Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi actinobacteria tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn cần giờ thành phố hồ chí minh

Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sợi Actinobacteria tạo kháng sinh từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ, TP.HCM. Phát hiện các chủng vi khuẩn tiềm năng.

• Tác giả: Nguyễn Tuấn Hải
• Người hướng dẫn: Gs. Cao Ngọc Điệp
• Trường học: Trường Đại học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phân Lập Và Tuyển Chọn Các Vi Khuẩn Sợi (Actinobacteria) Tạo Kháng Sinh Trong Đất Rừng Ngập Mặn Cần Giờ, Thành Phố Hồ Chí Minh
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. Đặt vấn đề
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Sơ lược về rừng ngập mặn
• 2.1.1. Khái niệm và phân loại rừng ngập mặn
• 2.1.2. Rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh
• 2.2. Vi sinh vật trong đất rừng ngập mặn
• 2.3. Vi khuẩn sợi
• 2.3.1. Giới thiệu về thuật ngữ vi khuẩn sợi (xạ khuẩn)
• 2.3.2. Phân bố của vi khuẩn sợi trong tự nhiên
• 2.3.3. Đặc điểm sinh học tổng quát của vi khuẩn sợi
• 2.3.4. Phân loại (Taxonomy) vi khuẩn sợi
• 2.4. Những ứng dụng công nghệ sinh học của vi khuẩn sợi
• 2.5. Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp
• 2.5.1. Lược khảo chung về kháng sinh
• 2.5.2. Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp
• 2.5.3. Sự tồn tại của các gen chỉ thị kháng sinh (pks-I, pks-II và nrps) để nhận diện vi khuẩn sợi có khả năng tổng hợp kháng sinh
• 2.5.4. Một số thành tựu nghiên cứu về vi khuẩn sợi tổng hợp kháng sinh phân lập từ rừng ngập mặn
• 2.5.4.1. Trên thế giới
• 2.5.4.2. Nghiên cứu trong nước
• 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Phương tiện nghiên cứu
• 3.2. Nguyên vật liệu
• 3.3. Thiết bị - dụng cụ
• 3.4. Hóa chất – môi trường
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Thu thập và xử lý mẫu
• 3.5.2. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn sợi
• 3.5.3. Đánh giá khả năng kháng khuẩn
• 3.5.4. Nhận diện vi khuẩn sợi bằng phương pháp sinh học phân tử
• 3.5.5. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ vi khuẩn sợi tiềm năng được tuyển chọn
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn sợi
• 4.1.1. Số lượng, nguồn gốc vi khuẩn sợi phân lập được
• 4.1.2. Đặc điểm hình thái các dòng vi khuẩn sợi phân lập được
• 4.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
• 4.3. Kết quả định danh và cây phả hệ di truyền
• 4.3.1. Định danh các dòng vi khuẩn sợi kháng khuẩn mạnh
• 4.3.2. Hình thái của các chủng vi khuẩn sợi được chọn
• 4.4. Sự hiện diện của các gen chỉ thị kháng sinh
• 4.5. Chất kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn sợi được chọn
• 4.5.1. Chiết tách chất kháng khuẩn của 2 dòng vi khuẩn sợi
• 4.5.2. Kết quả phân tích GC-MS chất kháng khuẩn của vi khuẩn sợi Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG
• 4.5.3. Kết quả phân tích GC-MS chất kháng khuẩn của vi khuẩn sợi Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG
• 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng quan về Actinobacteria và tiềm năng từ Cần Giờ

Vi sinh vật gây bệnh là mối đe dọa thường trực đối với sức khỏe con người và động vật. Việc phát hiện ra penicillin năm 1928 đã mở ra kỷ nguyên mới trong điều trị nhiễm trùng. Kháng sinh là công cụ quan trọng, nhưng sự gia tăng kháng kháng sinh đòi hỏi phải tìm kiếm các nguồn kháng sinh tự nhiên mới. Actinobacteria, hay còn gọi là vi khuẩn sợi, là một nguồn quan trọng, đặc biệt là chi Streptomyces. Nghiên cứu Actinobacteria từ các môi trường độc đáo như đất rừng ngập mặn Cần Giờ có thể mang lại những kháng sinh mới, hiệu quả hơn. Rừng ngập mặn là môi trường sống lý tưởng cho nhiều loài vi sinh vật, bao gồm cả vi khuẩn sợi, nhờ sự phong phú về carbon và dinh dưỡng.

1.1. Vai trò sinh học của rừng ngập mặn Cần Giờ

Rừng ngập mặn Cần Giờ, thuộc thành phố Hồ Chí Minh, là một hệ sinh thái trung gian quan trọng. Nó kết nối hệ sinh thái thủy vực với trên cạn, giữa nước ngọt và nước mặn, đồng thời chứa đựng sự đa dạng về động-thực vật và vi sinh vật. Các nghiên cứu trước đây đã tập trung vào các nhóm vi sinh vật khác nhau, nhưng tiềm năng từ Actinobacteria vẫn chưa được khai thác đầy đủ.

1.2. Tiềm năng kháng sinh từ vi khuẩn sợi đất ngập mặn

Vi khuẩn sợi đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất kháng sinh, chiếm khoảng 80% các chất kháng sinh đã được phát hiện, đặc biệt là các loài thuộc chi Streptomyces. Sự cần thiết phải phân lập các loài vi khuẩn sợi từ các nguồn đặc biệt, khác với Streptomyces trong đất để tìm kiếm kháng sinh mới là rất cần thiết. Những loài vi khuẩn sợi phân lập từ các nguồn gốc biển được quan tâm nhiều hơn do khả năng sản sinh các hợp chất thứ cấp (secondary metabolites) với nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như chất kháng khuẩn, kháng nấm, hợp chất ngăn ngừa ung thư, ức chế khối u.

II. Thách thức kháng kháng sinh và nhu cầu tìm kiếm kháng sinh mới

Sự gia tăng kháng kháng sinh đang đặt ra thách thức lớn cho y học hiện đại. Vi khuẩn gây bệnh ngày càng phát triển các cơ chế kháng thuốc, làm giảm hiệu quả của các loại kháng sinh hiện có. Điều này đòi hỏi các nhà khoa học phải liên tục tìm kiếm và phát triển các kháng sinh mới. Vi khuẩn sợi, đặc biệt là từ các môi trường đặc biệt như đất rừng ngập mặn, có thể là chìa khóa để giải quyết vấn đề này. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và tuyển chọn các chủng Actinobacteria có khả năng tạo ra các hợp chất kháng khuẩn mới.

2.1. Vai trò của vi khuẩn sợi trong sản xuất kháng sinh

Trong số các vi sinh vật có khả năng tạo chất kháng sinh, vi khuẩn sợi (actinobacteria) hay còn gọi là xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng, với khoảng 80% các chất kháng sinh được phát hiện có nguồn gốc từ vi khuẩn sợi, đặc biệt là các loài thuộc chi Streptomyces. Hiện nay, việc phân lập các loài vi khuẩn sợi từ những nguồn đặc biệt khác (ngoài Streptomyces trong đất) để tìm kiếm kháng sinh mới là rất cần thiết.

