Chương 1. Công nghệ microarray trong nghiên cứu mức độ biểu hiện gen Biểu hiện gen là quá trình chuyển đổi thông tin di truyền được lưu trữ trong gen thành sản phẩm của tế bào sống. Như vậy có thể hiểu mức độ biểu hiện mRNA của gen là số lượng các mRNA mà gen phiên mã trong một loại tế bào nhất định [8]. Ngày nay, microarray đang là một trong những tiêu chuẩn vàng trong nghiên cứu mức độ biểu hiện mRNA của gen [9].
Trong khi các kỹ thuật như Northern Blot hoặc RT-PCR chỉ giới hạn nghiên cứu trong một số lượng nhỏ các gen mục tiêu, thế mạnh của microarray là khả năng so sánh đồng thời sự biểu hiện và điều hòa của hàng nghìn gen chỉ trong một thí nghiệm, giúp các nhà nghiên cứu tìm ra những thay đổi trong quá trình phiên mã đáp ứng với những biến đổi của môi trường. Nghiên cứu hồ sơ biểu hiện gen bằng công nghệ microarray cho phép cung cấp những thông tin về sự khác nhau trong mức độ biểu hiện gen giữa hai nhóm tế bào khác nhau, có thể là tế bào được điều trị so sánh với tế bào không được điều trị, hoặc tế bào ung thư khi so sánh với tế bào thường. Tuy nhiên microarray không thể phân tích được cụ thể số lượng mRNA được phiên mã, mà chỉ cho biết sự tăng hoặc giảm mức độ biểu hiện dựa trên tương quan với tế bào đối sánh [10]. Chip microarray Bản chất của chip microarray là một giá thể rắn có gắn trên đó một mạng lưới các điểm hay giọt thông tin di truyền của một chuỗi trình tự đã biết một cách có hệ thống (Hình 1.
Những con chip này thường là các mảnh kính nhỏ hoặc nylon (tương tự như một chiếc lam kính), với hàng ngàn các điểm, hay còn gọi là giếng, mỗi điểm chứa một đoạn trình tự cDNA khác nhau [2]. Đoạn cDNA được gắn lên các chip của một đoạn trình tự đã biết được gọi là đầu dò, trong khi đó chuỗi polynucleotid của đoạn trình tự chưa biết trong mẫu sinh học được gọi là đích. Đoạn trình tự đích này được đánh giá một cách gián tiếp thông qua quá trình lai hóa với đoạn polynucleotid đã biết trên con chip. Hình ảnh minh họa con chip microarray nghiên cứu mức độ biểu hiện gen trên chuột của công ty Agilent 1.
Quy trình kỹ thuật Hình 1. Quy trình kỹ thuật của công nghệ DNA microarray [10] 4 1. Chuẩn bị mẫu Quá trình chuẩn bị mẫu là một quá trình phức tạp và ảnh hưởng rất lớn đến kết quả cuối cùng của kỹ thuật microarray và được chia thành nhiều bước: + Phân lập tế bào: Các tế bào có thể được phân lập từ các chất nền phức tạp như mô hoặc máu bằng cách sử dụng phương pháp soi vi điểm bằng laser hoặc tinh sạch dựa trên ái lực kháng thể [10]. + Phân lập và tinh chế RNA: Do RNA dễ bị thoái hóa bởi các enzym nội sinh (RNAse), quá trình chuẩn bị RNA phải thêm các chất ngăn cản hoạt động của các enzym này và được bảo quản lâu dài ở −20℃ để ổn định [10].
+ Khuếch đại RNA: Phương pháp phổ biến nhất là phiên mã ngược mRNA thành cNDA sử dụng các đoạn mồi poly-T được thay đổi với các trình tự promoter T7 ở đầu 5’. Sợi đôi DNA được tạo thành trong đó mỗi đoạn mang một promoter T7 có thẻ sử dụng cho phản ứng phiên mã trong môi trường in vitro [10]. + Đánh dấu: Các mẫu nghiên cứu được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang như fluorescein, coumarin hoặc rhodamin để xác định và đo lường mức độ hiện diện của các polynucleotid trong mẫu nghiên cứu (trình tự đích) [11]. Chế tạo microarray + Lựa chọn mồi Các đầu dò sử dụng trong microarray được lựa chọn từ các trình tự nucleotid trên cơ sở dữ liệu, ví dụ như Genbank.
