Phân Tích Phương Pháp Điện Di và Blotting Trong Nghiên Cứu Biomolecules

Chuyên khảo phân tích Thiet bi va ktcnsh 3 bis electrophoresis blotting, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo.

• Trường học: Đại học Nông Lâm
• Đề tài: Phân Tích Phương Pháp Điện Di và Blotting Trong Nghiên Cứu Biomolecules
• Loại tài liệu: bài giảng
• Địa điểm: TP Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• 1. MỤC ĐÍCH
• 1.1. Trang bò kiến thức về điện di
• 1.2. Kiến thức về Blotting
• 2. Caùc baïn seõ hieåu ñöôïc
• 2.1. Khái niệm cơ bản về điện di
• 2.2. Caùc loaïi gel
• 2.3. Caùc phöông phaùp dieän di
• 2.4. Kiến thức về Blotting
• 3. Caùc Phöông phaùp ñieän di vaø chuyeån leân maøng lai Trong Phaân tích
• 3.1. Khái niệm cơ bản
• 3.2. Điện di trên Gel Gel Electrophoresis
• 3.2.1. Tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, Protein)
• 3.2.2. Toác ñoä di chuyeån cuûa protein trong ñieän tröôøng
• 3.2.3. Gel
• 3.2.4. Caáu truùc cuûa gel Agarose töông töï Acrylamid
• 3.2.5. Gel polyacrylamide ñöôïc hình thaønh bôûi quaù trình ñoàng truøng hôïp
• 3.2.6. Polyacrylamide gels (PAA)
• 3.2.7. Phaûn öùng taïo thaønh gel
• 3.2.8. Caùc heä dung dòch ñeäm duøng trong ñieän di protein
• 3.2.8.1. Continuous Buffer system (heä ñeäm lieân tuïc)
• 3.2.8.2. Discontinuous buffer system (heä ñeäm khoâng lieân tuïc)
• 3.2.9. Caùc chaát taåy röûa vaø chaát bieán tính
• 3.2.9.1. SDS
• 3.2.9.2. UREÙA
• 3.2.9.3. LDS
• 3.2.9.4. Formamide
• 3.2.10. Chuaùn bò maãu
• 3.2.11. Caùc thieát bò duøng trong ñieän di
• 3.2.12. Caùc ñieàu kieën veà ñieän theá
• 3.2.13. Phaùt hieän sau khi ñieän di
• 3.2.13.1. Phaùt hieän protein
• 3.2.13.2. Phaùt hieän DNA
• 3.2.14. Xaùc ñònh khoái löôïng phaân töû
• 3.2.15. Caùc loaïi gel ñaëc bieät
• 3.2.15.1. Gel theo gradient
• 3.2.15.2. Gel Ñieän di hai chieàu
• 3.2.16. Electrophoresis Isoelectric Focusing (IEF)
• 3.2.16.1. Chuån bò maãu duøng IEF – Heä Rotofor
• 3.2.17. Immunoelectrophoresis (IEP)
• 3.3. Kyõ thuaät chuyeån leân maøng lai (Blotting Techniques)
• 3.3.1. Ñieän di treân Gel (agarose hay acrylamide)
• 3.3.2. Chuyeån leân maøng ñeå coá ñònh nhö laø phieân baûn cuûa caùc band treên gel
• 3.4. Phöông phaùp mao daãn coå ñieån
• 3.5. Phöông phaùp huùt chaân khoâng
• 3.6. Phöông phaùp ñieän daãn

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phương Pháp Điện Di và Blotting Trong Nghiên Cứu Biomolecules

Phương pháp điện di và blotting là hai kỹ thuật quan trọng trong nghiên cứu biomolecules. Chúng giúp phân tích và xác định cấu trúc của các phân tử sinh học như DNA, RNA và protein. Kỹ thuật điện di cho phép tách biệt các phân tử dựa trên kích thước và điện tích, trong khi blotting giúp chuyển các phân tử này lên màng để phân tích sâu hơn. Sự kết hợp của hai phương pháp này mang lại cái nhìn toàn diện về các phân tử sinh học.