2.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu vi sinh vật đất ngập mặn

Trong xu hướng này, những loài vi khuẩn sợi phân lập từ các nguồn gốc biển được quan tâm nhiều hơn do khả năng sản sinh các hợp chất thứ cấp (secondary metabolites) với nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như chất kháng khuẩn, kháng nấm, hợp chất ngăn ngừa ung thư, ức chế khối u. Rừng ngập mặn là một tập hợp các loài cây nhiệt đới, cận nhiệt đới và cây bụi thích nghi với vùng khắc nghiệt giữa biển và đất liền.

III. Phương pháp phân lập và tuyển chọn Actinobacteria hiệu quả

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp tiêu chuẩn để phân lập và tuyển chọn Actinobacteria từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ. Các mẫu đất được thu thập và xử lý để tạo điều kiện cho sự phát triển của vi khuẩn sợi. Sau đó, các chủng vi khuẩn được kiểm tra khả năng kháng khuẩn bằng các xét nghiệm in vitro. Các chủng có tiềm năng nhất được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử.

3.1. Thu thập và xử lý mẫu đất ngập mặn

Mẫu đất được thu thập từ 6 đơn vị hành chính cấp xã của huyện Cần Giờ trong khoảng thời gian từ tháng 2 đến tháng 4 năm 2019. Việc thu thập mẫu cần tuân thủ các quy trình chuẩn để đảm bảo tính đại diện và độ tin cậy của kết quả. Các mẫu được xử lý để loại bỏ tạp chất và tạo điều kiện tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn sợi.

3.2. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn sợi

Các chủng vi khuẩn được kiểm tra khả năng kháng khuẩn bằng các xét nghiệm in vitro. Phương pháp này cho phép đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác nhau. Các chủng có hoạt tính kháng khuẩn cao sẽ được chọn lọc để nghiên cứu sâu hơn. Nghiên cứu này sử dụng môi trường MHA để thực hiện đánh giá khả năng kháng khuẩn.

3.3. Định danh vi khuẩn sợi bằng phương pháp sinh học phân tử

Việc định danh vi khuẩn sợi được thực hiện bằng phương pháp sinh học phân tử, cụ thể là phân tích trình tự gen 16S rDNA. Phương pháp này cho phép xác định chính xác loài vi khuẩn và so sánh với các chủng đã biết trong cơ sở dữ liệu gen. Điều này giúp xác định những chủng vi khuẩn mới và có tiềm năng kháng sinh.

IV. Kết quả phân lập và định danh các chủng Actinobacteria

Nghiên cứu đã phân lập được 48 chủng vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ. Trong số đó, 8 chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đáng kể đối với các vi khuẩn gây bệnh cho người. Kết quả định danh cho thấy các chủng này thuộc chi Streptomyces và bao gồm 8 loài khác nhau, bao gồm Streptomyces tendae, S. celluloflavus, và S. albogriseolus.

4.1. Đa dạng sinh học của Actinobacteria phân lập được

Kết quả cho thấy sự đa dạng về loài vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ. Sự đa dạng này cho thấy tiềm năng lớn trong việc tìm kiếm các kháng sinh mới. Mỗi loài vi khuẩn có thể sản xuất ra các hợp chất kháng khuẩn khác nhau, mở ra cơ hội phát triển các loại thuốc mới.

4.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng Streptomyces

Ba chủng (Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1) kháng được 4 vi khuẩn gây bệnh cho người là Bacillus cereus, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus và Staphylococcus aureus. Tỷ lệ hiện diện của gen chỉ thị kháng sinh, 8/8 chủng vi khuẩn sợi đều mang gen nrps, 4/8 chủng mang gen pksI, đặc biệt là 50% các chủng mang cả 2 gen nrps và pksI.

V. Phân tích hoạt chất và tiềm năng ứng dụng kháng sinh

Hai chủng vi khuẩn sợi có khả năng kháng khuẩn tốt nhất đã được chọn để trích ly hoạt chất. Phân tích GC-MS cho thấy sự hiện diện của nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm các siloxan, acid 2,6-dihydroxybenzoic, và các hợp chất khác đã được báo cáo là có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, và chống oxy hóa. Các hoạt chất này có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thuốc và các sản phẩm sinh học khác.

5.1. Chiết xuất và phân tích hoạt chất kháng khuẩn

Chọn được 2 dòng vi khuẩn sợi tạo kháng sinh hay kháng các vi khuẩn gây bệnh tốt nhất (S.1) để trích ly hoạt chất bằng ethyl acetate, thu được cao chiết chứa hoạt chất ức chế 3 vi khuẩn gây bệnh cho người là Bacillus cereus, Escherichia coli, và Staphylococcus aureus; sử dụng kỹ thuật GC- MS phân tích thành phần hoạt chất.

5.2. Tiềm năng ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học

Hoạt chất sinh học của hai dòng vi khuẩn sợi giữ được tính kháng khuẩn sau quá trình xử lý dung môi, mở ra khả năng ứng dụng vào sản xuất thành thuốc đồng thời là cơ sở để khai thác nguồn dược liệu tiềm năng từ vi khuẩn sợi của đất rừng ngập mặn, góp phần tăng hiệu quả trị bệnh ở người. Như vậy, loài vi khuẩn sợi và sinh chất hiện diện đất ngập mặn Cần Giờ tương đồng với các vùng ngập mặn trên thế giới.

VI. Kết luận Tiềm năng và hướng nghiên cứu Actinobacteria

Nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng của đất rừng ngập mặn Cần Giờ trong việc cung cấp các chủng Actinobacteria có khả năng sản xuất kháng sinh. Các hoạt chất được xác định có tiềm năng ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học. Hướng nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình sản xuất kháng sinh và đánh giá hiệu quả của các hoạt chất trong các thử nghiệm in vivo.

6.1. Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo về kháng sinh tự nhiên

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các cơ chế kháng khuẩn của các hoạt chất này. Cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa để đánh giá đầy đủ tiềm năng của Actinobacteria từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ trong việc chống lại các bệnh nhiễm trùng.