Chiến thuật lựa chọn đầu dò phụ thuộc nhiều vào ứng dụng và loại giá thể microarray được sử dụng, với yêu cầu là đầu dò đó phải đặc hiệu và gắn được gen đích một các hiệu quả. + Cố định các đầu dò lên microarray Quá trình cố định các đầu dò cDNA, có bản chất là các đoạn oligo-nucleotid ngắn, lên microarray là một quá trình rất quan trọng, giúp tăng độ chính xác của kết quả thí nghiệm sau khi trải qua các quá trình lai hóa và rửa trôi. Trong những năm vừa qua, có nhiều kỹ thuật cố định được các nhà khoa học phát triển, tuy nhiên chúng có thể chia thành 5 3 cơ chế cố định chính là: hấp phụ vật lý, cố định bằng liên kết cộng hóa trị và cố định bằng streptavidin-biotin. Việc lựa chọn một kỹ thuật cố định phù hợp phải dựa trên các đặc tính hóa lý của bề mặt microarray và đầu dò cDNA.
Sau khi được gắn vào các giếng, các đầu dò sẽ tiếp tục được làm khô và chiếu xạ để cố định [12]. Lai phân tử Phản ứng lai phân tử là quá trình liên kết các sợi đơn poly-nucleotid thông qua bắt cặp các base theo nguyên tắc bổ sung. Đây là một quá trình hóa học xảy ra giữa các sợi poly-nucleotid được đánh dấu của mô đích (bao gồm cả các đoạn có trình tự chưa biết) với các đầu dò cNDA bổ sung đã biết trình tự của chúng tại các điểm trên microarray. Một quá trình lý tưởng nhất là một poly-nucleotid trong mẫu đích chứa đoạn trình tự base bổ sung với poly-nucleotid được gắn tại một điểm trên microarray nó sẽ lai với phân tử tại điểm đó.
Và vị trí đó trên microarray sẽ được phát hiện bởi huỳnh quang phát ra trong quá trình quét và chụp ảnh. Càng nhiều poly-nucleotid đích lai với các đầu dò cDNA thì các tín hiệu huỳnh quang phát ra có cường độ càng lớn [13]. Số lượng đầu dò cDNA được cố định tại mỗi điểm trên microarray phải đủ nhiều sao cho nếu tồn tại trên một đoạn hai đoạn poly- nucleotid cùng có trình tự bổ sung với cDNA thì có thể lai hóa đồng thời mà không gây nhiễu tín hiệu. Sau đó các poly-nucleotid thừa sẽ được rửa sạch khỏi microarray trước khi tiến hành quét hình ảnh [10, 11].
Quét tín hiệu Các máy quét sử dụng ánh sáng từ laser với bước sóng nằm trong vùng cực tím để phát hiện màu nhuộm huỳnh quang của các đoạn trình tự đích đã được lai hóa theo nguyên tắc bổ sung với đầu dò trong các giếng. Một detector sẽ thu nhận và đo lường cường độ của các photon được giải phóng bởi ánh sáng bị kích thích, và chuyển chúng thành các tín hiệu điện [14]. Vì quá trình thực nghiệm trong các nghiên cứu về mức độ biểu hiện gen thường sử dụng hai màu nhuộm huỳnh quang khác nhau nên mỗi microarray cần được quét hai lần ở hai bước sóng khác nhau, và thiết bị chụp ảnh phải có khả năng phát hiện các poly-nucleotid đã lai hóa và đo được số lượng của chúng ít nhất ở hai bước sóng này với độ phân giải đủ lớn. Tỷ lệ phát xạ ánh sáng huỳnh quang giữa hai bước sóng khác nhau, tương ứng với hai màu thuốc nhuộm dùng để dán nhãn cho hai loại mẫu khác nhau, được sử dụng làm phép đo mức độ biểu hiện tương đối của cùng một gen giữa 2 mẫu [14, 15].