1.1. Khái Niệm Cơ Bản Về Điện Di

Điện di là quá trình tách biệt các phân tử dựa trên điện tích và kích thước của chúng. Các loại gel như agarose và polyacrylamide thường được sử dụng trong quá trình này. Phương pháp này rất hữu ích trong việc phân tích DNA, RNA, và protein.

1.2. Khái Niệm Cơ Bản Về Blotting

Blotting là kỹ thuật chuyển các phân tử từ gel lên màng để phân tích. Có nhiều loại blotting như Western blot, Northern blot, và Southern blot. Mỗi loại có ứng dụng riêng trong việc xác định và phân tích các phân tử sinh học.

II. Vấn Đề và Thách Thức Trong Phân Tích Biomolecules

Mặc dù phương pháp điện di và blotting rất hiệu quả, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong quá trình phân tích biomolecules. Các vấn đề như độ nhạy, độ chính xác và khả năng tái lập kết quả là những yếu tố quan trọng cần được xem xét. Ngoài ra, việc lựa chọn gel và điều kiện điện di cũng ảnh hưởng đến kết quả phân tích.

2.1. Độ Nhạy và Độ Chính Xác

Độ nhạy của phương pháp điện di có thể bị ảnh hưởng bởi nồng độ mẫu và điều kiện điện di. Độ chính xác trong việc xác định kích thước và số lượng phân tử cũng là một thách thức lớn.

2.2. Lựa Chọn Gel và Điều Kiện Điện Di

Việc lựa chọn loại gel phù hợp và điều chỉnh các thông số như điện áp và thời gian điện di là rất quan trọng. Sự không đồng nhất trong gel có thể dẫn đến kết quả không chính xác.

III. Phương Pháp Điện Di Trong Phân Tích Biomolecules

Phương pháp điện di được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu biomolecules. Các kỹ thuật như SDS-PAGE và agarose gel electrophoresis cho phép phân tích và tách biệt các phân tử sinh học. SDS-PAGE đặc biệt hữu ích trong việc phân tích protein, trong khi agarose gel thường được sử dụng cho DNA và RNA.

3.1. Kỹ Thuật SDS PAGE

SDS-PAGE là một phương pháp điện di sử dụng sodium dodecyl sulfate để biến tính protein. Kỹ thuật này giúp tách biệt protein dựa trên kích thước của chúng, cho phép phân tích chính xác hơn.

3.2. Kỹ Thuật Agarose Gel Electrophoresis

Agarose gel electrophoresis là phương pháp phổ biến để phân tích DNA và RNA. Kỹ thuật này cho phép tách biệt các phân tử nucleic acid dựa trên kích thước, giúp xác định cấu trúc và độ tinh khiết của mẫu.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Phương Pháp Điện Di và Blotting

Các phương pháp điện di và blotting có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử. Chúng được sử dụng để xác định cấu trúc protein, phân tích gene và nghiên cứu các bệnh lý. Kết quả từ các phương pháp này cung cấp thông tin quý giá cho các nghiên cứu lâm sàng và phát triển thuốc.

4.1. Phân Tích Protein

Phương pháp điện di và blotting giúp xác định cấu trúc và chức năng của protein. Điều này rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh lý và phát triển thuốc.

4.2. Nghiên Cứu Gene

Các kỹ thuật này cũng được sử dụng để phân tích gene, giúp xác định các biến thể di truyền và nghiên cứu các bệnh di truyền.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Phương Pháp Điện Di và Blotting

Phương pháp điện di và blotting đã chứng minh được giá trị của chúng trong nghiên cứu biomolecules. Tương lai của các phương pháp này hứa hẹn sẽ có nhiều cải tiến về độ nhạy và độ chính xác. Sự phát triển của công nghệ mới sẽ mở ra nhiều cơ hội cho nghiên cứu sinh học phân tử.

5.1. Cải Tiến Công Nghệ

Công nghệ mới như điện di mao quản và các phương pháp tự động hóa sẽ nâng cao hiệu quả và độ chính xác của phân tích biomolecules.