6.2. Tầm quan trọng của việc bảo tồn đa dạng sinh học vi khuẩn

Việc bảo tồn đa dạng sinh học của vi khuẩn sợi trong các môi trường đặc biệt như rừng ngập mặn là rất quan trọng. Các biện pháp bảo tồn cần được thực hiện để đảm bảo rằng chúng ta có thể tiếp tục khai thác nguồn kháng sinh tự nhiên tiềm năng này trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Sự gia tăng nhanh chóng của các chủng vi sinh vật kháng đa thuốc (multidrug-resistant pathogens) đang đe dọa trực tiếp đến an ninh y tế toàn cầu, đặt ra yêu cầu cấp thiết phải khám phá các hợp chất kháng sinh có cấu trúc và cơ chế tác động hoàn toàn mới (Ventola, 2015). Trong lịch sử dược học, ngành vi khuẩn sợi (Actinobacteria), đặc biệt là chi Streptomyces, đã đóng góp hơn 70-80% tổng số kháng sinh tự nhiên phục vụ điều trị lâm sàng (Bérdy, 2005; Barka et al., 2016). Tuy nhiên, các dòng vi khuẩn sợi trong đất liền đã bị khai thác cạn kiệt, dẫn đến tỷ lệ tái phát hiện (rediscovery) các hợp chất cũ rất cao. Do đó, các hệ sinh thái ngập mặn ven biển – nơi giao thoa giữa môi trường thủy sinh và lục địa với độ mặn biến động, nồng độ oxy hòa tan thấp và nguồn chất hữu cơ dồi dào – trở thành "điểm nóng" sinh thái lưu giữ các chủng vi khuẩn sợi biển đặc hữu sở hữu các cụm gen sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp (secondary metabolites) độc đáo (Hong et al., 2009; Xu et al., 2014).

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi xuất phát từ thực tiễn: dù Khu Dự trữ Sinh quyển Thế giới Rừng ngập mặn Cần Giờ (diện tích 70.412 ha) là hệ sinh thái ngập mặn điển hình tại hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn, các công trình trước đây chủ yếu tập trung vào vi khuẩn cố định đạm (Đinh Thúy Hằng và Trần Triết, 2009) hoặc tổng hợp polymer sinh học (Đoàn Văn Thược và Nguyễn Thị Bình, 2012). Chưa có một khảo sát sinh học phân tử toàn diện nào tích hợp giữa phân lập hình thái học, định danh phả hệ 16S rDNA, tầm soát gen chỉ thị sinh tổng hợp polyketide/peptide (pksI, pksII, nrps) và giải mã thành phần hóa học kháng khuẩn bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) trên các chủng vi khuẩn sợi tại vùng đất ngập mặn Cần Giờ.

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học (Mã số: 94 20 201) của nghiên cứu sinh Nguyễn Tuấn Hải, dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Cao Ngọc Điệp tại Trường Đại học Cần Thơ (2024), đã giải quyết tường minh bài toán này. Nghiên cứu triển khai hệ thống 3 câu hỏi và giả thuyết khoa học:

1. RQ1: Đất ngập mặn tại 6 xã sinh thái thuộc huyện Cần Giờ lưu giữ mật độ và tính đa dạng chủng loài vi khuẩn sợi có hoạt tính kháng sinh như thế nào? (H1: Hệ sinh thái đất ngập mặn Cần Giờ sở hữu các loài Streptomyces đặc thù có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn gây bệnh ở người).
2. RQ2: Tỷ lệ hiện diện của các gen chức năng pksI, pksII và nrps trong hệ gen của các chủng vi khuẩn sợi phân lập được phân bố ra sao? (H2: Các chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao mang đồng thời các cụm gen sinh tổng hợp pksI và nrps).
3. RQ3: Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp trong cao chiết ethyl acetate của các chủng ưu tuyển có cấu trúc phân tử và hoạt tính ức chế vi khuẩn mục tiêu như thế nào? (H3: Hoạt chất kháng khuẩn bao gồm các dẫn xuất vòng phenolic và hợp chất siloxane hữu cơ bền nhiệt và dung môi).

Về phạm vi và quy mô: Đề tài thu thập các mẫu đất trầm tích rừng ngập mặn trải rộng trên địa bàn 6 xã thuộc huyện Cần Giờ (An Thới Đông, Long Hòa, Lý Nhơn, Tam Thôn Hiệp, Cần Thạnh và Thạnh An) trong khung thời gian từ tháng 02/2019 đến tháng 12/2021. Đóng góp đột phá của luận án được lượng hóa qua việc phân lập thành công 48 chủng vi khuẩn sợi, tuyển chọn 8 chủng có hoạt tính đối kháng phổ rộng, định danh chính xác 8 loài Streptomyces, xác thực 100% (8/8 chủng) mang gen nrps, 50% (4/8 chủng) mang gen pksI và giải mã thành công hệ chất kháng khuẩn bền dung môi của 2 chủng xuất sắc nhất (S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1).

Literature Review và Positioning

Khảo cứu y văn quốc tế cho thấy lịch sử phát hiện kháng sinh khởi nguồn từ Penicillin (Fleming, 1928), kế tiếp là kỷ nguyên vàng của vi khuẩn sợi đất liền với việc Waksman và Schatz (1943) tìm ra Streptomycin từ Streptomyces griseus (Zaffiri et al., 2012). Trong nhiều thập kỷ, trường phái phân lập cổ điển tập trung vào đất nông nghiệp và trầm tích lục địa (Berdy, 2005). Tuy nhiên, trường phái sinh học biển hiện đại do các tác giả như Bull et al. (2005), Sivakumar et al. (2007), Manivasagan et al. (2013) và Barka et al. (2016) dẫn dắt đã chứng minh rằng các chủng Actinobacteria biển và rừng ngập mặn chịu áp lực chọn lọc cao độ từ độ mặn, áp suất thẩm thấu và biến động triều kiệt, tạo nên các con đường biến dưỡng thứ cấp khác biệt hoàn toàn với họ hàng trên cạn.

Một cuộc tranh luận học thuật sâu sắc (academic debate) diễn ra giữa hai quan điểm:

• Trường phái Phenotype-first (Sàng lọc ngẫu nhiên): Cho rằng chỉ cần dựa vào hoạt tính ức chế vòng vô khuẩn thực nghiệm (agar diffusion) để tuyển chọn chủng, vì nhiều cụm gen trong phòng thí nghiệm rơi vào trạng thái "gen ngủ" (cryptic/silent genes) không biểu hiện thành chất (Kumar et al., 2018).
• Trường phái Genotype-guided (Sàng lọc định hướng gen sinh tổng hợp): Do Ayuso et al. (2005) và Jenke-Kodama et al. (2006) khởi xướng, khẳng định việc nhận diện các gen chỉ thị pksI, pksII, nrps là điều kiện tiên quyết để định hướng khai phá các chất chuyển hóa mới, giảm thiểu việc phân lập trùng lặp các phân tử kháng sinh thông thường.

Khi định vị nghiên cứu trong dòng chảy học thuật thế giới, luận án của Nguyễn Tuấn Hải đã kết nối chặt chẽ và so sánh trực tiếp với ít nhất 2 công trình quốc tế tiêu biểu:

1. Nghiên cứu của Passari et al. (2017) tại Ấn Độ về vi khuẩn sợi nội sinh cây Rhynchotoechum ellipticum, sử dụng Realtime-qPCR và LC-MS phát hiện 16 hợp chất gồm kháng sinh và polyphenol.
2. Công trình của Sun et al. (2015) và Zhao et al. (2009) tại Trung Quốc khảo sát sự đa dạng gen pksI, pksII và nrps của vi khuẩn sợi biển sâu và hải miên, ghi nhận sự phong phú của các polyketide vòng thơm.