Xử lý tín hiệu ảnh Cường độ màu thu được tại các giếng của microarray sẽ phản ánh tương đối mức độ lai hóa của các poly-nucleotid với đầu dò cDNA ở giếng đó (Hình 1. Giả sử poly- nucleotid từ mẫu thử được gắn thuốc nhuộm màu đỏ và poly-nucleotid từ mẫu chứng được gắn thuốc nhuộm màu xanh, vậy thì một cách tương đối điểm màu xanh lá cây sẽ chỉ ra poly-nucleotid đối chứng đã lai nhiều với cDNA gắn tại vị trí đó. Tương tự điểm màu vàng cho thấy poly-nucleotid thử nghiệm và đối chứng đã lai với số lượng tương đối bằng nhau, còn điểm đen cho thấy không xảy ra quá trình lai hóa. Do đó màu đỏ thể hiện mức độ phiên mã cao hơn của gen trong mẫu thử nghiệm, trong khi màu xanh lá cây thể hiện gen thử nghiệm có mức độ phiên mã giảm so với đối chứng.
Định dạng hình ảnh tiêu chuẩn của microarray là các tệp 16-bit có đuôi TIFF [2]. Xử lý dữ liệu microarray Hình 1. Hình minh họa kết quả thu được từ một thí nghiệm microarray [14] Một con chip microarray thông thường, ví dụ như dòng Affymetrix Gene Chip U113 plus 2.0 dành cho hệ gen người. có thể ghi nhận tín hiệu biểu hiện của gần 1,3 triệu điểm, tương ứng với gần 39 000 gen.
Quy trình xử lý các giá trị biểu hiện gen này khá phức tạp, bao gồm xử lý hình ảnh, phát hiện điểm, chuẩn hóa nền, tiêu chuẩn hóa và một loạt các kỹ thuật kiểm định chất lượng dữ liệu [16]. Chỉ sau khi đã thực hiện các bước tiền xử lý và xử lý trên, các câu hỏi liên quan đến mục tiêu thực sự của một nghiên cứu, ví dụ như phát hiện tập hợp các gen thay đổi mức độ biểu hiện hoặc phát hiện các mạng lưới điều hòa, mới bắt đầu được giải quyết [17]. Chính vì thế một quy trình xử lý dữ liệu microarray hoàn chỉnh rất phức tạp và phải trải qua nhiều bước khác nhau, phụ thuộc vào nhiều phần mềm và cơ sở dữ liệu. Bên cạnh 7 đó đối tượng xử lý còn là một số lượng lớn các dữ liệu không đồng nhất, và cần hỗ trợ bởi nhiều công cụ khác nhau.
Đối với những nghiên cứu được tiến hành trong một khoảng thời gian dài, hoặc bao gồm kết quả tại nhiều phòng thí nghiệm khác nhau hoặc ngay cả việc được thực hiện bởi các nhóm kỹ thuật viên khác nhau, việc quản lý và chuẩn hóa dữ liệu là đặc biệt quan trọng để đảm bảo tối ưu hóa chất lượng của dữ liệu và giảm thiểu độ nhiễu [17]. Trong những năm gần đây, các ứng dụng và dữ liệu microarray ngày càng trở nên phổ biến. Tuy nhiên việc xử lý và phiên giải các dữ liệu này vẫn còn là một vấn đề khó khăn đối với các nhà sinh học. Chính vì vậy rất cần phát triển các công cụ tin sinh để giải quyết các dạng dữ liệu này [9].1 tổng hợp một số công cụ được phát triển cho phân tích các bộ dữ liệu microarray thường được sử dụng trong các nghiên cứu gần đây.
Trong nghiên cứu này chúng tôi chủ yếu sử dụng các câu lệnh viết trên ngôn ngữ R để thực hiện phân tích.