5.2. Ứng Dụng Trong Nghiên Cứu Lâm Sàng

Các phương pháp này sẽ tiếp tục được áp dụng trong nghiên cứu lâm sàng, giúp phát hiện và điều trị bệnh hiệu quả hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Caùc Phöông phaùp ñieän di vaø chuyeån leân maøng lai trong phaân tích Electrophoresis and Blotting methods in Analysis of Biomolecules Ñaïi hoïc Noâng Laâm TP Hoà Chí Minh Muïc ñích 1. Trang bò kieán thöùc veà ñieän di 2. Kieán thöùc veà Blotting Caùc baïn seõ hieåu ñöôïc: 1. Khaùi nieäm cô baûn veà ñieän di 2.

Caùc loaïi gel 3. Caùc phöông phaùp dieän di 4. Kieán thöùc veà Blotting Caùc Phöông phaùp ñieän di vaø chuyeån leân maøng lai Trong Phaân tích Khaùi nieäm cô baûn Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis - Taùch caùc phaân töû sinh hoïc (DNA, RNA, Protein) baèng caùch cho ñi qua chaát neàn laø Gel trong moät ñieän tröôøng. Ngöôøi ta thöôøng söû duïng caùc loaïi gel agarose hay polyacrylamide.

- DNA hay RNA thöôøng tích ñieän aâm. Trong ñieän di treân gel, maãu ñöôïc cho vaøo nhöõng gieáng naèm gaàn dieän cöïc aâm vaø DNA hay RNA seõ di chuyeån veà phía cöïc döông. Söï di chuyeån tæ leä nghòch vôùi kích thöôùc phaân töû, phaân töû caøng nhoû caøng di chuyeån nhanh. - Protein coù khaù nhieàu ñieän tích treân beà maët, cho neân chuùng thöôøng ñöôïc xöû lyù vôùi SDS ñeå chuyeån sang daïng tích ñieän aâm.

Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Söï di chuyeån cuûa caùc phaàn töû mang ñieän trong ñieän tröôøng ñöôïc goïi laø Ñieän di (Electrophoresis) Moät phaân töû coù ñieän tích q trong moät ñieän tröôøng E taïo ra moät löïc F =q.E Ñieän di treân gel ñaõ laø phöông phaùp phaân tích höõu duïng trong caùc pheùp phaân tích sinh-hoaù hoïc. Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Toác ñoä di chuyeån cuûa protein trong ñieän tröôøng: V = Ez/f V: toác ñoä di chuyeån E: Löïc ñieän tröôøng z: Ñieän tích cuûa protein f: Heä soá ma saùt, tuøy thuoäc vaøo khoái löôïng vaø hình daïng protein vaø ñoä nhôùt cuûa moâi tröôøng. •GEL Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Gel: Traïng thaùi trung gian giöõa hai pha raén vaø loûng Caùc vaät lieäu duøng laøm gel: Starch, Agarose, Acrylamide… Caáu truùc cuûa gel Agarose töông töï Acrylamid: Maïng löôùi caáu truùc ba chieàu. Agarose: caàu noái hydrogen giöõa caùc thaønh phaàn.

Polyacrylamide: caùc noái cheùo ñoàng hoùa trò giöõa caùc fiber vaø acrylamide Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Agarose: polysaccharide töï nhieân ñöôïc phaân laäp töø taûo bieån, coù kích thöôùc loå gel lôùn, thích hôïp cho phaân taùch caùc phaân töû coù kích thöôùc lôùn vaø ñieän di döïa treân ñoä tích ñieän Duøng ñeå phaân taùch caùc protein > 500kDa vaø caùc DNA coù kích thöôùc > 2000bp. Caùc loaïi agarose khaùc nhau döïa treân caùc ñaëc tính lyù hoùa nhö nhieät ñoä ñoâng ñaëc, ñoä dai, kích thöôùc loå gel, vaø ñoä ñieän thaåm. Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Acrylamide: laø saûn phaåm toång hôïp, coù - pH oån ñònh - Trô - Trong suoát - Coù theå hình thaønh nhieàu gel coù kích thöôùc loå gel khaùc nhau Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Gel polyacrylamide ñöôïc hình thaønh bôûi quaù trình ñoàng truøng hôïp giöõa acrylamide (CH2=CH-CO-NH2) vaø cross linker, thoâng thöôøng laø N,N’-methylenebisacrylamide (bis acrylamide – CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2) + Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Gel Polyacrylamide (PAGE) a) Chöùc naêng: Löôùi phaân töû b) Kích thöôùc loå gel ñöôïc xaùc ñònh theo noàng ñoä cuûa acrylamide vaø linker c) Noàng ñoä thoâng thöôøng: 15% gel d) Theo gradient: 5 – 25% gel. Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Quaù trình hình thaønh gel ñöôïc khôûi ñoäng khi theâm vaøo (NH4)2SO4 vaø chaát gia toác (accelerator) laø tetramethylethylenediamine (TEMED).