So với các nghiên cứu trên, luận án đã định vị chính xác vị thế khoa học: xác lập bản đồ phân bố vi sinh vật sợi bản địa tại vùng lõi và vùng đệm của Khu Dự trữ Sinh quyển Cần Giờ, chứng minh các chủng Streptomyces tại đây vừa mang tính tương đồng di truyền quốc tế, vừa sở hữu cấu trúc chuyển hóa chứa các phức hợp siloxane kháng khuẩn đặc trưng mà ít nghiên cứu trong nước từng phân tích chi tiết.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc thêm 3 nền tảng lý thuyết sinh học kinh điển:

1. Lý thuyết phân loại học hóa trị và sinh học phân tử vi khuẩn sợi của Dworkin (2006): Bổ sung dữ liệu phân loại vi hình thể kết hợp trình tự 16S rDNA của 8 loài Streptomyces chịu mặn vùng nhiệt đới (S. tendae, S. celluloflavus, S. albogriseolus, S. parvulus, S. tanashiensis, S. africanus...).
2. Mô hình tổ chức mô-đun sinh tổng hợp Polyketide và Peptide phi ribosome (Modular PKS/NRPS Assembly Model) của Jenke-Kodama et al. (2006): Cung cấp bằng chứng thực nghiệm về tần số xuất hiện vượt trội của hệ enzyme NRPS (100%) so với PKS-I (50%) và PKS-II (0%) ở vi khuẩn sợi ngập mặn Cần Giờ. Điều này củng cố giả thuyết rằng sự tái tổ hợp tương đồng (homologous recombination) trong các cụm gen sinh tổng hợp chịu tác động mạnh bởi môi trường sinh thái mặn.
3. Mô hình chuyển hóa thứ cấp thích ứng sinh thái (Ecological Adaptation Metabolic Paradigm): Khẳng định các chất chuyển hóa thứ cấp không chỉ là sản phẩm phụ mà là "vũ khí sinh hóa" cạnh tranh không gian sống trong điều kiện trầm tích yếm khí ngập mặn.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp đa tầng (multi-tiered analytical framework):

• Tầng 1 (Hình thái & Sinh thái): Phân lập trên môi trường chọn lọc tinh bột-casein (Starch Casein Agar - SCA), đánh giá cấu trúc khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh, phân loại cấu trúc vách tế bào Gram dương.
• Tầng 2 (Sàng lọc đối kháng sinh học): Đánh giá phổ ức chế in vitro đối với 4 chủng vi khuẩn chỉ thị đại diện cho cả vi khuẩn Gram dương (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus) và Gram âm (Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus).
• Tầng 3 (Di truyền phân tử & Phả hệ): Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA bằng cặp mồi đặc hiệu ngành S-C-Act-0235-a-S-20 và S-C-Act-0878-a-A-19, phân tích phả hệ bằng thuật toán Maximum Likelihood trên phần mềm MEGA. Đồng thời khuếch đại gen chức năng pksI (cặp mồi KS1F1/KS1R1 hoặc DKF/DKR), pksII (KS2aF1/KS2bR1) và nrps (A3F/A7R).
• Tầng 4 (Hóa học sản phẩm tự nhiên): Lên men lỏng có lắc (150-200 rpm), chiết phân đoạn bằng dung môi hữu cơ ethyl acetate (EtOAc), và phân tích cấu trúc hóa học bằng GC-MS.

Điều kiện biên (boundary conditions) của khung phân tích được xác định rõ: áp dụng cho vi khuẩn sợi có khả năng nuôi cấy (culturable actinobacteria) trong điều kiện hiếu khí phòng thí nghiệm, dung môi chiết xuất tập trung vào phân cực trung bình (ethyl acetate).

   [Mẫu đất 6 xã Cần Giờ] 
   [Giải trình tự 16S rDNA &              [Tầm soát gen kháng sinh]
    Phả hệ Maximum Likelihood]             - nrps (100%, 8/8)
    (8 loài Streptomyces)                  - pksI (50%, 4/8)
                   [Tuyển chọn 2 chủng xuất sắc]
                   - S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1
                   - S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1
                   [Lên men & Chiết xuất EtOAc]
                   [Phân tích cấu trúc bằng GC-MS]
                   - Nhận diện 6 - 7 hợp chất sinh học
                   - Hoạt chất Siloxane & Dẫn xuất Phenolic

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án tuân thủ chặt chẽ triết lý thực chứng (positivism) của khoa học tự nhiên thực nghiệm, sử dụng thiết kế nghiên cứu quy nạp kết hợp diễn dịch (inductive-deductive experimental design). Hệ thống thí nghiệm được bố trí lặp lại độc lập, kiểm soát nghiêm ngặt các biến số môi trường (nhiệt độ 28-30°C, pH môi trường 7,0-7,2, tốc độ lắc 150-200 rpm).

Cỡ mẫu và địa bàn thu thập: Mẫu đất được lấy tại 6 xã thuộc huyện Cần Giờ gồm An Thới Đông, Long Hòa, Lý Nhơn, Tam Thôn Hiệp, Cần Thạnh và Thạnh An. Quy trình thu mẫu đất tầng mặt (độ sâu 5-20 cm) tại vùng rễ cây ngập mặn (Rhizophora, Avicennia, Sonneratia), bảo quản lạnh vô trùng và xử lý phân tích trong thời gian quy định.

