL}$) và trong phác đồ điều trị nhiễm nấm là $0,5 - 5,0\text{ mg/L}$ ($0,5 - 5,0\text{ µg/mL}$).
4. Thành phần pha động và bước sóng phát hiện tối ưu được thiết lập trong nghiên cứu là gì?
Pha động tối ưu là hỗn hợp Acetonitril và dung dịch đệm phosphat $10\text{ mM}$ pH 6,8 theo tỷ lệ thể tích $60 : 40\text{ (v/v)}$, chạy đẳng dòng ở tốc độ $1,0\text{ mL/phút}$. Bước sóng phát hiện trên đầu dò UV là $262\text{ nm}$, tương ứng với cực đại hấp thụ của Itraconazol.
5. Mẫu huyết tương sau khi xử lý có thể bảo quản ổn định trong bao lâu trước khi tiêm sắc ký?
Theo kết quả thẩm định độ ổn định, mẫu huyết tương sau khi xử lý tủa protein và tách dịch nổi có thể bảo quản ổn định trong vòng 24 giờ ở điều kiện nhiệt độ $2 - 8^\circ\text{C}$ với độ sai khác nồng độ tìm lại chỉ từ $0,8%$ đến $6,6%$ ($CV \le 4,02%$).
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Triệu Thị Linh đã xây dựng và thẩm định thành công phương pháp định lượng Itraconazol trong huyết tương người bằng kỹ thuật HPLC-UV kết hợp xử lý mẫu tủa protein một bước bằng Acetonitril. Phương pháp đạt độ chọn lọc cao, khoảng tuyến tính rộng ($0,1 - 10,0\text{ µg/mL}$), giới hạn định lượng dưới LLOQ đạt $0,1\text{ µg/mL}$, cùng độ đúng, độ chính xác, hiệu suất thu hồi và độ ổn định đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn nghiêm ngặt của US-FDA. Kết quả nghiên cứu cung cấp một quy trình phân tích kinh tế, nhanh chóng và tin cậy, có khả năng ứng dụng thực tiễn cao trong hoạt động giám sát nồng độ thuốc trong máu (TDM) phục vụ điều trị cá thể hóa tại các cơ sở y tế.