TEMED laøm taêng toác ñoä phaân huûy (NH4)2SO4 thaønh 2 nhoùm sulfate töï do, caùc goác töï do naøy khôûi ñoäng quaù trình taïo thaønh gel. Söï polyme hoùa acrylamide seõ laø ngaãu nhieân neáu khoâng coù crosslinker, laø moät dung dòch nhôùt => Crosslinker = kích thöôùc caùc loå trong gel. Ñieän di treân Gel Gel Electrophoresis Toác ñoä hình thaønh gel phuï thuoäc vaøo ba yeáu toá: - Noàng ñoä cuûa caùc monomer vaø caùc goác töï do - Nhieät ñoä - Ñoä tinh khieát cuûa hoùa chaát söû duïng Chuù yù: - TEMED phaûi ôû daïng caùc base töï do neân khoâng chuaån bò gel ôû pH thaáp. - Oxy laø taùc nhaân öùc cheá söï taïo thaønh baûn gel.

Loaïi khí caùc dung dòch tröôùc khi chuaån bò gel. Polyacrylamide gels (PAA) Theo quy öôùc, PAA ñöôïc moâ taû döïa treân 2 giaù trò xaùc ñònh kích thöôùc caùc loã trong gel: %T hay % khoái löôïng caùc monomer % C hay % khoái löôïng cross linker AA: Acrylamide; CL: Cross Linker Polyacrylamide gels (PAA) Protein: 30%T vaø 2.5ml nöôùc caát * Coù theå loïc dung dòch monomer naøy vaø caát giöõ laïnh ñeå söû duïng. Nucleic Acid: 30%T vaø 3.3%C 29g Acrylamide 1g Bisacrylamide * Acrylamide laø hoùa chaát ñoäc, traùnh tieáp xuùc tröïc tieáp. Polyacrylamide gels (PAA) Phaûn öùng taïo thaønh gel Noàng ñoä APS vaø TEMED 0.05% ñuû ñeå gaây ñoâng gel ñoái vôùi gel bình thöôøng.

Quaù trình ñoâng thaønh gel xaûy ra sau 15 – 20 phuùt sau khi cho hai chaát naøy vaøo dung dòch monomer. Gel ñoâng hoaøn toaøn sau 90 phuùt. 1% APS vaø TEMED duøng cho stacking gel Gel khoâng oån ñònh ôû pH töø 4 – 6. Gel bò thuûy phaân khi löu tröõ: nhoùm carboxamide (-CO-NH2) bò thuûy phaân giaûi phoùng nhoùm carboxyl (-COO-).

=> Toát nhaát söû duïng gel môùi cho moãi laàn thí nghieäm Caùc heä dung dòch ñeäm duøng trong ñieän di protein Buffer xaùc ñònh ñieàu kieän doøng ñieän vaø coù aûnh höôûng leân söï phaân taùch vaø ñoä phaân giaûi protein trong quaù trình ñieän di. Continuous Buffer system (heä ñeäm lieân tuïc) trong gel vaø buffer coù ion nhö nhau (ôû pH oån ñònh): thöôøng söû duïng trong ñieän di caùc acid nucleic vaø protein coù noàng ñoä 1mg/ml hay cao hôn. Maãu ñöôïc tra tröïc tieáp vaøo gel, vaø taùch ra khi ñieän di. Ñoái vôùi gel coù kích thöôùc loå gel khoâng ñoåi, heä ñeäm lieân tuïc caàn söû duïng maãu coù noàng ñoä cao ñeå cho keát quaû toát hôn.