Quy trình nghiên cứu rigorous

1. Phân lập và tuyển chọn: Xử lý mẫu đất bằng phương pháp pha loãng bậc phân (serial dilution) với nước cất vô trùng, cấy gạt trên môi trường thạch tinh bột - casein (Starch Casein Agar - SCA). Ủ ở 28-30°C trong 7-14 ngày để hình thành khuẩn ty khí sinh và chuỗi bào tử đặc trưng.
2. Khảo sát hoạt tính đối kháng: Sử dụng phương pháp cấy vạch đối kháng và giếng thạch (agar well diffusion) trên môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA), đo đường kính vòng vô khuẩn (zone of inhibition, mm) đối với 4 vi khuẩn kiểm định (B. cereus, S. aureus, E. coli, V. parahaemolyticus).
3. Sinh học phân tử và định danh:
   • Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB/TE chuẩn hóa.
   • Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi S-C-Act-0235-a-S-20 (5'-CGCGGCCTATCAGCTTGTTG-3') và S-C-Act-0878-a-A-19 (5'-CCGTACTCCCCAGGCGGGG-3') (Sun et al., 2015), chu trình nhiệt: biến tính 95°C (5 phút), 30 chu kỳ [94°C (30s), 55°C (30s), 72°C (1 phút)], kéo dài cuối 72°C (10 phút).
   • Giải trình tự Sanger, so sánh mức độ tương đồng nucleotide trên ngân hàng GenBank (NCBI) bằng công cụ BLASTn, căn chỉnh đa trình tự bằng ClustalW và xây dựng cây phả hệ bằng thuật toán Maximum Likelihood với chỉ số bootstrap 1000 lần lặp trên MEGA.
4. Tầm soát gen pksI, pksII và nrps:
   • Gen pksI (vùng ketosynthase ~700 bp): Mồi KS1F1 (5'-ATGGAYCCSCARCARCGBCT-3') và KS1R1 (5'-GCYTCGATSGGRTCNCCSA-3') ở nhiệt độ bắt cặp 60°C.
   • Gen pksII (vùng KSα ~1070 bp): Mồi KS2aF1 (5'-TSGCSTGYTTCGAYGCSAT-3') và KS2bR1 (5'-GCRTAGAACCASGCGAWSGACA-3') ở 60°C.
   • Gen nrps (miền Adenylation ~700 bp): Mồi A3F (5'-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3') và A7R (5'-SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3') ở 60°C.

Data và phân tích

• Thu nhận cao chiết: Hai chủng tiềm năng nhất được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường dịch thể tinh bột - cao nấm men - peptone (SYP-SW) trong 7-10 ngày trên máy lắc 150 rpm. Dịch nuôi cấy được ly tâm 5.000 vòng/phút trong 20 phút để tách sinh khối tế bào. Dịch nổi được trích ly lỏng - lỏng bằng dung môi ethyl acetate (tỷ lệ 1:1, v/v) 3 lần, cô quay chân không thu hồi cao chiết thô.
• Phân tích GC-MS: Thực hiện trên hệ thống sắc ký khí khối phổ hiện đại. Cột sắc ký mao quản không phân cực, khí mang Heli tinh khiết (1,0 mL/phút). Chương trình nhiệt độ: duy trì 80°C (2 phút), tăng nhiệt 10°C/phút lên 280°C (giữ 10 phút). Phổ khối ion hóa va đập điện tử (EI, 70 eV). Nhận diện thành phần bằng cách so đối chiếu phổ khối thu được với ngân hàng dữ liệu NIST/Wiley Mass Spectral Library.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Hiệu suất phân lập và đa dạng loài Streptomyces: Phân lập thành công 48 chủng vi khuẩn sợi từ đất ngập mặn Cần Giờ. Trong đó, 10 chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với ít nhất một vi khuẩn gây bệnh; 8 chủng ưu tuyển được định danh thuộc 8 loài khác nhau của chi Streptomyces (S. tendae, S. celluloflavus, S. albogriseolus, S. parvulus, S. tanashiensis, S. africanus...).
2. Khả năng đối kháng phổ rộng với mầm bệnh nguy hiểm: Phát hiện 3 chủng xuất sắc nhất (S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1, S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S. parvulus ANTHOIDONG 3.1) có khả năng ức chế đồng thời cả 4 loài vi khuẩn gây bệnh cho người bao gồm cả Gram dương (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus) và Gram âm (Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus).
3. Đặc trưng phân bố gen sinh tổng hợp kháng sinh:
   • 100% (8/8 chủng) mang gen nrps.
   • 50% (4/8 chủng) mang gen pksI.
   • 0% (0/8 chủng) phát hiện thấy gen pksII.
   • Đặc biệt, 50% các chủng mang đồng thời cả hai gen nrps và pksI, phản ánh tiềm năng lai tạo sinh hóa phức tạp giữa con đường polyketide và peptide.
4. Giải mã thành phần hóa học cao chiết kháng khuẩn bằng GC-MS:
   • Cao chiết ethyl acetate của chủng S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 xác định 6 hoạt chất tiêu biểu: Cyclohexasiloxane, dodecaethyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; dẫn xuất 3TMS của acid 2,6-dihydroxybenzoic; Heptasiloxane, hexadecamethyl; Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-hexadecamethyl; Tetracosamethyl cyclododecasiloxane.
   • Cao chiết của chủng S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 phát hiện 7-11 hợp chất chính: 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; Cyclododecane; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; Benzoic acid, 2-hydroxy-, 1-methylethyl ester; 1-Hexadecene; Heptasiloxane, hexadecamethyl.
5. Tính ổn định hoạt tính sinh học của nhóm hợp chất Siloxane: Hai hợp chất Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl và Heptasiloxane, hexadecamethyl xuất hiện đồng thời ở cả hai chủng, giữ nguyên hoạt tính ức chế B. cereus, E. coli và S. aureus sau quy trình trích ly dung môi khắc nghiệt.

Chủng vi khuẩn sợi	Gen nrps	Gen pksI	Gen pksII	Số hoạt chất GC-MS tiêu biểu	Phổ kháng khuẩn mục tiêu
S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1	Dương tính (+)	Dương tính (+)	Âm tính (-)	6 hợp chất (Siloxanes, Dẫn xuất 3TMS acid 2,6-dihydroxybenzoic)	B. cereus, E. coli, V. parahaemolyticus, S. aureus
S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1	Dương tính (+)	Dương tính (+)	Âm tính (-)	7 hợp chất (Siloxanes, Benzoic acid ester, 1-Hexadecene)	B. cereus, E. coli, V. parahaemolyticus, S. aureus
S. parvulus ANTHOIDONG 3.1	Dương tính (+)	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Đang phân tích bổ sung	B. cereus, E. coli, V. parahaemolyticus, S. aureus
5 chủng Streptomyces còn lại	Dương tính (+)	1 (+) / 4 (-)	Âm tính (-)	Chưa trích ly cao chiết	Kháng 1 đến 3 vi khuẩn thử nghiệm

Implications đa chiều

• Về mặt học thuật và lý thuyết: Cung cấp bằng chứng khoa học khẳng định vi khuẩn sợi rừng ngập mặn Cần Giờ là mắt xích quan trọng trong bản đồ đa dạng sinh học vi sinh vật biển thế giới, tương đồng với các phát hiện tại Ấn Độ (Sivakumar et al., 2007) và Trung Quốc (Hong et al., 2009).
• Về mặt phương pháp luận: Thiết lập quy trình chuẩn hóa từ lấy mẫu đất ngập mặn, nuôi cấy chọn lọc, PCR sàng lọc gen đa mồi đến trích ly và phân tích GC-MS, có thể chuyển giao áp dụng cho các vùng đất ngập mặn khác ven biển Việt Nam (Cà Mau, Hải Phòng, Quảng Ninh).
• Về mặt thực tiễn y dược: Mở ra nguồn dược liệu sinh học mới phục vụ nghiên cứu bào chế thuốc kháng sinh thế hệ mới chống vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm (B. cereus) và nhiễm khuẩn bệnh viện (S. aureus, E. coli).

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả đột phá, luận án thẳng thắn thừa nhận các giới hạn nghiên cứu:

1. Giới hạn về đối tượng nuôi cấy: Nghiên cứu chỉ tiếp cận được các loài vi khuẩn sợi có khả năng nuôi cấy trên môi trường nhân tạo thạch SCA (chiếm dưới 1-5% tổng quần xã vi sinh vật tự nhiên trong đất ngập mặn).
2. Giới hạn về phân tích hóa học: Kỹ thuật GC-MS chỉ phát hiện được các hợp chất hữu cơ bay hơi hoặc bán bay hơi (volatile/semi-volatile metabolites); các hợp chất peptide cao phân tử hoặc polyketide khối lượng lớn không bay hơi chưa được giải mã bằng sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS) hoặc phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
3. Giới hạn về thử nghiệm độc tính sinh học: Mới dừng lại ở khảo sát hoạt tính ức chế vi khuẩn in vitro trên đĩa thạch, chưa tiến hành thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC), độc tính tế bào (cytotoxicity) trên dòng tế bào người và mô hình in vivo động vật.

Định hướng nghiên cứu tiếp theo (Future Research Agenda):

• Ứng dụng giải trình tự hệ gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS) và phân tích Metagenomics toàn bộ mẫu đất để khai phá 95% quần xã vi khuẩn sợi "chưa thể nuôi cấy".
• Tinh sạch từng hợp chất đơn lẻ từ cao chiết bằng HPLC bán điều chế và xác định công thức cấu tạo không gian tuyệt đối bằng NMR 1D/2D.
• Sử dụng công nghệ kích hoạt các cụm "gen ngủ" (activating silent biosynthetic gene clusters) bằng cách đồng nuôi cấy (co-cultivation) hoặc kỹ thuật chỉnh sửa gen CRISPR-Cas9 trên chủng Streptomyces celluloflavus và S. albogriseolus.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Công trình là tài liệu tham khảo nền tảng cho các nghiên cứu sinh, học viên cao học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học và Dược học; dự kiến tạo nguồn trích dẫn học thuật quan trọng cho các công bố quốc tế về vi sinh vật biển khu vực Đông Nam Á.
• Tác động ngành R&D Dược phẩm & Nông nghiệp: Cung cấp 2 chủng giống vi sinh vật thuần khiết có năng lực sản xuất cao chiết kháng khuẩn mạnh, có thể ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm kháng sinh sinh học, chất bảo quản nông sản thực phẩm hoặc chế phẩm sinh học trị bệnh phát sáng do Vibrio trong nuôi trồng thủy sản.
• Tác động bảo tồn và chính sách: Kết quả nghiên cứu khẳng định giá trị kinh tế - sinh thái vô giá của nguồn tài nguyên di truyền vi sinh vật tại Khu Dự trữ Sinh quyển Cần Giờ, cung cấp luận cứ khoa học để UBND TP. Hồ Chí Minh và Ban Quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ xây dựng chính sách bảo tồn đa dạng sinh học gắn với khai thác bền vững tài nguyên sinh học.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Giới học thuật: Tiếp cận hệ phương pháp luận tích hợp giữa phân loại học phân tử 16S rDNA, sinh học hệ gen chức năng (PKS/NRPS) và hóa học phân tích GC-MS.
• Doanh nghiệp Dược phẩm & Công nghệ Sinh học: Tiếp nhận chủng giống vi sinh vật tiềm năng và dữ liệu phổ chất để tối ưu hóa quy trình lên men quy mô bioreactor, hướng tới thương mại hóa các hoạt chất sinh học tự nhiên.
• Ngành Thủy sản & Nông nghiệp: Thụ hưởng các giải pháp kiểm soát sinh học thay thế kháng sinh hóa học trong quản lý dịch bệnh do Vibrio parahaemolyticus trên tôm nước lợ.
• Cơ quan Quản lý Tài nguyên Môi trường: Có thêm bằng chứng thực nghiệm phục vụ công tác quản lý khu bảo tồn sinh quyển thế giới.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì?

Đó là việc chứng minh sự chiếm ưu thế tuyệt đối của hệ gen sinh tổng hợp peptide phi ribosome nrps (tỷ lệ 100%) so với hệ gen polyketide synthase pksI (50%) và sự vắng mặt hoàn toàn của pksII (0%) trong quần thể Streptomyces đất ngập mặn Cần Giờ, mở rộng lý thuyết tiến hóa mô-đun PKS/NRPS của Jenke-Kodama et al. (2006) trong điều kiện sinh thái biển nhiệt đới.

2. Phương pháp nghiên cứu có gì sáng tạo so với các nghiên cứu trước đây?

So với nghiên cứu của Passari et al. (2017) (chỉ tầm soát trên thực vật nội sinh) và Sun et al. (2015) (khảo sát mẫu hải miên biển Hoa Nam), luận án đã thiết lập quy trình tích hợp 4 bước liên hoàn: sàng lọc đối kháng in vitro 4 mầm bệnh mục tiêu -> phân loại phả hệ 16S rDNA -> tầm soát bộ ba gen chức năng (pksI, pksII, nrps) -> chiết xuất chọn lọc ethyl acetate và định danh cấu trúc hóa học bằng GC-MS trực tiếp từ mẫu đất ngập mặn tự nhiên.

3. Phát hiện bất ngờ nhất trong số liệu thực nghiệm là gì?

Sự hiện diện vượt trội của các phức hợp Siloxane mạch vòng và mạch thẳng (Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; Heptasiloxane, hexadecamethyl...) trong cao chiết của cả 2 chủng S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1. Các hợp chất này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn bền vững sau xử lý dung môi hữu cơ phân cực, mở ra hướng tiếp cận mới về vai trò của các hợp chất cơ-silic sinh học trong cơ chế tự vệ của vi khuẩn sợi biển.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập (replication protocol) đầy đủ không?

Hoàn toàn đầy đủ. Toàn bộ thông số thực nghiệm từ thành phần môi trường SCA, LB, MHA, nồng độ hóa chất tách chiết DNA bằng CTAB, trình tự mồi PCR, chu trình nhiệt độ khuếch đại gen, quy trình chiết xuất ethyl acetate đến chương trình nhiệt độ cột sắc ký GC-MS (80°C - 280°C) đều được chi tiết hóa trong các bảng danh mục của luận án, cho phép các phòng thí nghiệm độc lập tái lập chính xác.