Caùc heä dung dòch ñeäm duøng trong ñieän di protein Discontinuous buffer system (heä ñeäm khoâng lieân tuïc) ion khaùc nhau giöõa gel vaø buffer: caàn ñoä phaân giaûi cao. Trong kyõ thuaät naøy, maãu ñöôïc tra vaøo moät lôùp gel (stacking gel) coù vai troø nhö laø moät moâi tröôøng giuùp cho toaøn boä löôïng maãu taäp trung treân beà maët resolving gel, giuùp cho keát quaû ñieän di coù ñoä phaân giaûi cao. Caùc heä dung dòch ñeäm duøng trong ñieän di protein Heä buffer khoâng lieân tuïc söû duïng phoå bieán nhaát laø Laemmli buffer, trong buffer coù chöùa 0.1% SDS vaø caàn phaûi laøm bieán tính protein thaønh caùc chuoãi polypeptide phaàn töû tröôùc khi ñieän di. Khi hoãn hôïp protein ñöôïc laøm noùng leân trong dung dòch buffer coù chöùa SDS (2%) vaø moät chaát khöû thiol nhö 2 – Mercaptoethanol, protein seõ bò bieán tính hoaøn toaøn thaønh caùc chuoãi polypeptide vaø SDS bao boïc caùc polypeptide thaønh daïng thaúng.

Caùc heä dung dòch ñeäm duøng trong ñieän di protein Heä ñeäm lieân tuïc: Thoâng thöôøng söû duïng laø Tris/Glycine (pH 8.5); Tris/borate (pH 8.3); Tris/acetate (pH 7. Caùc chaát taåy röûa vaø chaát bieán tính Phaù vôõ töông taùc protein – lipid, protein- protein: - SDS (sodium dodecyl sulfate) - LDS (lithium dodecyl sulfate) - Ureùa - Formamide Caùc chaát taåy röûa vaø chaát bieán tính SDS  Gaén vaøo chuoãi polypeptide, 1SDS : 2AA’s  phaù vôõ haàu heát caùc töông taùc khoâng ñoàng hoùa trò, khi theâm vaøo mercaptoethanol beû gaõy caàu noái disulfite.  Taïo caáu truùc daïng thaúng trong hôïp chaát SDS-Protein  Moãi phaân töû SDS cung caáp moät ñieän tích Caùc chaát taåy röûa vaø chaát bieán tính UREÙA Ñöôïc söû duïng thöôøng xuyeân nhö laø moät hoùa chaát phaân ly trong ñieän di treân gel Phaù vôõ caàu noái hydro Laø chaát bieán tính thích hôïp cho Nucleic acid, duy trì DNA vaø RNA ôû daïng maïch ñôn Khoâng gaén keát vôùi protein nhö SDS neân phaûi ñöôïc coù trong dung dòch trong quaù trình ñieän di. Khoâng duøng trong gel agarose vì ureùa beû gaûy caàu noái hydro gaén keát agarose vôùi nhau.

Caùc chaát taåy röûa vaø chaát bieán tính LDS Hoøa tan nhieàu hôn SDS khi ôû nhieät ñoä thaáp, cho pheùp ñieän di ôû 40C. Ñaõ ñöôïc duøng thay cho SDS trong ñieän di SDS- PAGE Formamide Duøng ñeå bieán tính RNA vaø DNA (ít khi) Gioáng ureùa: beû gaõy caàu noái hydro Chuaån bò maãu  Maãu cho SDS-PAGE: 0.8; 2% SDS; 5% mercaptoethanol, 10% glycerol vaø 0.025% brommophenol blue  Toát nhaát laø chuaån bò saün taát caû vaø theâm mercapto- ethanol ngay tröôùc khi ñieän di.  Brommophenol blue: theo doõi quaù trình ñieän di. Caùc thieát bò duøng trong ñieän di Caùc thieát bò duøng trong ñieän di Caùc ñieàu kieän veà ñieän theá OÅn ñònh ñieän theá, cöôøng ñoä vaø moät soá ñieàu kieän khaùc laø yeáu toá quan troïng trong ñieän di Phaùt hieän sau khi ñieän di Haàu heát protein ñöôïc nhuoäm baèng thuoác nhuoäm - Coomassie Brilliant Blue laø loaïi thöôøng söû duïng nhaát, hay coù theå duøng ñeå nhuoäm caùc gel ñieän di polypeptide coù khoái löôïng phaân töû thaáp.