5. Kế hoạch nghiên cứu 10 năm tới được phác thảo ra sao?

Lộ trình 10 năm định hướng: (1) Giai đoạn 1-3 năm: Giải mã toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing) của 2 chủng ưu tuyển và tinh sạch đơn chất bằng HPLC-NMR; (2) Giai đoạn 4-6 năm: Đánh giá cơ chế tác động phân tử, thử nghiệm độc tính in vivo và tối ưu hóa công nghệ lên men Pilot 100-500L; (3) Giai đoạn 7-10 năm: Đăng ký sáng chế hoạt chất mới và phát triển tiền lâm sàng thuốc kháng sinh sinh học.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS. Nguyễn Tuấn Hải đã đóng góp 6 giá trị khoa học và thực tiễn cốt lõi:

1. Xác lập bộ sưu tập 48 chủng vi khuẩn sợi bản địa từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ, phát hiện 10 chủng có hoạt tính đối kháng vi sinh vật gây bệnh.
2. Định danh chính xác bằng giải trình tự 16S rDNA và phân tích cây phả hệ 8 chủng Streptomyces kháng khuẩn mạnh thuộc các loài: S. tendae, S. celluloflavus, S. albogriseolus, S. parvulus, S. tanashiensis, S. africanus...
3. Khám phá 3 chủng siêu tiềm năng (S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1, S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S. parvulus ANTHOIDONG 3.1) ức chế đồng thời 4 tác nhân gây bệnh nguy hiểm (B. cereus, E. coli, V. parahaemolyticus, S. aureus).
4. Xác định quy luật di truyền sinh tổng hợp với 100% chủng mang gen nrps, 50% mang gen pksI, 0% mang gen pksII, và 50% chủng sở hữu đồng thời cả 2 gen nrps/pksI.
5. Chiết xuất thành công cao chiết ethyl acetate bền hoạt tính sinh học từ 2 chủng xuất sắc nhất, định danh 6-7 hợp chất sinh học tiêu biểu bằng GC-MS, đặc biệt là các dẫn xuất siloxane và phenolic kháng khuẩn.
6. Mở ra 3 hướng nghiên cứu ứng dụng đột phá: khai phá dược liệu biển chống kháng thuốc, phát triển chế phẩm sinh học bảo vệ nuôi trồng thủy sản, và cung cấp luận cứ bảo tồn nguồn gen vi sinh vật quý hiếm tại Khu Dự trữ Sinh quyển Thế giới Cần Giờ.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Vi sinh vật gây bệnh thường xuyên đe dọa sức khỏe người và động vật. Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra penicillin, một loại kháng sinh điều trị các bệnh nhiễm trùng, góp công vào nền y học. Kháng sinh là nhóm thuốc có tác dụng tiêu diệt trực tiếp hoặc làm chậm sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, giúp cho hệ miễn dịch của con người ức chế quá trình nhiễm khuẩn (Kohanski et al. Ngoài ra, những chất kháng sinh, kháng khuẩn còn được ứng dụng trong một số lĩnh vực khác như chăn nuôi, bảo quản thực phẩm, bảo vệ thực vật… (Ceylan et al.

Tuy nhiên, hiện nay đang có sự xuất hiện của các vi khuẩn gây bệnh đề kháng lại kháng sinh ngày càng nhiều. Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp sản xuất chất kháng sinh là: cải tiến các chất kháng sinh hiện có để tránh tình trạng kháng thuốc, đồng thời thúc đẩy nghiên cứu tìm ra các chất kháng sinh, kháng khuẩn mới (Xu et al. Trong số các vi sinh vật có khả năng tạo chất kháng sinh, vi khuẩn sợi (actinobacteria) hay còn gọi là xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng, với khoảng 80% các chất kháng sinh được phát hiện có nguồn gốc từ vi khuẩn sợi, đặc biệt là các loài thuộc chi Streptomyces (Berdy, 2005). Tuy nhiên, hiện nay việc phân lập các loài vi khuẩn sợi từ những nguồn đặc biệt khác (ngoài Streptomyces trong đất) để tìm kiếm kháng sinh mới là rất cần thiết (Sirisha et al.

Trong xu hướng này, những loài vi khuẩn sợi phân lập từ các nguồn gốc biển được quan tâm nhiều hơn do khả năng sản sinh các hợp chất thứ cấp (secondary metabolites) với nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như chất kháng khuẩn, kháng nấm, hợp chất ngăn ngừa ung thư, ức chế khối u (Xu et al. Rừng ngập mặn là một tập hợp các loài cây nhiệt đới, cận nhiệt đới và cây bụi thích nghi với vùng khắc nghiệt giữa biển và đất liền (Ottoni et al. Các hệ sinh thái ở rừng ngập mặn bị ngập nước theo thủy triều, do đó, biến động về hàm lượng muối và chất dinh dưỡng trong đất. Dựa vào cơ chế điều tiết muối, thực vật rừng ngập mặn được chia thành hai nhóm: nhóm một là những cây có tuyến muối (secretor) hoặc lông muối trên lá, giúp bài tiết lượng muối dư thừa; nhóm hai là những cây không có lá mang tuyến muối, sẽ tích lũy muối vào vỏ cây hoặc tế bào thịt lá và sẽ được thải ra ngoài khi lá rụng hay khi tróc vỏ (Miththapala, 2008; Spelchan et al.

Sự đa dạng về hệ động-thực vật cùng với các lợi ích của rừng ngập mặn được ghi nhận trong nhiều tài liệu (Thatoi và Biswal, 2008; Miththapala, 2008). Rừng ngập mặn có chức năng điều tiết lũ, hấp thu các chất ô nhiễm, tăng tính ổn định cho các vùng duyên hải. Nguồn carbon dồi dào từ xác bã động-thực vật ở đây khiến cho rừng ngập 1 mặn trở thành nơi trú ngụ lý tưởng cho các quần xã vi sinh vật phát triển (Miththapala, 2008). Khu vực miền đông nam bộ Việt Nam có rừng ngập mặn huyện Cần Giờ (rừng Sác - Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ) thuộc thành phố Hồ Chí Minh, là một hệ sinh thái trung gian giữa hệ sinh thái thủy vực với trên cạn, giữa nước ngọt và nước mặn, có các quần xã động-thực vật và vi sinh vật rất phong phú (Ban Quản lý Rừng phòng hộ huyện Cần Giờ, 2021).

Căn cứ vào sự tương đồng với các vùng ngập mặn khác trên thế giới, rừng ngập mặn Cần Giờ có thể mang lại những ích lợi không nhỏ từ vi khuẩn sợi. Thời gian qua, Việt Nam có nhiều nghiên cứu về tiềm năng kháng khuẩn của các loài vi sinh vật khác nhau. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi sinh vật rừng ngập mặn Cần Giờ nói riêng vẫn còn rải rác trên nhiều đối tượng như: vi khuẩn cố định đạm (Đinh Thúy Hằng và Trần Triết, 2009); vi khuẩn liên kết thực vật và vi khuẩn sống trong đất vùng rễ cây rừng ngập mặn ở Cà Mau (Hồ Thanh Tâm và ctv., 2016-2017); vi sinh vật ở vùng ven biển Hải Phòng (Đỗ Mạnh Hào và Phạm Thiên Thư, 2010); vi khuẩn sinh tổng hợp polyhydroxyalkanoates từ rừng ngập mặn Quảng Ninh (Đoàn Văn Thược và Nguyễn Thị Bình, 2012). Từ đây đặt ra nhu cầu nghiên cứu các loài vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn, bổ sung nguồn tiềm năng để thu nhận các chất thứ cấp, đặc biệt là kháng sinh mới để ức chế vi khuẩn gây bệnh hiệu quả hơn (Dương Văn Hợp và ctv.2 Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ chí Minh có khả năng tổng hợp các chất ức chế vi khuẩn gây bệnh cho con người.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng là các vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn có khả năng tạo kháng sinh.

Nghiên cứu được giới hạn trong các mẫu đất rừng ngập mặn thuộc 6 đơn vị hành chính cấp xã của huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh, thu thập trong thời gian từ tháng 02 đến tháng 4 năm 2019.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thu mẫu và tiến hành phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi có khả năng tổng hợp kháng sinh được thực hiện từ tháng 02 năm 2019 đến tháng 10 năm 2020. Sau đó định danh vi khuẩn sợi từ tháng 11 năm 2020 đến tháng 4 năm 2021. Các nghiên cứu vi sinh vật được tiến hành tại các phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường, Sinh học phân tử thuộc Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm, trường Đại học Cần Thơ. Một số phân tích GC-MS và hóa học chuyên sâu khác được thực hiện bởi Bộ môn Khoa Học Môi Trường, khoa Môi Trường và Tài Nguyên Thiên Nhiên, Đại Học Cần Thơ.

Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu bao gồm các nội dung: - Thu thập mẫu đất rừng ngập mặn Cần Giờ, phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh. - Nhận diện các dòng vi khuẩn sợi bằng kỹ thuật khuếch đại và giải trình tự đoạn gen 16S rDNA, với cặp mồi đặc hiệu S-C-Act-0235-a-S-20 và S-C-Act-0878-a-A-19 (Sun et al., 2015), so sánh trình tự thu được với cơ sở dữ liệu trực tuyến trên GenBank và đề xuất tên phân loại vi khuẩn sợi đồng thời xây dựng giản đồ phân nhóm di truyền bằng phần mềm MEGA. - Thu nhận hoạt chất kháng vi khuẩn gây bệnh, kiểm tra hoạt tính và phân tích thành phần hóa chất theo các phương pháp phân tích phổ sử dụng máy sắc ký ghép khối phổ (GC-MS). Đóng góp mới của luận án Đã phân lập được 48 chủng vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, trong đó, có 10 chủng kháng lại ít nhất một trong bốn loài vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm là Bacillus cereus (8 chủng), E.

Mười chủng vi khuẩn sợi này được tuyển chọn và định danh ghi nhận được 8 dòng đều thuộc chi Streptomyces họ Streptometaceae, bộ Actinomycetales, lớp Actinobacteria, ngành Actinobacteria; với 8 loài khác nhau: Streptomyces tendae, S. Tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các chất có hoạt tính sinh học trong 8 dòng vi khuẩn sợi được ghi nhận có sự khác nhau, bao gồm pksI là 50%, pksII là 0% và nrps là 100%. Đã chọn được hai dòng VKS tiềm năng nhất có khả năng kháng khuẩn cao là S. Sáu hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu được sản xuất từ S.1 được xác định, gồm có: Cyclohexasiloxane, dodecaethyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; dẫn xuất 3TMS của acid 2,6- dihydroxybenzoic; Heptasiloxane, hexadecamethyl; Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-Hexadec; và Tetracosamethyl, cyclododecasiloxane.1, 11 hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu được xác định bao gồm: 2-pentanone, 4- hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; Cyclododecane; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; Benzoic acid, 2- hydroxy-, 1-methylethyl ester; 1-Hexadecene; và Heptasiloxane, hexadecamethyl.

Đất rừng ngập mặn Cần Giờ với vi khuẩn sợi là nguồn chất kháng khuẩn tiềm năng nhưng chưa được quan tâm nhiều. Đây là đối tượng mới khi nghiên cứu về vi sinh vật bản địa; là công trình nghiên cứu đầu tiên về tính trạng kháng khuẩn và gen chỉ thị kháng 3 sinh của vi khuẩn sợi trong đất ở rừng ngập mặn huyện Cần Giờ. Đồng thời, chất kháng vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn sợi phân lập từ đây góp phần bổ sung nguồn dược liệu có thể khai thác trong tương lai. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án Ý nghĩa khoa học của nghiên cứu này nhằm phân lập và chọn lọc vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh có đặc tính tổng hợp được kháng sinh.

Kết quả của luận án góp phần làm phong phú tư liệu vi sinh vật học của rừng ngập mặn Việt Nam nói riêng và vùng Đông Nam Á nói chung về thành phần loài và các lợi ích. Trong đó, có những loài mang ý nghĩa kinh tế - xã hội, góp phần trong công cuộc tìm kiếm kháng sinh mới. Ý nghĩa thực tiễn là những vi khuẩn sợi ức chế được nhiều loài vi khuẩn gây hại có thể sẽ là nguồn sản xuất chất kháng sinh, khắc phục hiện tượng kháng thuốc, làm phong phú nguồn dược liệu Việt Nam. Hơn nữa, giá trị của các vi khuẩn sợi như vậy càng khẳng định vai trò của rừng ngập mặn trong hệ sinh thái toàn cầu.

Riêng đối với rừng ngập mặn Cần Giờ, thể hiện được sự tươngst đồng về các loài vi khuẩn sợi và thành phần hoạt chất so với các vùng ngập mặn khác trong khu vực và trên thế giới. 4 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về rừng ngập mặn 2.1 Khái niệm và phân loại rừng ngập mặn Rừng ngập mặn là một dạng rừng quan trọng phát triển trên vùng đất ngập nước dọc theo các bờ biển ở những khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới (Spelchan và Nicoll, 2014, Ottoni et al. Rừng ngập mặn trên thế giới phân bố chủ yếu ở Châu Á (42%), Châu Phi (20%), Bắc và Trung Mỹ (15%), Châu Đại Dương (12%) và Nam Mỹ (11%); tỷ lệ bao phủ khoảng 60% –75% vùng nhiệt đới toàn cầu và các đường bờ biển cận nhiệt đới (Giri et al. Cây rừng ngập mặn chủ yếu là những loài cây thân gỗ, có hạt và một số cây bụi.

Trên thế giới có gần 70 loài cây rừng ngập mặn với chiều cao thay đổi từ 1,5 m đến 50 m. Những chi thực vật thường thấy trong rừng ngập mặn là chi Đước (Rhizophora), chi Mắm (Avicennia), chi Bần (Sonneratia), chi Vẹt (Bruguiera) (Miththapala, 2008).