- Baïc, nhaïy nhaát trong nhuoäm protein vaø nucleic acid, thöôøng duøng ñaùnh giaù ñoä tinh khieát cuûa quaù trình chuaån bò maãu. - Ñoàng, cho pheùp phaùt hieän sôùm vaø nhaïy caùc band protein trong SDS-PAGE maø khoâng caàn phaûi coá ñònh gel. Phaùt hieän sau ñieän di DNA khi ñieän di treân gel agarose hay polyacrylamide ñeàu ñöôïc nhuoäm baèng ethidium bromide, sau ñoù ñöôïc thu nhaän hình aûnh nhôø Transilluminator. Methyl blue cuõng ñöôïc duøng ñeå nhuoäm RNA vaø DNA khi ñieän di treân gel polyacrylamide Baïc cuõng ñöôïc duøng trong nhuoäm DNA vaø RNA Xaùc ñònh khoái löôïng phaân töû Thoâng thöôøng ñöôïc so saùnh vôùi söï di chuyeån cuûa moät chuaån protein ñaõ bieát tröôùc.

Caùc loaïi gel ñaëc bieät 1. Gel theo gradient cuûa kích thöôùc loå gel: laø loaïi gel coù söï thay ñoåi lieân tuïc trong kích thöôùc caùc loå gel theo chieàu ñieän di, thöôøng ñöôïc duøng trong phaân taùch caùc hoån hôïp coù chöùa nhieàu kích thöôùc khaùc nhau. Gel Ñieän di hai chieàu: Caùc loaïi gel ñaëc bieät 3. Gel duøng trong xaùc ñònh trình töï Nucleic acid Thoâng thöôøng moûng (≤ 4mm) TBE buffer coù chöùa 7M ureùa caùc ñoaïn polynucleotic phaûi ôû daïng sôïi ñôn Electrophoresis Isoelectric Focusing (IEF) Laø phöông phaùp ñieän di phaân taùch caùc phaân töû löôõng tính ion theo gradient pH.

Ñieän tích cuûa caùc phaân töû naøy ñöôïc xaùc ñònh döïa treân pH cuûa moâi tröôøng mang chuùng. Protein laø phaân töû löôõng ion ñieån hình, mang ñieän tích aâm, döông hay khoâng tích ñieän tuøy thuoäc vaøo pH cuûa moâi tröôøng. Khi protein di chuyeån qua moät moâi tröôøng coù söï thay ñoåi pH, tính tích ñieän cuõng thay ñoåi theo. Döôùi aûnh höôûng cuûa ñieän tröôøng, moät protein trong moâi tröôøng coù gradient pH seõ di chuyeån cho ñeán khi noù taäp trung taïi vò trí gradient ôû ñoù noù khoâng coøn tích ñieän.

Ñöôïc polymer hoùa vôùi chaát khôûi ñoäng coù caû riboflavin ñeå thuùc ñaåy quaù trình quang polymer hoùa. => gel ñöôïc polymer hoùa hoaøn toaøn hôn gel thoâng thöôøng Tæ leä caùc chaát khôûi ñoäng thöôøng laø: 0.05% TEMED 5mg/ml riboflavin Isoelectric Focusing (IEF) Chuaån bò maãu duøng IEF – Heä Rotofor IEF laø coâng cuï duøng trong phoøng thí nghieäm duøng ñeå thu nhaän caùc maãu töø moät gam ñeán haøng traêm gam protein vôùi ñoä thu nhaän > 90% löôïng maãu.